Генетика, 2021, T. 57, № 6, стр. 697-710

Филогенетические отношения подвидов пчел Apis mellifera caucasia и Apis mellifera carpathica по последовательностям митохондриального генома

Р. А. Ильясов 12*, Г. Ю. Хан 2, М. Л. Ли 2, К. В. Ким 2, Д. Х. Парк 23, Д. И. Такахаши 4, Х. В. Квон 2**, А. Г. Николенко 1

1 Уфимский федеральный исследовательский центр Российской академии наук
450054 Уфа, Россия

2 Отделение наук о жизни и Исследовательский центр насекомых переносчиков болезней, Инчхонский национальный университет
22012 Инчхон, Корея

3 Биоинформатическая компания 3BIGS CO. LTD
18454 Хвасон-си, Корея

4 Факультет естественных наук, Университет Киото Сангё
603-8555 Киото, Япония

* E-mail: apismell@hotmail.com
** E-mail: hwkwon@inu.ac.kr

Поступила в редакцию 13.07.2020
После доработки 04.09.2020
Принята к публикации 18.10.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Последовательности полного митохондриального генома медоносной пчелы Apis mellifera L. подвидов Apis mellifera caucasia Pollmann, 1889 (AP018404, 16 341 пн) и Apis mellifera carpathica Foti et al., 1965 (AP018403, 16 336 пн) были впервые секвенированы. Митохондриальные ДНК (мтДНК) обоих подвидов содержат 13 кодирующих белок генов, 22 гена тРНК, два гена рРНК и AT-обогащенную регуляторную область. Отношение транзиций к трансверсиям полной мтДНК между A. m. caucasia и A. m. carpathica было 2.05, что характеризует формирование адаптаций к сменяющимся условиям среды обитания. Гены с наибольшим содержанием GC – COX1 (24%), COX2 (19.6%), CYTB (19.1%), COX3 (17.2%) и ND1 (17.2%) могут быть высокополиморфны и использованы в филогенетических и популяционных исследованиях пчел. Большинство генов мтДНК обоих подвидов расположены на тяжелой цепи (девять кодирующих белок генов и 14 генов тРНК), и меньшее число генов (четыре кодирующих белок гена, два гена рРНК и восемь генов тРНК) расположено на легкой цепи. Кластерный анализ последовательности полной мтДНК и оценка структуры межгенной области tRNA-Leu(UUR)–COX2 с единственным элементом Q размером 192 пн показали, что оба подвида являются представителями линии C с гаплотипами C2 и C2j соответственно. Подвиды медоносной пчелы A. m. caucasia и A. m. carpathica могут быть дифференцированы друг от друга по 34 уникальным SNP в 11 генах мтДНК и маркеру рестрикции XbaI в гене ND5. Эти генетические маркеры могут способствовать сохранению чистопородных генофондов пчел подвидов A. m. caucasia и A. m. carpathica в пределах их естественного ареала.

Ключевые слова: Apis mellifera, подвиды пчел, A. m. caucasia, A. m. carpathica, митохондриальный геном, мтДНК, гаплотипы, консервативная генетика.

Медоносная пчела используется человеком для производства специфических продуктов пчеловодства и опыления сельскохозяйственных растений [13]. В результате эволюции сформировалось около 30 подвидов медоносной пчелы, распространенных в широком спектре климатических условий Старого Света [4, 5]. Способность пчел хорошо приспосабливаться позволила человеку распространить их практически во всех странах мира [68].

Несмотря на широкую экологическую пластичность, большую численность и широкое распространение, численность популяций пчел ежегодно сокращается во всем мире [9, 10]. Сокращение популяции пчел происходит по разным причинам: применение пестицидов и инсектицидов в сельском хозяйстве, неконтролируемые массовые транспортировки пчел, внутривидовая гибридизация, распространение новых болезней, глобальные климатические изменения [1117]. Показано, что сокращение численности популяций медоносной пчелы будет вести к сокращению генетического разнообразия и адаптивности популяции, а также к снижению биоразнообразия экосистем [1823].

Подвиды медоносной пчелы подразделяются как минимум на пять эволюционных линий: линия A во всей Африке, линия M в Западной Европе, линия C в Восточной Европе, линия O в Западной Азии и линия Y в Северо-Восточной Африке и Юго-Западной Азии. Подвиды пчел разных линий различаются существеннее подвидов из одной линии. Гибридизация подвидов пчел разных линий может иметь такие последствия, как снижение численности популяции, приспособленности и адаптивности, а также потеря хозяйственно полезных признаков [9, 10, 24].

