Генетика, 2021, T. 57, № 4, стр. 403-411

Изучение полиморфизма генов семейства ipiO оомицета Phytophthora infestans (Mont.) de Bary в популяции Московской области при помощи SSCP-анализа

В. В. Мартынов 12*, В. К. Чижик 2

1 Московский государственный областной университет
141014 Московская область, Мытищи, Россия

2 Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии
127550 Москва, Россия

* E-mail: martynov.vik@gmail.com

Поступила в редакцию 18.05.2020
После доработки 01.07.2020
Принята к публикации 08.07.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Изучен полиморфизм первичной структуры генов семейства ipiO в популяции Phytophthora infestans в Московской области. В качестве метода оценки полиморфизма использовали SSCP-анализ. В результате при помощи этого метода удалось различить классы генов семейства ipiO и установить, что изучаемые образцы имели один из трех вариантов генотипа ipiO в зависимости от комбинации у них генов этих классов. Выявленные генотипы оказались распределены в проанализированной популяции P. infestans Московской области с неодинаковой частотой. Кроме того, было показано, что картофельная и томатная субпопуляции P. infestans также различаются по частотам встречаемости выявленных генотипов.

Ключевые слова: популяция, полиморфизм, гены вирулентности, Phytophthora infestans, SSCP-анализ.

Фитофтороз относится к числу наиболее вредоносных заболеваний картофеля и томатов. Его возбудителем является оомицет Phytophthora infestans (Mont.) de Bary. Чтобы инфицировать растительные клетки, P. infestans секретирует так называемые эффекторные белки. Основная роль этих эффекторных белков заключается в подавлении базальной защитной реакции хозяина, что позволяет патогену развиваться в тканях растения. Однако эффекторные белки могут распознаваться R-белками растения-хозяина, которые взаимодействуют с эффекторами согласно модели ген–на–ген, в результате этого взаимодействия развивается гиперчувствительный ответ и растение сохраняет устойчивость к патогену. Таким образом, эффекторы действуют как факторы вирулентности/авирулентности. Эффекторные белки в геноме P. infestans кодируются генами вирулентности (Avr-генами), а R-белки растения – генами устойчивости (R-генами). “Гонка вооружений” между патогеном и хозяином и их коэволюция привели к возникновению значительного полиморфизма генов Avr. За последнее время в геноме P. infestans было обнаружено множество генов вирулентности, кодирующих белки, принадлежащие к семейству RXLR-dEER эффекторов [1]. К числу таких генов относятся гены семейства ipiO. Это семейство является очень полиморфным. Так у P. infestans было выявлено 13 вариантов последовательностей гена ipiO, которые на основании различий в их первичной структуре были разделены на три класса (I, II и III) [2]. Наиболее полиморфным является класс I, который включает в себя 10 вариантов, класс II содержит два варианта, а класс III представлен всего одним вариантом ipiO4 [2]. Варианты гена ipiO, относящиеся к классу I, распознаются соответствующим геном устойчивости растения (ген Rpi-blb1), т.е. в функциональном отношении являются авирулентными [2, 3], в то время как продукт гена ipiO4 (класс III) избегает распознавания, и таким образом этот вариант является вирулентным [4, 5]. Кроме того, было показано, что изоляты, у которых отсутствуют варианты класса I, являются вирулентными на растениях, имеющих ген Rpi-blb1, а вариант ipiO4 не только сам избегает распознавания, но и подавляет гиперчувствительный ответ, возникающий в результате распознавания генов ipiO класса I продуктом гена Rpi-blb1 [3, 6]. Варианты, относящиеся к классу II, в функциональном отношении проявляют себя неоднозначно. Было показано, что такие варианты вызывают гиперчувствительный ответ при агробактериальной коинфильтрации с геном Rpi-blb1, но в естественных условиях штаммы P. infestans, содержащие только варианты генов ipiO класса II, не вызывают гиперчувствительного ответа у растений, имеющих в своем геноме ген Rpi-blb1. Из приведенных выше данных видно, что полиморфизм генов семейства ipiO тесно связан с их функцией, и набор этих генов у штаммов P. infestans может оказывать влияние на вирулентность и агрессивность этих штаммов. Поэтому изучение полиморфизма генов семейства ipiO является важным не только с научной, но и с практической точки зрения, так как сведения об этом полиморфизме будут способствовать более эффективной борьбе с фитофторозом. Однако полиморфизм генов этого семейства был изучен лишь на небольшой коллекции европейских изолятов [2, 7], а также у изолятов, собранных на территории Центральной и Северной Америки и Юго-Восточной Азии [4], а для российских популяций P. infestans такие исследования не проводились. Поэтому цель настоящей работы – изучение полиморфизма первичной структуры генов семейства ipiO в популяции P. infestans в Московской области.

