Генетика, 2021, T. 57, № 5, стр. 544-556

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Разнообразие запасных белков, контролируемых локусами Hrd A, Hrd B и Hrd F в H. vulgare, изучали путем электрофоретического анализа гордеинов в 2244 образцах ячменя. Выборка включала: 1197 стародавних местных сортов из 22 стран, входящих в основные центры разнообразия ячменя и граничащих с ними государств, 228 сортов ярового ячменя, возделывавшихся на территории бывшего СССР с 1929 по 1991 гг., 200 сортов, допущенных к использованию в России с 1992 по 2019 гг. Кроме этого использовали полученные ранее данные по полиморфизму гордеинов в 619 сортах ярового и озимого ячменя из стран Европы, Азии, Америки и Африки [7] (табл. 1). Материал для исследований был получен: из Федерального исследовательского центра Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова (ВИР), National Small Grains Research Collection USDA (Aberdeen, Idaho, США), Research Institute for Bioresources Okayama University (Япония), International Center for Agricultural Research in the Dry Areas – ICARDA (Aleppo, Сирия), кафедры селекции Самаркандского сельскохозяйственного института (Узбекистан), Памирского биологического института (Таджикистан, Хорог), ФГУ “Государственная комиссия Российской Федерации по испытанию и охране селекционных достижений” Министерства сельского хозяйства РФ. Значительная часть образцов местных ячменей была собрана в начале ХХ в. экспедициями Н.И. Вавилова, Е.Г. Черняковской, А.К. Гольбека, В.Е. Писарева и других сотрудников ВИРа, а также экспедициями Д.Р. Харлана (J.R. Harlan). Коллекция местных ячменей из Узбекистана была собрана в 1930-е годы с приусадебных участков декхан селекционерами В.Н. Покровским и Ф.А. Квятковским. Для каждого образца местных ячменей анализировали гордеины в 5–10 линиях, а для селекционных сортов – в 40–100 линиях или индивидуальных зерновках.

Электрофорез гордеинов проводили в столбиках 12–14%-ного крахмального геля с 3 М мочевиной в алюминий-лактатном буфере с рН 3.1 по методике А.А. Созинова и Ф.А. Поперели [12] с некоторыми модификациями [13]. Анализ сходства исследованных местных популяций ячменя проводили методом главных компонент с помощью пакета программ SPSS 19.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕИЕ

В результате электрофоретического анализа гордеинов в 2244 образцах ячменя к настоящему времени обнаружено 156 вариантов блоков компонентов, контролируемых аллелями локуса Hrd A (рис. 2), 271 – локуса Hrd B и 5 – локуса Hrd F (рис. 3). Среди выявленного разнообразия гордеинов А мы выделяем группы фенотипически схожих вариантов блоков компонентов – семейства вариантов блоков компонентов. На рис. 4 в качестве примера приведены две такие группы блоков компонентов. Из рис. 4,а видно, что блок компонентов А100 отличается от А2 уменьшением подвижности компонента 4. Блок А30 отличается от А2 и А100 двойным компонентом 4. Вариант А9, в сравнении с А2, характеризуется снижением интенсивности компонента 1, увеличением подвижности компонента 2 и появлением двух минорных компонентов в районе компонента 4. У блока А149, в сравнении с А9, отсутствует компонент 4. Варианты А4 и А58 характеризуются отсутствием компонента 5 или уменьшением его электрофоретической подвижности, соответственно. Аналогичные различия по числу компонентов гордеина А, их подвижности и относительной интенсивности наблюдаются между блоками компонентов на рис. 4,б. Формирование таких семейств можно продемонстрировать на следующем примере. При электрофоретическом анализе гордеинов в ряде мутантных по морфологическим признакам линий, полученных Г.Г. Шведовым (Селекционно-генетический институт, Одесса) путем химического мутагенеза из сорта Одесский 46, нами были обнаружены формы, электрофореграммы гордеина А которых представлены на рис. 5. Из рисунка видно, что на электрофореграмме А-гордеина мутантов М564 и М109 в сравнении с электрофореграммой гордеина исходного сорта, отсутствуют компоненты 6 и 3 соответственно, а у мутанта М88 – изменилась подвижность компонента 5. Таким образом, вариант блока гордеина А3 и его мутантные варианты составляют одно семейство. Каждый из этих вариантов в дальнейшем может служить исходным для возникновения новых вариантов блоков компонентов в результате мутаций.

Рис. 2.

Варианты блоков компонентов гордеина А, обнаруженные при анализе 2244 образцов культурного ячменя.

Рис. 3.

Варианты блоков компонентов гордеина В, обнаруженные при анализе 2244 образцов культурного ячменя.

Рис. 4.