Географически ареалы подвидов разных эволюционных линий имеют смежные границы и часто перекрываются, что привело к формированию гибридных зон на границах ареалов. Деятельность человека усилила формирование гибридных популяций пчел [9, 10, 24]. В мировом коммерческом пчеловодстве наиболее востребованными являются пчелы подвидов эволюционной линии С – A. m. ligustica Spinola, 1806 [25], A. m. carnica Pollmann, 1889 [26], A. m. caucasia Pollmann, 1889 [26], A. m. carpathica Foti et al., 1965 [27]. Повсеместное использование пчел этих подвидов в пределах естественного распространения локальных подвидов привело к разрушению аборигенных генофондов многих подвидов Европы и Западной Азии. В России серая горная кавказская A. m. caucasia и карпатская A. m. carpathica пчелы являются наиболее распространенными в пчеловодстве после темной лесной пчелы A. m. mellifera [1824].

Естественный ареал кавказской пчелы A. m. caucasia охватывает хребты и долины Кавказских гор и Восточную Анатолию [28]. Естественный ареал карпатской пчелы A. m. carpathica охватывает хребты и долины Карпатских гор и Западную Трансильванию [29]. Эти пчелы идеально приспособлены к жаркому лету и умеренной зиме и являются незаменимыми компонентами природных экосистем Кавказских и Карпатских гор [3033]. В результате массовых транспортировок эти подвиды были распространены на территориях Армении, Австрии, Азербайджана, Белоруссии, Болгарии, Чехии, Грузии, Венгрии, Польши, Румынии, Словакии, юга России, Турции, Украины и Узбекистана [28]. Следствием такого широкого искусственного распространения подвидов A. m. caucasia и A. m. carpathica стала массовая гибридизация и интрогрессия с локальными для каждой местности подвидами, а также друг с другом [29, 34, 35].

Кавказская A. m. caucasia и карпатская A. m. carpathica пчелы – наименее изученные с научной точки зрения подвиды, несмотря на востребованность и активное использование их в пчеловодстве. Часто подвиды A. m. carpathica и A. m. caucasia упускаются и не упоминаются в списках подвидов [18, 3639].

Подвид A. m. carpathica долгое время считался экотипом подвида A. m. carnica в Западной Румынии или A. m. macedonica в Восточной Румынии [29, 37]. Другие работы, на основе морфометрии [27, 4043] и мтДНК [24, 29, 4447], признают таксономическую самостоятельность подвида A. m. carpathica. Существует неоднозначность в определении принадлежности подвида A. m. caucasia к эволюционной линии, который на основе морфометрии [39, 4850] и аллозимов [28] был отнесен к линии О, а на основе мтДНК [18, 19, 23, 38, 45, 5154] – к линии С.

Идентификация подвида и выявление уровня интрогрессии являются основой для сохранения генофонда популяций пчел [29, 35]. Нами определены нуклеотидные последовательности полной мтДНК пчел подвидов A. m. caucasia и A. m. carpathica с целью уточнения их таксономического статуса и определения их филогенетических отношений. На основе анализа мтДНК мы показали, что подвиды пчел A. m. caucasia и A. m. carpathica относятся к эволюционной линии С и взаимодействуют между собой как два самостоятельных подвида.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Взрослые особи рабочих пчел A. m. caucasia были отобраны на пасеке в Сочинском районе Краснодарского края, Россия (43°45′ с.ш., 39°95′ в.д), взрослые особи A. m. carpathica – на пасеке в Майкопском районе Республики Адыгея, Россия (44°61′ с.ш., 40°07′ в.д.). Принадлежность семей пчел к подвидам A. m. caucasia и A. m. carpathica была предварительно подтверждена морфометрическим методом [55]. Тотальную ДНК экстрагировали из грудной мышечной ткани с использованием набора Wizard Genomic DNA Purification Kit (PROMEGA, Madison, WI, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Образцы ДНК хранили при –20°С до дальнейшего использования.