Изучение генетического полиморфизма можно проводить различными способами. Одним из таких способов является SSCP-метод, основанный на анализе одноцепочечного конформационного полиморфизма (single-strand conformation polymorphism). Этот простой метод анализа позволяет определить являются ли фрагменты ДНК идентичными по своей нуклеотидной последовательности, не прибегая к их секвенированию [8, 9]. Метод SSCP-анализа был применен нами для изучения структурного полиморфизма генов семейства ipiO в популяции P. infestans в Московской области.

Таблица 1.

Частоты выявленных генотипов ipiO в разных точках сбора у образцов P. infestans, собранных с растений картофеля

Классы гена ipiO Доля образцов (%) с выявленными генотипами
точка 1 точка 2 точка 3 точка 4 точка 5
Класс I 100 50 100 100 33
Классы I и II 0 20 0 0 67
Класс II 0 30 0 0 0

Примечание. Точка 1 – п. Коренево, поле ВНИИКХ; точка 2 – п. Коренево, частный сектор; точка 3 – д. Масловка; точка 4 – п. Поляны; точка 5 – п. Лесное.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве материала P. infestans использовали пораженные фитофторозом листья растений картофеля, собранные летом 2015 г. на территории четырех районов Московской области (Люберецкий, Чеховский, Коломенский и Озерский), и пораженные фитофторозом листья растений томатов, собранные в то же время и в тех же точках на территории Коломенского, Озерского и Чеховского районов (рис. 1). В общей сложности было пять точек сбора, в трех из которых образцы были собраны как с растений картофеля, так и с растений томатов. Каждый образец собран с индивидуального растения. Они находились друг от друга на расстоянии примерно 10 м. Всего было собрано и затем проанализировано 37 образцов пораженных растений картофеля (семь из точки 1, десять из точки 2, десять из точки 3, четыре из точки 4 и шесть из точки 5) и 10 образцов пораженных растений томатов (четыре из точки 3, два из точки 4 и четыре из точки 5). Таким образом, в общей сложности было собрано и проанализировано 47 образцов. Чтобы подтвердить, что растение поражено именно фитофторозом, для экспресс-определения P. infestans в полевых условиях использовали тест-набор производства фирмы ООО “Генконтроль”. Собранные листья высушивали и хранили в виде гербария для последующего выделения из них препарата тотальной ДНК. Пригодность гербарных образцов для выделения из них ДНК P. infestans известна из литературы [10].

Рис. 1.

Карта-схема мест сбора образцов в Московской области. Точка 1 – п. Коренево, поле ВНИИКХ; точка 2 – п. Коренево, частный сектор; точка 3 – д. Масловка; точка 4 – п. Поляны; точка 5 – п. Лесное.

Выделение ДНК

Тотальную ДНК выделяли из гербарных образцов при помощи набора реагентов “SILICA plant” производства ООО компании “Биоком” по протоколу фирмы-производителя. Для выделения тотальной ДНК брали фрагмент высушенного листа растения площадью примерно 1 см2.

Условия ПЦР

Поскольку семейство генов ipiO является высокополиморфным, а функциональные различия наблюдаются только между отдельными классами, для амплификации генов этого семейства в препаратах тотальной ДНК нами были подобраны праймеры на участки последовательностей генов ipiO, консервативные для всех трех классов. Кроме того, поскольку класс III этого семейства генов представлен только одним геном ipiO4, нуклеотидная последовательность которого достаточно сильно отличается от последовательностей других генов этого семейства, нами был сконструирован обратный праймер для специфичной амплификации именно этого варианта гена. Таким образом, ПЦР-амплификацию проводили с консервативными праймерами IPIOF 5‑CATCCAAGATTCGCTTTCTGTCT-3 и IPIOR 5-GCTTATCGGCGTCTCTCCGG-3, а для специфичной амплификации гена ipiO4 вместо праймера IPIOR использовали праймер IPIO4R 5-GGATGCTTGTTCTTGTAGCTAGC-3. Программа амплификации для обеих реакций была следующей: 94°С, 3 мин; 35 циклов (94°С, 30 с; 63°С, 30 с; 72°С, 1 мин), финальный синтез 72°С, 5 мин. Объем реакционной смеси составлял 25 мкл. На одну реакцию брали 50 нг тотальной ДНК. Для амплификации использовали прибор GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems, Inc., США). Электрофоретическое разделение продуктов амплификации проводили в 1%-ном агарозном геле в 0.5× TBE-буфере.