Некоторые варианты фенотипически сходных блоков компонентов гордеина А, объединяемые в семейства: а – семейство I, б – семейство III.

Рис. 5.

Формирование семейства блоков компонентов гордеина А в результате химического мутагенеза.

Возникновение полиморфизма запасных белков злаков длительное время рассматривалось как результат посттрансляционных изменений, таких как агрегация, дезамидирование, протеолиз и гликозилирование. Однако экспериментальных данных, подтверждающих эти предположения, нет [14]. К настоящему времени известно, что группы полипептидов С- и В-гордеинов кодируются локусами Hor 1 (Hrd A) и Hor 2 (Hrd B), включающими несколько десятков генов [15, 16]. В результате анализа клонированных нуклеотидных последовательностей из различных сортов ячменя было показано, что гены в локусе Hor 1 могут располагаться относительно друг друга по типу “голова к голове” в непосредственной близости друг от друга. Были также обнаружены различия длин кодирующих последовательностей (363–1000 пн), что является молекулярной основой полиморфизма размеров С-гордеинов [17]. Кроме этого степень различий зависит от замен только одной аминокислоты (заряженная/незаряженная), а также от делеций/инсерций отдельных триплетов или блоков. Не исключены значительные делеции кодирующей части генов С-гордеинов [17, 18]. Обработка у ряда сортов и дигаплоидных линий ячменя рестриктазами генов В-гордеинов, амплифицированных с использованием праймеров, гомологичных районам, фланкирующим кодирующие последовательности, выявила полиморфизм, обусловленный приобретением или потерей сайтов рестрикции как внутри, так и между генотипами. При амплификации с использованием праймеров, гомологичных районам внутри кодирующей последовательности и фланкирующих множественные тандемные повторы некоторых генов В-гордеина, была выявлена вариация по длине повторяющегося домена гена В-гордеина как внутри, так и между сортами. Эта изменчивость объясняется изменением числа тандемных повторов в повторяющемся домене в результате неравного кроссинговера и проскальзывания нити ДНК (DNA-slippage) во время репликации [19]. Однако в литературе имеется информация только об одном доказанном рекомбинанте между генами в локусе Hor 2 [19, 20]. Таким образом, наблюдаемый полиморфизм гордеинов ячменя определяется не посттрансляционными изменениями белков, а различиями между генотипами на уровне ДНК.

Основываясь на данных о механизмах формирования полиморфизма годеинов и фенотипическом сходстве электрофоретических спектров, 156 вариантов блоков компонентов, контролируемых аллелями локуса Hrd A, мы объединили в 12 семейств, обозначенных римскими цифрами (AI– AXII). При этом вариант А21 не был отнесен ни к одному из семейств (табл. 2, рис. 2). Из табл. 2 следует, что семейства значительно различаются по числу входящих в них вариантов блоков компонентов. Самое большое семейство – AI – включает 60 (38.5%) вариантов. Сравнительно высокую численность имеют семейства AIII – 12 (7.7%) вариантов, AV и AVIII – по 16 (10.3%) вариантов. Остальные восемь семейств объединяют от 5 (3.2%) до 9 (5.8%) вариантов. Таким образом, четыре семейства из двенадцати объединяют 66.8% известных вариантов блоков компонентов гордеина А.

Среди идентифицированных в H. vulgare 271 вариантов гордеина В мы выделили 17 семейств (BI–BXVII) (рис. 3, табл. 2). Семейства вариантов гордеина В, как и семейства вариантов гордеина А, значительно различаются по числу входящих в них вариантов блоков компонентов. Наибольшее число вариантов объединяют семейства BXIII – 41 (15.1%) и BXV – 36 (13.3%). Сравнительно высокое число вариантов блоков включают так же семейства BIV – 26 (9.6%), BXII – 24 (8.9%), BX – 22 (8.1%), BII и BIX – по 19 (7.0%). Остальные десять семейств включают от 3 (1.1%) до 16 (5.9%) вариантов блоков компонентов гордеина В. Таким образом, семь семейств из семнадцати объединяют 69.0% вариантов HRD В, выделенных в культурном ячмене. Следует отметить, что от общего числа известных электрофоретических вариантов гордеинов А и В в исследованных местных популяциях ячменя обнаружено 91 и 88.9% вариантов блоков компонентов соответственно. Это на наш взгляд объясняется тем, что в основе генофонда современных селекционных сортов лежит генофонд местных популяций ячменя. Однако в современной селекции ячменя с целью поиска новых хозяйственно ценных признаков используется мутагенез. Также в селекционный процесс вовлекается дикий ячмень Hordeum spontaneum C. Koch [21–23]. Здесь мы не рассматриваем распространение пяти вариантов HRD F, так как локус Hrd F, контролирующий эти белки, тесно сцеплен с локусом Hrd B, величина рекомбинации между ними составляет 1.5% рекомбинации [3].