Секвенирование мтДНК было проведено с помощью набора NextSeq 500/550 High Output Kit v. 2 (75 циклов) (ILLUMINA, США) на основе парных циклов считывания (2 × 150 пн) с использованием секвенатора Illumina Next Seq 500 (ILLUMINA, США) в Университете Киото Сангё (Kyoto, Япония), следуя инструкции производителя. Геномные библиотеки были приготовлены с помощью набора для подготовки ДНК-библиотеки Nextera (ILLUMINA, США) в соответствии с инструкциями производителя. Сборка геномов A. m. caucasia и A. m. carpathica проводилась на основе 1 662 186 и 1 541 213 прочтений соответственно, с средним покрытием 75 с помощью Geneious R9 (BIOMATTERS, Новая Зеландия). Аннотация геномов выполнена с использованием MITOS (Universität Leipzig, Германия) [56], Geneious R9 (BIOMATTERS, Новая Зеландия), Unipro UGENE 1.28 (UNIPRO, Россия), CLC Genomics Workbench 11 (CLCbio, Denmark) и tRNAscan-SE (CA, США) [57].

Нуклеотидные последовательности полной мтДНК были депонированы в базы данных Генбанка GenBank/DDBJ под номерами AP018404 для A. m. caucasia (16 341 пн) и AP018403 для A. m. carpathica (16 336 пн). Сравнительный анализ полной мтДНК был проведен в MEGA7 [58] с использованием последовательностей из Генбанка: NC_001566 (A. m. ligustica, Maryland, США) [59], KX908209 (A. m. ligustica, Gwangju, Корея) [60], KP163643 (A. m. syriaca Skorikov, 1929 [61], Baqa, Иордания) [62], KY926882 (A. m. syriaca, Yunnan, Китай) [63], A. m. ligustica NC_001566 (16 324 пн) (Bethesda, США) (референсная последовательность), A. c. cerana F. GQ162109 (Yunnan, Китай) (15 895 пн) [64] (внешняя группа).

Выравнивание последовательностей межгенной области tRNA-Leu(UUR)–COX2 A. m. caucasia и A. m. carpathica проводилось с образцами нуклеотидных последовательностей из Генбанка: A. m. carnica (FJ037782) гаплотип C19, A. m. ligustica (JF934709) гаплотип C33, A. m. carnica (JF934704) гаплотип C2, A. m. carnica (FJ037776) гаплотип C11, A. m. ligustica (FJ037780) гаплотип C17, A. m. carnica (FJ037781) гаплотип C18, A. m. ligustica (FJ037778) гаплотип C14, A. m. carnica (GQ433623) гаплотип C2j, A. m. ligustica (FJ037777) гаплотип C12, A. m. syriaca (AY618918) гаплотип O, A. m. syriaca (AY618917) гаплотип O, A. m. syriaca (FJ477993) гаплотип O1b, A. m. syriaca (FJ037787) гаплотип O11, A. m. syriaca (FJ477992) гаплотип O1a, A. m. syriaca (AY618916) гаплотип O, A. m. lamarckii Cockerell, 1906 (FJ477994) [65] гаплотип O1c, A. m. syriaca (FJ477997) гаплотип O3.

Дивергенция нуклеотидных последовательностей и генетические дистанции Jukes–Cantor [66] были рассчитаны с использованием UNIPRO UGENE 1.28 (Россия) и CLC Genomics Workbench 11 (CLCbio, Дания). Филогенетический анализ на основе последовательностей ДНК был проведен с использованием MEGA7 [58] и Statistica 8.0 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, США), JMP14 (SAS Institute Inc., North Carolina, США). Филогенетические деревья были построены с использованием метода ближайшего соседа [67] на основе дистанций Jukes–Cantor с 1000 бутстреп-репликациями. Физическая карта полного митохондриального генома была построена с использованием CLC Genomics Workbench 11 (CLCbio, Дания) и Artemis 17.0.1 (The Sanger Institute, Hinxton, Cambridge, Великобритания).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Размеры полной последовательности мтДНК A. m. caucasia (AP018404) 16 341 пн и A. m. carpathica (AP018403) 16 336 пн были немного длиннее последовательности мтДНК Drosophila yakuba (NC_001322) 16 019 пн (рис. 1). Были рассчитаны соотношения нуклеотидов A, T, G и C и наиболее важных пар AT и GC полной мтДНК A. m. caucasia и A. m. carpathica (табл. 1). Среднее содержание нуклеотидов AT – 84.9% и GC – 15.1% сходно с содержанием у Drosophila melanogaster (U37541) и подвидов пчел A. m. ligustica и A. m. syriaca. Это может быть результатом частых замен пар CG на AT в ходе эволюции [59].