SSCP-анализ

Для изучения полиморфизма генов ipiO применяли SSCP-анализ. SSCP (single-strand conformational polymorphism) анализ представляет собой метод, основанный на способности одноцепочечных молекул ДНК образовывать уникальные вторичные структуры, конформации которых зависят от их нуклеотидной последовательности. Замены в нуклеотидной последовательности изменяют вторичную структуру молекулы, что приводит к изменению ее подвижности в неденатурирующем полиакриламидном геле (ПААГ). Такие изменения в электрофоретической подвижности указывают на полиморфизм последовательности ДНК. При помощи SSCP-анализа можно обнаружить одиночные нуклеотидные замены в относительно коротких последовательностях (ампликонах), и этот способ широко используется для решения различных задач, связанных с выявлением полиморфизма первичной структуры ДНК, в том числе в фитопатологических исследованиях [1114]. Для перевода ДНК в одноцепочечное состояние используют термическую и химическую денатурацию, после чего проводят разделение в ПААГ. В настоящем исследовании протокол анализа был следующим: к 1.5–4 мкл ПЦР-продукта добавляли семь объемов денатурирующего буфера (95% формамида, 0.05% бромфенолового синего, 0.05% ксилен цианола, 20 мM ЭДТА) и инкубировали в течение 10 мин при температуре 95°С. Затем образцы немедленно помещали в лед и наносили на 8%-ный ПААГ (40 : 1 акриламид : бис-акриламид). Электрофоретическое разделение проводили в 0.5× TBE-буфере при температуре 4°С и напряжении 200 В в течение 4.5 ч. Детекцию результатов электрофореза проводили путем окрашивания геля красителем SYBR Green I с последующей визуализацией в ультрафиолете.

Клонирование и секвенирование

Для определения нуклеотидных последовательностей зон электрофоретической подвижности, обнаруженных по результатам SSCP-анализа, эти зоны вырезали из геля, элюировали TE-буфером, клонировали в вектор pAL-TA (Евроген) по протоколу фирмы-производителя, которым трансформировали компетентные клетки E. coli штамма DH5α, и секвенировали по пять клонов для каждого образца (по методу Сэнгера с помощью набора реактивов Big Dye Terminator v. 3.1 (Applied Biosystems, Inc.) на автоматическом секвенаторе ABI PRIZM 3730 (Applied Biosystems, Inc.)) согласно инструкциям производителя. Надежность прочтения при секвенировании подтверждали тем, что каждый клон секвенировали в двух повторностях с прямого и обратного праймеров, и полученные таким образом сиквенсы для каждого клона были идентичны по нуклеотидной последовательности. В общей сложности было получено десять нуклеотидных последовательностей десяти клонов (по пять клонов для каждой из двух зон электрофоретической подвижности).

Математическая обработка данных

Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей осуществляли при помощи программы Clustal Omega, доступной на сервере http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/, с последующим анализом результатов этого выравнивания при помощи программы GeneDoc. Производные аминокислотные последовательности были получены с помощью программы EditSeq. Для построения дендрограммы использовали метод минимальной эволюции в программе MEGA 6.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В результате ПЦР-амплификации препаратов тотальной ДНК 47 образцов с праймерами, специфичными по отношению к консервативным участкам генов семейства ipiO P. infestans, во всех образцах был получен продукт ожидаемой длины – 266 пн. SSCP-анализ полученных ампликонов показал, что в исследуемой популяции полиморфизм генов семейства ipiO представлен двумя зонами электрофоретической подвижности – “нижней” и “верхней”, и эти две зоны дают три варианта генотипа-паттерна (рис. 2). Клонирование и секвенирование этих зон показало, что они действительно являются структурными гомологами гена ipiO. Эти нуклеотидные последовательности были зарегистрированы нами в базе данных GeneBank NCBI под номерами MH450292 и MH450293 соответственно. Мы сравнили полученные последовательности с известными вариантами гена ipiO, относящимися к трем классам семейства этого гена. Результаты сравнения представлены в виде дендрограммы (рис. 3). На этой дендрограмме видно, что полученная нами последовательность нижней зоны относится к классу I гена ipiO и наиболее гомологична варианту ipiO6, с которым она образует общий кластер, в то время как последовательность верхней зоны образует общий кластер с вариантами ipiO3 и ipiO13, которые принадлежат к классу II. Таким образом, выявляемые с помощью SSCP-анализа три варианта генотипов можно охарактеризовать так: содержащий только гены ipiO класса I (паттерн 1); содержащий гены ipiO класса I и класса II (паттерн 2); содержащий только гены ipiO класса II (паттерн 3). Вариант гена ipiO4, который является единственным представителем класса III, в нашем исследовании обнаружен не был.