Возникает вопрос о причинах столь значительных различий между семействами гордеинов А и В по числу входящих в них вариантов блоков компонентов, а также как и откуда в культурном ячмене возникли собственно семейства дискретные по фенотипу? В настоящее время установлено, что диким предшественником H. vulgare является H. spontaneum [24]. Однако время и место доместикации ячменя до сих пор не установлены. Так например J.R. Harlan и D. Zohary, опираясь на исследования археологов, выдвинули гипотезу, что ячмень был введен в культуру в Дуге Плодородия в VII тысячелетии до н. э. [25]. При этом наиболее раннее использование ячменя человеком в Юго-Западной Азии, датируемое 17 тысячелетием до н. э., зафиксировано в Охало II (Ohalo II) около Галилейского моря [26]. В то же время зерна культурного ячменя, возраст которых оценивается в 18 000 лет, найдены в археологических раскопках в южном Египте, около Асуана в районе Каббания [27]. Следует отметить, что количество и качество археоботанических доказательств значительно варьируют от района к району. Имеется обширная информация по Балканским странам, Центральной и Западной Европе, но документация по России, Центральной Азии и Индии намного более разрознена. Из Африки только по Египту существуют достаточные данные по растительным остаткам [28]. Таким образом, по имеющимся данным, время доместикации ячменя насчитывает не менее 18 тыс. лет.

Учитывая, что формирование полиморфизма гордеинов во многом обусловлено возникновением различного рода мутаций в генах локусов Hrd A и Hrd B, можно предположить, что число вариантов блоков компонентов, входящих в то или иное семейство, отражает длительность существования такого семейства в культурном ячмене. Таким образом, самым “древним” семейством гордеина А может быть семейство AI, включающее 58 вариантов, обнаруженных в местных популяциях ячменя (табл. 2). При этом представители семейства AI с суммарными частотами от 0.1203 (Узбекистан) до 0.9429 (Тунис) были обнаружены в местных популяциях из 21 страны, кроме Горного Бадахшана (табл. 3). Наибольшее распространение имели три варианта, объединенные в это семейство: в 21-ной стране – А2 с частотами от 0.0719 (Йемен) до 0.4125 (Палестина); в 15 странах – А62 с частотами от 0.001 (Узбекистан) до 0.125 (Палестина), в 14 странах – А24 с частотами от 0.0033 (Иран) до 0.4572 (Эфиопия). Следующим по числу вариантов гордеина А семейством является AVIII – 15 вариантов. Представители этого семейства с суммарными частотами от 0.0020 (Узбекистан) до 0.9218 (Горный Бадахшан) обнаружены в популяциях из 16 стран. Самым распространенным вариантом является вариант А19, присутствовавший в образцах из 15 стран с частотами от 0.0020 в Узбекистане до 0.5527 в Горном Бадахшане. Высокие частоты этого варианта гордеина А обнаружены также в популяциях из Непала (0.2733), Ирака (0.2148), Израиля (0.1800), Китая (0.1417), Пакистана (0.1072). Остальные 14 вариантов присутствовали в местных популяциях ячменя от одной до пяти стран.

Семейство AV включает 14 вариантов блоков компонентов с суммарными частотами от 0.0022 (Турция) до 0.7742 (Узбекистан), обнаруженных в местных популяциях ячменя из 19 стран кроме Марокко, Туниса и Палестины (табл. 2, 3). Среди вариантов гордеина А, вошедших в это семейство, самое широкое распространение наблюдается для HRD A1 – в 11 странах с частотами от 0.0017 (Киргизия) до 0.1400 (Сирия), HRD A18 – в 11 странах с частотами от 0.0011 (Йемен) до 0.6441 (Узбекистан) и HRD A12 – в 10 странах с частотами от 0.0033 (Сирия) до 0.1362 (Киргизия). Одиннадцать вариантов блоков компонентов гордеина А из этого семейства были обнаружены в популяциях ячменя от одной до восьми стран.

Среди 17 семейств гордеина В наибольшее число вариантов блоков компонентов включают семейства BXIII – 35 вариантов, BXV – 34 варианта и BIV – 26 вариантов. В остальные 14 семейств входят от 3 до 18 вариантов (табл. 2). Представители семейства BXIII выявлены в популяциях ячменя из 21 страны, кроме Горного Бадахшана, с суммарными частотами от 0.0200 (Непал) до 0.4000 (Израиль) (табл. 4). Наибольшее распространение имел HRD B17, обнаруженный в образцах из 14 стран с частотами от 0.0011 (Йемен) до 0.0383 (Сирия). Вариант HRD B11 присутствовал в популяциях из 11 стран с частотами от 0.0049 (Узбекистан) до 0.2583 (Китай). Каждый из вариантов HRD B12 и HRD B82 с частотами от 0.0011 (Узбекистан) до 0.2507 (Йемен) и от 0.0010 (Узбекистан) до 0.1000 (Палестина) соответственно были обнаружены в образцах из 10 стран. Тридцать один вариант блоков компонентов горедина В, входящие в это семейство, обнаружены в образцах от одной до девяти стран.