Рис. 1.

Кольцевая физическая карта полной мтДНК A. m. caucasia и A. m. carpathica. Сайты распознавания рестрикционных ферментов выделены фоном, а уникальный сайт рестрикции, характерный только для A. m. caucasia, подчеркнут.

Таблица 1.

Характеристика нуклеотидного состава полной мтДНК A. m. caucasia и A. m. carpathica

Нуклеотиды A. m. caucasia/A. m. carpathica
число содержание, %
Аденин (A) 7067/7066 43.2/43.3
Цитозин (C) 1560/1562 9.5/9.6
Гуанин (G) 908/906 5.6/5.5
Тимин (T) 6806/6800 41.6/41.6
GC 2468/2468 15.1/15.1
AT 13 873/13 866 84.9/84.9

Аналогично референсной последовательности A. m. ligustica (NC_001566) последовательности мтДНК A. m. caucasia и A. m. carpathica содержали 13 белок-кодирующих генов (ND2, COX1, COX2, ATP8, ATP6, COX3, ND3, ND5, ND4, ND4L, ND6, CYTB, ND1), 22 гена тРНК (tRNA-Glu, tRNA-Ser(AGN), tRNA-Met, tRNA-Gln, tRNA-Ala, tRNA-Ile, tRNA-Cys, tRNA-Tyr, tRNA-Trp, tRNA-Leu(UUR), tRNA-Asp, tRNA-Lys, tRNA-Gly, tRNA-Arg, tRNA-Asn, tRNA-Phe, tRNA-His, tRNA-Thr, tRNA-Pro, tRNA-Ser(UCN), tRNA-Leu(CUN), tRNA-Val), два гена рРНК (16S rRNA, 12S rRNA) и AT-богатую регуляторную область (табл. 2).

Таблица 2.

Характеристика генов полной мтДНК пчел A. m. caucasia и A. m. carpathica

Типы генов Ген Размер, пн Содержание GC, %
Белок- кодирующие ND2 1002 13.4
COX1 1566 24
COX2 678 19.6
ATP8 159 11.3
ATP6 681 15.3
COX3 780 17.2
ND3 354 13.6
ND5* 1665 14.2
ND4* 1311 13.7
ND4L* 264 14
ND6 504 12.5
CYTB 1152 19.1
ND1* 918 17.2
тРНК tRNA-Glu 66 4.5
tRNA-Ser(AGN) 61 19.7
tRNA-Met 66 21.2
tRNA-Gln 55 12.7
tRNA-Ala 70 10.0
tRNA-Ile 69 13.0
tRNA-Cys* 69 13.0
tRNA-Tyr* 68 11.8
tRNA-Trp 72 8.3
tRNA-Leu(UUR) 70 18.6
tRNA-Asp 69 10.1
tRNA-Lys 69 20.3
tRNA-Gly 66 7.6
tRNA-Arg* 67 13.4
tRNA-Asn 69 14.5
tRNA-Phe* 69 11.6
tRNA-His* 68 14.7
tRNA-Thr 59 8.5
tRNA-Pro* 69 14.5
tRNA-Ser(UCN) 67 13.4
tRNA-Leu(CUN)* 71 12.7
tRNA-Val* 70 11.4
рРНК 16S rRNA* 1362 15.6
12S rRNA* 818 3.4

* Гены, расположенные на легкой цепи мтДНК.

Тяжелая цепь мтДНК A. m. caucasia и A. m. carpathica содержит девять белок-кодирующих генов (ND2, COX1, COX2, ATP8, ATP6, COX3, ND3, ND6 и CYTB) и 14 генов тРНК (tRNA-Glu, tRNA-Ser(AGN), tRNA-Met, tRNA-Gln, tRNA-Ala, tRNA-Ile, tRNA-Trp, tRNA-Leu(UUR), tRNA-Asp, tRNA-Lys, tRNA-Gly, tRNA-Asn, tRNA-Thr и tRNA-Ser(UCN)), а легкая цепь мтДНК содержит четыре белок-кодирующих гена (ND1, ND4, ND4L и ND5), восемь генов тРНК (tRNA-Cys, tRNA-Tyr, tRNA-Arg, tRNA-Phe, tRNA-His, tRNA-Pro, tRNA-Leu(CUN) и tRNA-Val) и два гена рРНК (16S rRNA, 12S rRNA) (рис. 2).