Рис. 2.

Полиморфизм генов семейства ipiO, выявляемый при помощи SSCP-анализа. М – маркер молекулярной массы; 1, 2, 3 – выявляемые электрофоретические паттерны генов ipiO; I и II – зоны, соответствующие классу I и классу II генов ipiO соответственно.

Рис. 3.

Дендрограмма нуклеотидных последовательностей генов семейства ipiO. I, II, III – классы семейства ipiO; MH450292 и MH450293 – регистрационные номера последовательностей “нижней” и “верхней” зон соответственно, в базе данных NCBI; IPIO1–IPIO11, IPIO13 – известные варианты генов ipiO, зарегистрированные в базе данных NCBI под номерами PHTIPI01D, PHTIPI02C, GQ371190, GQ371191, GQ371192, GQ371193, GQ371194, GQ371195, GQ371196, GQ371197, GQ371198, GQ371200 соответственно.

Вышеуказанные генотипы распределены в проанализированной популяции P. infestans Московской области с неодинаковой частотой. Так, наиболее часто встречающимся оказался генотип, содержащий только гены ipiO класса I. Он был обнаружен у 60% образцов (28 образцов). Вторым по распространенности оказался генотип, содержащий гены ipiO класса I и класса II. Этот генотип имели 23% образцов (11 образцов). Наиболее редким был генотип, содержащий только гены ipiO класса II, он был выявлен у 17% образцов (восемь образцов).

При этом встречаемость данных генотипов в разных точках сбора отличалась от общей для популяции и существенно различалась у образцов, собранных с растений картофеля, и образцов, собранных с томатов. Так, в случае образцов, полученных с растений картофеля (табл. 1), все образцы из точек 1, 3 и 4 (п. Коренево, поле ВНИИКХ; д. Масловка; п. Поляны) имели одинаковый генотип, содержащий только гены ipiO класса I. Образцы из точки 2 (п. Коренево, частный сектор) были представлены всеми тремя генотипами, при этом частота генотипа, содержащего только гены ipiO класса I, была немного ниже средней по популяции, а частота генотипа, содержащего только гены ipiO класса II, почти в 2 раза превышала частоту этого варианта для всей популяции. Образцы из точки 5 (п. Лесное) были представлены двумя генотипами – содержащим только гены ipiO класса I и содержащим гены ipiO класса I и класса II. В этой точке частота встречаемости генотипа, содержащего гены ipiO класса I и класса II, почти в 3 раза превышала среднюю по популяции, а частота генотипа, содержащего только гены ipiO класса I, напротив была в 2 раза ниже средней по популяции. Также было проанализировано распределение этих генотипов в каждой из трех точек сбора образцов с растений томатов. Результаты этого анализа приведены в табл. 2. Все образцы из точки 4 (п. Поляны) были представлены генотипом, содержащим только гены ipiO класса II. У образцов, собранных в точке 3 (д. Масловка), генотип, содержащий гены ipiO класса I и класса II, и генотип, содержащий только гены ipiO класса II, были представлены поровну, а генотип, содержащий только гены ipiO класса I, обнаружен не был. Среди образцов, собранных в точке 5 (п. Лесное), преобладали образцы с генотипом, содержащим гены ipiO класса I и класса II. Генотип, содержащий только гены ipiO класса II, встречался значительно реже, а генотип, содержащий только гены ipiO класса I, также не был обнаружен в этой точке сбора.