Варианты, составляющие семейство BXV, присутствовали в исследованных популяциях из 19 стран, за исключением Марокко, Туниса и Израиля, с суммарными частотами от 0.0133 (Сирия) до 0.4349 (Йемен). Самым распространенным вариантом из этого семейства является HRD В84, идентифицированный в образцах из 12 стран с частотами от 0.0024 (Афганистан) до 0.1456 (Эфиопия). Сравнительно широкое распространение имел HRD B111, найденный в популяциях из семи стран с частотами от 0.0012 (Афганистан) до 0.1456 (Эфиопия). Остальные 32 варианта, составляющие семейство BXV, присутствовали в местных ячменях от одной до пяти стран.

Представители семейства BIV были обнаружены в местных популяциях ячменя из 21 страны, за исключением Израиля, с суммарными частотами от 0.0227 (Эфиопия) до 0.4686 (Сирия). Наибольшее распространение имел вариант HRD B14 – в 15 странах с частотами от 0.0032 (Иран) до 0.2334 (Марокко). В исследованных образцах из десяти стран был обнаружен вариант HRD B2 с частотами от 0.0010 (Узбекистан) до 0.0733 (Сирия). В популяциях из семи стран идентифицированы варианты блоков компонентов HRD B16 и HRD B65. При этом частоты HRD B16 варьировали от 0.0024 (Афганистан) до 0.1146 (Китай), а варианта HRD B65 – от 0.0011 (Турция) до 0.2180 (Сирия). Другие варианты блоков компонентов, входящие в это семейство, присутствовали в исследованных образцах от одной до пяти стран.

Таким образом, наблюдается мозаичность и неравномерность частот в распространении семейств вариантов блоков компонентов HRD А и HRD B в исследованных местных популяциях из различных стран мира. Матрицу суммарных частот семейств одновременно гордеинов A и B в местных популяциях ячменя из 22 стран подвергли кластерному анализу методом главных компонент. Первые две компоненты описывают 38.8% изменчивости частот вариантов семейств А и В (рис. 6). Как видно из рис. 6, по первой главной компоненте исследованные популяции разделились следующим образом: в отрицательную область значений попали образцы ячменя из стран Азии восточнее Ирана, а так же из Ирака, Йемена и Эфиопии. В положительной области значений первой главной компоненты оказались популяции из стран Северной Африки, Ближнего Востока, Передней Азии и Ирана. Таким образом, “восточные” и “западные” местные популяции культурного ячменя различаются как по составу, так и по суммарным частотам семейств блоков компонентов грдеинов А и В. Причиной такой мозаичности в распространении семейств вариантов HRD A и HRD B могут служить, на наш взгляд, несколько факторов: эффект основателя и неоднократная интродукция популяций культурного ячменя в те или иные регионы из различных стран [29]; зависимость распространения аллелей годреин-кодирующих локусов от распределения таких климатических факторов как количество осадков в год, средние температуры июля и континентальность климата [30], высота выращивания популяций над уровнем моря [31].

Рис. 6.

Положение местных популяций ячменя из 22 стран в координатах первой и второй главных компонент изменчивости частот вариантов семейств гордеинов А и В.

Однако каким образом возникли собственно семейства вариантов блоков компонентов? Можно предположить, что возникновение семейств связано с постепенным накоплением мутаций в гордеиновых локусах культурного ячменя в течение длительного периода. Но тогда следовало ожидать присутствие в культурном ячмене неких “переходных” вариантов от одного семейства к другому. Но, как видно из рис. 3 и 4, семейства дискретны, и мы не обнаружили промежуточных вариантов между ними. Вместе с тем, при исследовании полиморфизма гордеина в 116 образцах H. spontaneum из Ирана, Израиля, Сирии и Иордании [32–35] нами были обнаружены блоки компонентов идентичные вариантам, присутствующим в культурном ячмене и относящиеся к 8 семействам гордеина А и 11 семействам гордеина В (табл. 5). Полученные результаты позволяют сделать вывод, что существующий полиморфизм гордеинов А и В у культурного ячменя является следствием двух процессов: с одной стороны, интрогрессии аллелей (вариантов блоков компонентов) гордеин-кодирующих локусов от H. spontaneum в результате спонтанной гибридизации при распространении культурного ячменя, с другой стороны – накоплением мутаций в генах локусов Hrd A и Hrd B у H. vulgare.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.