Рис. 2.

Сравнительный анализ вариабельной некодирующей межгенной области между tRNA-Leu(UUR) и COX2 A. m. caucasia и A. m. carpathica с подвидами линий С и О.

Известно, что значение генетического разнообразия и вариабельности зависит от содержания GC – чем выше содержание GC, тем выше вариабельность генов [68]. Было рассчитано содержание GC во всех генах мтДНК. Возможно, что наиболее вариабельные белок-кодирующие гены – COX1, COX2, CYTB, COX3, ND1, а наименее вариабельные белок-кодирующие гены – ND4, ND3, ND2, ND6, ATP8. Поскольку содержание GC в мтДНК менее 40% считается низким [69], вероятно, что большинство генов мтДНК высококонсервативны (табл. 2).

Была построена физическая карта полной мтДНК пчел A. m. caucasia и A. m. carpathica. Не было обнаружено различий в синтении полной мтДНК A. m. caucasia, A. m. carpathica с референсной последовательностью A. m. ligustica. Четыре пары генов ND2 и tRNA-Cys, ATP6 и ATP8, COX1 и tRNA-Leu(UUR), COX2 и tRNA-Asp имели небольшие перекрывающиеся участки у обоих подвидов пчел (рис. 1).

Белок-кодирующие гены мтДНК A. m. caucasia и A. m. carpathica, аналогично референсной последовательности A. m. ligustica, имеют один тип стоп-кодона TAA и четыре типа стартовых кодонов: кодон ATG – гены ATP6, COX3, CYTB; кодон ATA – гены COX1, ND3, ND4; кодон ATT – гены COX2, ATP8, ND1, ND4L, ND5, ND6; кодон ATC – ген ND2.

В мтДНК A. m. caucasia, A. m. carpathica и референсной последовательности A. m. ligustica имеются по два гена изоакцепторных тРНК для аминокислот серин (Ser) и лейцин (Leu). Первая tRNA-Ser(AGN) распознает кодон AGN по антикодону TCT, расположенному на тяжелой цепи в положении 138–140, а вторая tRNA-Ser(UCN) распознает кодон UCN по антикодону TGA, расположенному на тяжелой цепи в положении 12 230–12 232 относительно референсной последовательности A. m. ligustica. Первая tRNA-Leu(UUR) распознает кодон UUR по антикодону TAA, расположенному на тяжелой цепи в положении 3388–3390, а вторая tRNA-Leu(CUN) распознает кодон CUN по антикодону TAG, расположенному на легкой цепи в положении 13 267–13 269 относительно референсной последовательности A. m. ligustica. Очевидно, что присутствие этих двух изоакцепторных генов тРНК в одной мтДНК является результатом адаптивной эволюции медоносных пчел, которая обеспечивает гарантированную бесперебойную трансляцию наиболее важных белков и пептидов.

15 сайтов рестрикции – общиe для полной мтДНК A. m. caucasia и A. m. carpathica, тогда как сайт рестрикции XbaI (T↓CTAGA) в гене ND5 мтДНК в положении 7825–7830 относительно референсной последовательности A. m. ligustica был характерен только для A. m. caucasia, но не для A. m. carpathica. Данный сайт рестрикции мтДНК появился у A. m. caucasia благодаря SNP 7830C>A, которая изменила последовательность TCTAGC в TCTAGA – сайт распознавания XbaI.

В мтДНК медоносной пчелы подвидов A. caucasia и A. carpathica имеются 24 межгенных спейсера с общим размером 813 пн. Самый большой межгенный спейсер длиной 192 пн расположен между генами tRNA-Leu(UUR) и COX2. Размер этого межгенного спейсера вариабелен среди подвидов медоносной пчелы A. mellifera из разных линий: подвиды линии C имеют наименьший размер 191–192 пн, а подвиды линии O имеет больший размер 258–264 пн (рис. 2). Для сравнения, мтДНК A. cerana имеет 22 межгенных спейсера с общим размером 705 пн, где наиболее длинный межгенный спейсер размером 231 пн расположен между генами tRNA-Met и tRNA-Gln [64].