Таким образом, было установлено, что картофельная и томатная популяции P. infestans существенно различаются по частотам выявленных генотипов ipiO (табл. 3). Главным, обращающим на себя внимание, различием является то, что ни у одного из образцов P. infestans, собранных на томатах, не был обнаружен генотип, содержащий только гены ipiO класса I, который наиболее распространен среди образцов, полученных с картофеля. И наоборот, самый редкий у картофельных образцов генотип, содержащий только гены ipiO класса II, у образцов, полученных с растений томатов, встречался в 50% случаев, а другие 50% образцов были представлены генотипом, содержащим гены ipiO класса I и класса II, который у картофельных образцов также встречается достаточно редко.

Таблица 2.

Частоты выявленных генотипов ipiO в разных точках сбора у образцов P. infestans, собранных с растений томатов

Классы гена ipiO Доля образцов (%) с выявленными генотипами
точка 3 точка 4 точка 5
Класс I 0 0 0
Классы I и II 50 0 75
Класс II 50 100 25

Примечание. Точка 3 – д. Масловка; точка 4 – п. Поляны; точка 5 – п. Лесное.

Таблица 3.

Различия в частотах выявленных генотипов ipiO у образцов P. infestans, собранных с растений картофеля и растений томатов

Классы гена ipiO Доля образцов (%) с выявленными генотипами
Класс I 76 0
Классы I и II 16 50
Класс II 8 50

ОБСУЖДЕНИЕ

При помощи метода SSCP-анализа нам удалось изучить полиморфизм генов семейства ipiО оомицета P. infestans в популяции этого патогена в Московской области. Для этого с использованием специфичных праймеров для ПЦР-амплификации генов данного семейства мы проанализировали 47 образцов тотальной ДНК полевых образцов P. infestans, собранных на территории Московской области. В результате SSCP-анализа полученных ампликонов были выявлены две зоны электрофоретической подвижности, которые в разных комбинациях образуют три паттерна, характеризующих полиморфизм генов семейства ipiО у изученных образцов. Метод SSCP-анализа достаточно широко применяется для изучения генетического полиморфизма [15], в том числе и у патогенов [1114], однако ни в одном из известных исследований их авторы не пытались установить молекулярную природу наблюдаемого полиморфизма. В своем исследовании мы отсеквенировали каждую из двух наблюдаемых зон электрофоретической подвижности и установили, что нуклеотидные последовательности этих зон различаются между собой и соответствуют последовательностям генов ipiО, принадлежащих двум разным классам этого семейства. Таким образом, мы установили, что наблюдаемый электрофоретический полиморфизм не является артефактным, а действительно обусловлен различиями в нуклеотидных последовательностях образующих его зон, причем эти различия соответствуют структурным особенностям генов ipiO класса I и класса II. Поэтому в дальнейшем при оценке полиморфизма генов семейства ipiO выявленные паттерны мы рассматривали как генотипы, содержащие варианты генов ipiO класса I и класса II, и оценивали частоты их встречаемости среди образцов изучаемой популяции.

Преобладание в популяции P. infestans Московской области генотипов, содержащих гены ipiО класса I, согласуется с литературными данными, полученными для других популяций. Так, в работе Vleeshouwers et al. [16] есть указание на то, что гены ipiО класса I широко распространены в большинстве европейских и североамериканских популяций P. infestans, хотя точные данные о процентном соотношении генов ipiО разных классов в этой работе не приводятся. Кроме того, другими авторами была отмечена редкая встречаемость гена ipiО4 класса III [4], который в нашем исследовании вообще обнаружен не был.

Такое преобладание генов ipiО класса I можно объяснить тем, что в то время как большинство генов устойчивости картофеля к фитофторозу были интрогрессированы в культурные сорта из дикорастущего вида Solanum demissum [17], ген Rpi-blb1, распознающий именно варианты гена ipiO класса I, был интрогрессирован из другого дикого вида S. bulbocastanum [18, 19], который был включен в селекционные программы сравнительно недавно, и поэтому этот ген устойчивости еще редко встречается в возделываемых в России сортах картофеля. Как следствие, в отличие от большинства других известных генов вирулентности P. infestans, представленных в популяциях этого патогена вирулентными формами, ген ipiO представлен в основном своими авирулентными вариантами, образующими самый многочисленный класс I этого семейства генов. Поэтому на основе полученных данных можно сделать вывод о том, что широкое внедрение в практику сельского хозяйства сортов картофеля, содержащих в своем геноме ген устойчивости Rpi-blb1, является перспективным подходом в борьбе с фитофторозом, так как большинство изолятов P. infestans имеют в своем геноме варианты гена ipiO, распознаваемые этим геном устойчивости.