Сравнительный анализ выровненных последовательностей полной мтДНК A. m. caucasia и A. m. carpathica показал 17 инделов, 54 SNP, из которых 36 транзиций, 18 трансверсий. Кодирующие белок гены полной мтДНК A. m. caucasia и A. m. carpathica отличались друг от друга одним инделом, 33 SNP, из которых 27 транзиций (шесть приводили к аминокислотным заменам), шесть трансверсий (пять приводили к аминокислотным заменам). Была отмечена одна трансверсия в гене COX1, две трансверсии в гене COX2, одна трансверсия в COX3, две трансверсии в гене CYTB, четыре транзиции и одна трансверсия в гене ND1, три трансверсии в гене ND2, одна трансверсия в ND3, семь транзиций и одна трансверсия в гене ND4, две транзиции и две трансверсии в гене ND5, четыре транзиции и одна трансверсия в гене ND6. Гены рРНК A. m. caucasia и A. m. carpathica различались 17 инделами и одной транзицией. Гены тРНК A. m. caucasia и A. m. carpathica различались 10 инделами, двумя транзициями и одной трансверсией. Все межгенные некодирующие области A. m. caucasia и A. m. carpathica различались 27 инделами, шестью транзициями и 11 трансверсиями.

Для сравнения A. m. caucasia и A. m. carpathica с представителями A. m. ligustica (линия С) и A. m. syriaca (линия О) были рассчитаны % генетических различий, генетические дистанции Jukes–Cantor и число однонуклеотидных замен (SNP) полной последовательности мтДНК (табл. 3). Наибольшие различия A. m. caucasia и A. m. carpathica наблюдались с представителями внешней группы – A. cerana (20.3% генетических различий и 3346 SNP) и линии О – A. m. syriaca (2.3% генетических различий и 376 SNP). Наименьшие различия A. m. caucasia и A. m. carpathica наблюдались с представителями линии С – A. m. ligustica (1.1% генетических различий и 157 SNP). Пчелы A. m. caucasia и A. m. carpathica различались 127 SNP и содержали 0.8% генетических различий.

Таблица 3.

Генетические различия и дистанции (выше диагонали) и число замен нуклеотидов (ниже диагонали) между последовательностями полной мтДНК образцов A. m. caucasia, A. m. carpathica, A. m. ligustica и A. m. syriaca и внешней группы A. cerana

Образцы NC001566 A. m. ligustica (C) KX908209 A. m. ligustica (C) AP018404 A. m. caucasia (C) AP018403 A. m. carpathica (C) KP163643 A. m. syriaca (O) KY926882 A. m. syriaca (O) GQ162109 Apis cerana
генетические различия, %
(генетические дистанции Jukes–Cantor)
NC 001566
A. m. ligustica (C)
Число SNP, N *** 0.7 (0.001) 0.8 (0.005) 0.8 (0.005) 2.7 (0.014) 1.4 (0.012) 19.9 (0.164)
KX908209
A. m. ligustica (C)
137 *** 1.3 (0.005) 1.3 (0.005) 3.4 (0.015) 2.1 (0.012) 20.6 (0.164)
AP018404
A. m. caucasia (C)
89 216 *** 0.8 (0.005) 2.8 (0.015) 1.6 (0.012) 19.9 (0.164)
AP018403
A. m. carpathica (C)
104 221 127 *** 3.0 (0.014) 1.8 (0.012) 20 (0.164)
KP163643
A. m. syriaca (O)
454 565 477 503 *** 2.1 (0.006) 19.3 (0.162)
KY926882
A. m. syriaca (O)
218 331 247 279 322 *** 19.8 (0.160)
GQ162109
Apis cerana
3342 3459 3336 3357 3245 3300 ***

На основе попарных генетических дистанций Jukes–Cantor между последовательностями полной мтДНК была построена дендрограмма, отражающая филогенетические взаимоотношения представителей A. m. caucasia, A. m. carpathica, A. m. ligustica (линия С), A. m. syriaca (линия О) и внешней группы A. cerana (рис. 3). На дендрограмме представители подвидов линий С и О четко группируются раздельно, а A. cerana располагается во внешней группе.

Рис. 3.

Филогенетические отношения представителей A. m. caucasia, A. m. carpathica, A. m. ligustica и A. m. syriaca и внешней группы A. cerana на основе кластерного анализа полной мтДНК методом ближайшего соседа и генетических дистанций Jukes–Cantor. Цифрами обозначены значения бутстреп-анализа.

ОБСУЖДЕНИЕ

Генофонд популяции складывается из совокупности геномов всех особей, состояние которого оценивается с использованием маркеров ядерной и митохондриальной ДНК [29, 35]. Нуклеотидные последовательности полной мтДНК могут быть использованы для идентификации подвидов и филогенетических реконструкций [18, 19, 37, 54, 59, 70]. Сейчас полные последовательности мтДНК доступны в базе данных Генбанка для пяти видов пчел рода Apis: A. mellifera, A. cerana, A. dorsata, A. florea и A. koschevnikovi [24, 37, 64, 71, 72]. Сравнительный анализ полной мтДНК уже стал эффективным средством таксономической идентификации и может быть использован в сохранении генофонда локальных подвидов пчел [10, 24, 72].

Митохондриальные геномы A. m. caucasia и A. m. carpathica, сходно с мтДНК других перепончатокрылых, содержат 43% нуклеотида A, 41% – T, 6% – G, 10% – C, обогащены нуклеотидами AT на 85%, содержат наиболее высокие частоты динуклеотидов AA (19%), AT (18%), TT (18%) и TA (16%) и наиболее низкие частоты динуклеотидов GG (1%), GC (1%), CG (1%) и CC (2%) [24, 59, 64, 72, 73]. Среднее содержание GC в мтДНК A. m. caucasia и A. m. carpathica составляет 15%. Значение генетического разнообразия и вариабельности зависит прямо пропорционально от содержания GC – чем выше содержание GC, тем выше генетическое разнообразие и вариабельность генов. Содержание GC в мтДНК менее 40% считается низким [69]. В мтДНК A. m. caucasia и A. m. carpathica нет ни одного кодирующего белок гена с содержанием GC более 40%. Гены с наибольшим содержанием GC – COX1 (24%), COX2 (19.6%), CYTB (19.1%), COX3 (17.2%) и ND1 (17.2%) – могут стать информативными маркерами в филогенетических и популяционных исследованиях пчел (табл. 1).

Отношение транзиций к трансверсиям tr/tv является важнейшей характеристикой мутационного процесса. В мтДНК большинства животных транзиции происходят чаще трансверсий [68, 74]. Для большинства известных эукариот в норме отношение tr/tv > 1, в то время как tr/tv < 1 указывает на высокую частоту однонуклеотидных мутаций и инделов или низкую эффективность процесса репарации ДНК. Изменчивость отношения tr/tv в геноме может указывать в пользу локальной смены мутационного механизма в ходе адаптации к сменяющимся условиям среды обитания [7577].

Отношение tr/tv полной мтДНК было 2.05 между A. m. caucasia и A. m. carpathica, что сходно с соотношением tr/tv мтДНК 2.06 между Drosophila melanogaster и D. yakuba [78, 79]. Следовательно, мтДНК подвидов пчел A. m. caucasia и A. m. carpathica отражает процесс непрерывной адаптации к сменяющимся условиям среды обитания.

АT-обогащенная (содержание AT 96%) некодирующая область между генами 12S rRNA и tRNA-Ser мтДНК у A. m. caucasia и A. m. carpathica имеет размер 832 и 849 пн соответственно, что немного больше, чем у референсной последовательности A. m. ligustica размером 826 пн. Благодаря присутствию TATA, Poly-T и [TA(A)]n-подобных мотивов АT-обогащенная некодирующая область выполняет регуляторную функцию и участвует в инициации транскрипции и репликации генов мтДНК у медоносной пчелы [64].

Большинство эукариот имеют повторяющиеся мотивы в своих геномах, которые могут повторяться сотни раз и участвовать в регуляции в транскрипционной и посттранскрипционной регуляции экспрессии генов через микроРНК. В полной мтДНК A. m. caucasia и A. m. carpathica были обнаружены два повторяющихся 8-нуклеотидных мотива: мотив AATTAATT, повторяющийся 23 раза, и мотив AATAAATT, повторяющийся 50 раз, который может выполнять функцию транскрипционной и посттранскрипционной регуляции экспрессии генов. Эти два повторяющихся мотива отличаются друг от друга только одной трансверсией T > A в четвертой позиции.