В то же время все три выявленные варианты генотипа ipiO имели неодинаковую распространенность в исследованной популяции P. infestans. Эти генотипы были представлены в точках сбора в разных процентных соотношениях (табл. 1). Такое распределение можно объяснить тем, что источником распространения инфекции P. infestans являются клубни, а также растительные остатки в почве, кучи выбракованных клубней, перезимовавшие в почве ооспоры и близость посадок картофеля к томатам. Кроме того, в Московской области возделывается картофель, привезенный из разных нецентрализованных источников. Таким образом, подмосковные популяции возбудителя фитофтороза представлены множеством клонов и отличаются высоким разнообразием [20]. Кроме того, генотип растения-хозяина также является фактором отбора для патогена. И даже в том случае если растение-хозяин имеет другие гены устойчивости, не отвечающие за распознавание эффектора ipiO, то они могут косвенно влиять на отбор тех или иных вариантов гена ipiO, которые в геноме P. infestans могут быть сцеплены с вирулентными формами других Avr-генов. Поэтому, например, в точке 2, расположенной в частном секторе п. Коренево, могло выращиваться много различных сортов, на которых паразитировала P. infestans, содержащая все три варианта генотипа ipiO, в то время как в точке 1, находящейся в поле ВНИИКХ, скорее всего, возделывался один сорт, и все образцы из этой точки имели один вариант генотипа, содержащий только гены ipiO класса I.

Также мы выявили различия в частотах встречаемости вариантов генотипа ipiO между картофельной и томатной субпопуляциями P. infestans в Московской области (табл. 3). У “томатных” образцов полностью отсутствует вариант генотипа, содержащий только гены ipiO класса I, а у “картофельных” образцов в четырех из пяти точек сбора отсутствует вариант генотипа, содержащий только гены ipiO класса II (табл. 1 и 2). Различия в частотах проявляются даже в одной точке сбора. Наиболее ярко выраженное различие наблюдается в точке 4, где все “картофельные” образцы имеют вариант генотипа, содержащий только гены ipiO класса I, а все “томатные” образцы – вариант генотипа, содержащий только гены ipiO класса II (табл. 1 и 2). В отличие от картофеля молекулярная генетика устойчивости к фитофторозу у томата изучена довольно слабо. Так, у томата картировано шесть генов устойчивости к фитофторозу, интрогрессированных в культурные формы из дикорастущего вида S. pimpinellifolium, и из этих шести генов нуклеотидная последовательность известна только для одного гена Ph-3 [21]. При этом известно, что близкие структурные гомологи некоторых генов устойчивости к фитофторозу картофеля у томата выполняют другие функции. В частности, гомолог гена R3a картофеля ген I2 у томата отвечает за устойчивость к Fusarium oxysporum [22, 23], а гомолог гена Rpi-blb2 картофеля ген Mi-1 у томата придает устойчивость к нематодам, тле и белокрылке [24]. В связи с таким положением дел ничего не известно и о собственно “томатных” эффекторах P. infestans, кодирующих их генах вирулентности и полиморфизме этих генов. В то же время было показано, что томатная и картофельная популяции P. infestans различаются между собой по ряду признаков, таких как соотношение типов спаривания, расовый состав, устойчивость к металаксилу, спектры изоферментов пептидазы, гаплотипы митохондриальной ДНК, профиль SSR-маркеров [2528]. Мы в своем исследовании впервые установили, что картофельная и томатная субпопуляции P. infestans различаются на молекулярном уровне также и по составу Avr-генов. Возможно, на томате у P. infestans отбор идет по каким-то генам, которые сцеплены с определенными вариантами генов ipiO. Молекулярно-генетический аспект взаимодействия P. infestans с растением-хозяином в случае томата требует дальнейших исследований.

Таким образом, в настоящей работе впервые выполнено популяционно-генетическое изучение полиморфизма генов семейства ipiO P. infestans на молекулярном уровне при помощи метода SSCР- анализа. Была показана применимость этого метода для указанной цели и выявлены территориальные особенности распределения полиморфизма генов семейства ipiO в популяции P. infestans в Московской области, а также связь наблюдаемого полиморфизма с видом растения-хозяина.

Работа выполнена при финансовой поддержке Комплексного плана научных исследований “Развитие селекции и семеноводства картофеля”.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют об отсутствии у них конфликта интересов.

Список литературы

  1. Haas B.J., Kamoun S., Zody M.C. et al. Genome sequence and analysis of the Irish potato famine pathogen Phytophthora infestans // Nature. 2009. V. 461. № 7262. P. 393–398. https://doi.org/10.1038/nature08358

  2. Champouret N., Bouwmeester K., Rietman H. et al. Phytophthora infestans isolates lacking class I ipiO variants are virulent on Rpi-blb1 potato // Mol. Plant-Microbe Interactions. 2009. V. 22. № 12. P. 1535–1545. https://doi.org/10.1094/MPMI-22-12-1535

  3. Chen Y., Liu Z., Halterman D.A. Molecular determinants of resistance activation and suppression by Phytophthora infestans effector IPI-O // PLoS Pathogens. 2012. V. 8. № 3. P. e1002595. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1002595

  4. Halterman D.A., Chen Y., Sopee J. Competition between Phytophthora infestans effectors leads to increased aggressiveness on plants containing broad-spectrum late blight resistance // PLoS One. 2010. V. 5. № 5. P. e10536. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010536

  5. Chen Y., Halterman D.A. Determination of virulence contribution from Phytophthora infestans effector IPI-O4 in a resistant potato host containing the RB gene // Physiol. and Mol. Plant Pathol. 2017. № 100. P. 30–34. https://doi.org/10.1016/j.pmpp.2017.05.006

  6. Chen Y., Halterman D.A. Phytophthora infestans effectors IPI-O1 and IPI-O4 each contribute to pathogen virulence // Phytopathology. 2017. V. 107. № 5. P. 600–606. https://doi.org/10.1094/PHYTO-06-16-0240-R

  7. Thilliez G.J., Armstrong M.R., Lim T.Y. et al. Pathogen enrichment sequencing (PenSeq) enables population genomic studies in oomycetes // New Phytologist. 2019. V. 221. № 3. P. 1634–1648. https://doi.org/10.1111/nph.15441

  8. Kakavas V.K., Plageras P., Vlachos T.A. PCR–SSCP: A method for the molecular analysis of genetic diseases // Mol. Biotechnol. 2008. V. 38. № 2. P. 155–163. https://doi.org/10.1007/s12033-007-9006-7

  9. Sunnucks P., Wilson A.C.C., Beheregaray L.B. et al. SSCP is not so difficult: the application and utility of single-stranded conformation polymorphism in evolutionary biology and molecular ecology // Mol. Ecol. 2000. V. 9. № 11. P. 1699–1710.

  10. Ristaino J.B., Groves C.T., Parra G.R. PCR amplification of the Irish potato famine pathogen from historic specimens // Nature. 2001. V. 411. № 6838. P. 695–697. https://doi.org/10.1038/35079606

  11. Nahiyan A.S.M., Boyer L.R., Jeffries P., Matsubara Y. PCR-SSCP analysis of Fusarium diversity in asparagus decline in Japan // Eur. J. Plant Pathol. 2011. V. 130. P. 197–203. https://doi.org/10.1007/s10658-011-9745-y

  12. Hansen E., Hesse C., Reeser P. et al. Using single strand conformational polymorphisms (SSCP) to identify Phytophthora species in Oregon forests affected by sudden oak death // Proc. Sudden Oak Death Second Sci. Symp.: The State of Our Knowledge. Gen. Tech. Rep. PSW-GTR-196. Albany, CA: Pacific Southwest Research Station, Forest Service, US Department of Agriculture. 2006. № 196. P. 141–142.

  13. Hong C., Gallegly M.E., Richardson P.A., Kong P. Phytophthora pini Leonian resurrected to distinct species status // Mycologia. 2011. V. 103. № 2. P. 351–360. https://doi.org/10.3852/10-058

  14. Martin F.N., Coffey M.D., Zeller K. et al. Evaluation of molecular markers for Phytophthora ramorum detection and identification: Testing for specificity using a standardized library of isolates // Phytopathology. 2009. V. 99. № 4. P. 390–403. https://doi.org/10.1094/PHYTO-99-4-0390

  15. Rodríguez F., Cai D., Teng Y., Spooner D. Asymmetric single-strand conformation polymorphism: An accurate and cost effective method to amplify and sequence allelic variants // Am. J. Bot. 2011. V. 98. № 7. P. 1061–1067. https://doi.org/10.3732/ajb.1000251

  16. Vleeshouwers V.G.G.A., Rietman H., Krenek P. et al. Effector genomics accelerates discovery and functional profiling of potato disease resistance and Phytophthora infestans avirulence genes // PLoS One. 2008. V. 3. № 8. P. e2875. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0002875

  17. Gu B., Cao X., Zhou X. et al. The histological, effectoromic, and transcriptomic analyses of Solanum pinnatisectum reveal an upregulation of multiple NBS-LRR genes suppressing Phytophthora infestans infection // Intern. J. Mol. Sci. 2020. V. 21. № 9. P. 3211. https://doi.org/10.3390/ijms21093211

  18. Song J., Bradeen J.M., Naess S.K. et al. Gene RB cloned from Solanum bulbocastanum confers broad spectrum resistance to potato late blight // PNAS. USA. 2003. V. 100. № 16. P. 9128–9133. https://doi.org/10.1073/pnas.1533501100

  19. Van Der Vossen E.A.G., Sikkema A., Hekkert B. te L. et al. An ancient R gene from the wild potato species Solanum bulbocastanum confers broad-spectrum resistance to Phytophthora infestans in cultivated potato and tomato // The Plant J. 2003. V. 36. № 6. P. 867–882. https://doi.org/10.1046/j.1365-313X.2003.01934.x

  20. Elansky S., Smirnov A., Dyakov Y. et al. Genotypic analysis of Russian isolates of Phytophthora infestans from the Moscow region, Siberia and Far East // Phytopathology. 2001. V. 149. P. 605–611. https://doi.org/10.1046/j.1439-0434.2001.00642.x

  21. Zhang C., Liu L., Wang X. et al. The Ph-3 gene from Solanum pimpinellifolium encodes CC-NBS-LRR protein conferring resistance to Phytophthora infestans // Theor. Applied Genet. 2014. V. 127. № 6. P. 1353–1364. https://doi.org/10.1007/s00122-014-2303-1

  22. Huang S., Van Der Vossen E.A.G., Kuang H. et al. Comparative genomics enabled the isolation of the R3a late blight resistance gene in potato // The Plant J. 2005. V. 42. № 2. P. 251–261. https://doi.org/10.1111/j.1365-313X.2005.02365.x

  23. Dey S., Ghose K., Gangopadhyay G., Basu D. Assessment of genomic diversity of wild and cultivated tomato through resistance gene analogue polymorphism and I2 homologues // Euphytica. 2007. V. 154. № 1–2. P. 219–230. https://doi.org/10.1007/s10681-006-9290-5

  24. Van Der Vossen E.A.G., Gros J., Sikkema A. et al. The Rpi-blb2 gene from Solanum bulbocastanum is an Mi-1 gene homolog conferring broad-spectrum late blight resistance in potato // The Plant J. 2005. V. 44. № 2. P. 208–222. https://doi.org/10.1111/j.1365-313X.2005.02527.x

  25. Кузнецова М.А., Стацюк Н.В., Рогожин А.Н. и др. Мониторинг изолятов Phytophthora infestans, выделенных с картофеля и томатов в Московской области (2009–2017 гг.) // Достижения науки и техники АПК. 2018. Т. 32. № 3. С. 28–33. https://doi.org/10.24411/0235-2451-2018-10306

  26. Elansky S.N., Pobedinskaya M.A., Kokaeva L.Y. et al. Phytophthora infestans populations from the European part of Russia: Genotypic structure and metalaxyl resistance // J. Plant Pathol. 2015. V. 97. № 3. P. 449–456. https://doi.org/10.4454/JPP.V97I3.020

  27. Kröner A., Mabon R., Corbière R. et al. The level of specialization of Phytophthora infestans to potato and tomato is a biotrophy-related, stable trait // BioRxiv. 2019. 571596. https://doi.org/10.1101/571596

  28. Cohen Y., Rubin A.E., Galperin M. et al. Migration and selection enforced multiple phenotypic and genotypic changes in the population of Phytophthora infestans in Israel during the last 36-year period // Preprints. 2020. 2020010321. https://doi.org/10.20944/preprints202001.0321.v1

Дополнительные материалы отсутствуют.