Другая большая некодирующая область, расположенная между генами tRNA-Leu(UUR) и COX2, состоит из двух типов нуклеотидных последовательностей, названных P (51–69 пн) и Q (194–196 пн) элементами, где P-элемент может находиться в нескольких вариантах – P (52–54 пн), P0 (62–69 пн) и P1 (50–51 пн) (рис. 2). Межгенная область tRNA-Leu(UUR)–COX2 пчел эволюционных линий A, M и O включает P-элемент в сочетании с различным числом копий Q-элемента, что приводит к полиморфизму длины этого региона мтДНК. Подвиды пчел линии А содержат варианты P0 или P1 и 1–4 Q-элемента (размер 244–853 пн); подвиды пчел линии M содержат вариант P и 1–4 Q-элемента (размер 246–838 пн); подвиды пчел линии O содержат вариант P и 1–4 Q-элемента (размер 256–853 пн); подвиды пчел линии C не содержат P-элемента, а содержат только одну копию Q-элемента (размер 194–196 пн) [52]. Последовательности межгенной области tRNA-Leu(UUR)–COX2 A. m. caucasia и A. m. carpathica не содержали P-элемента и имели размер 192 пн, аналогично девяти представителям подвидов пчел A. m. carnica и A. m. ligustica линии C. Межгенные области tRNA-Leu(UUR)–COX2 восьми представителей пчел подвидов A. m. syriaca, A. m. lamarckii линии O содержали P-элемент и имели больший размер – 258–264 пн (рис. 2).

Выравнивание последовательностей межгенной области tRNA-Leu(UUR)–COX2 A. m. caucasia и A. m. carpathica с образцами из Генбанка показало, что A. m. carpathica сходен с образцом A. m. carnica (GQ433623) гаплотип C2j, а A. m. caucasica сходен с образцом A. m. carnica (JF934704) гаплотип C2. Таким образом подвиды пчел A. m. caucasia и A. m. carpathica являются представителями линии C, гаплотипы C2 и C2j соответственно (рис. 2).

Несмотря на большое сходство полной мтДНК A. m. caucasia и A. m. carpathica, они различались по 34 SNP в 11 генах: ND2 (752T>C, 936G>A, 1134T>C), COX1 (1933A>G), COX2 (3632C>T, 3767T>C), COX3 (5495A>T, 6040C>T), ND3 (6488G>A), ND5 (7408A>G, 7444T>C, 7587T>A, 7830A>C), ND4 (8660A>T, 8875A>G, 9394T>C, 9772T>C, 9789T>C, 9906C>T, 9919C>T, 9956C>T), ND6 (10539T>C, 10563T>A, 10596T>C, 10825C>T, 10902A>G), CYTB (11832T>C, 11999T>C), ND1 (12505G>A, 12620G>A, 12674C>T, 12971T>A, 13181C>T) и 12S rRNA (14996C>T). Позиции SNP были пронумерованы относительно референсной последовательности A. m. ligustica. Более того, сайт рестрикции XbaI, обнаруженный в гене ND5 в положении 7825–7830 относительно референсной последовательности, встречался только у подвида пчел A. m. caucasia и отсутствует у подвида пчел A. m. carpathica. Эти перечисленные маркеры мтДНК могут быть очень полезными при различении двух подвидов пчел A. m. caucasia и A. m. carpathica.

Подвиды пчел A. m. caucasia, A. m. carpathica, A. m. ligustica и A. m. syriaca между собой имеют 0.80% генетических различий и генетическую дистанцию Jukes–Cantor 0.005 (табл. 3). Было показано, что между подвидами насекомых диапазон генетических различий 0.80–8.00%, а генетических дистанций Jukes–Cantor 0.005–0.100 [24, 63, 64, 72, 80]. Сравниваемые образцы пчел между собой имеют генетические дистанции и различия, соответствующие различиям между подвидами насекомых. Следовательно, A. m. caucasia, A. m. carpathica, A. m. ligustica и A. m. syriaca – это действительно отдельные подвиды пчел, а не экотипы.

Матрица генетических дистанций Jukes–Cantor по полной последовательности мтДНК была использована в кластерном анализе для построения дендрограммы филогенетических отношений (табл. 3). Представитель внешней группы пчел A. cerana расположен на дендрограмме отдельно, как и предполагалось. На дендрограмме наблюдаются два крупных кластера. Первый кластер объединил представителей A. m. syriaca (KP163643, KY926882), относящихся к линии O. Второй кластер объединил представителей A. m. ligustica (NC_001566, KX908209), относящихся к линии C. Таким образом, дендрограмма на основе полной мтДНК позволяет четко дифференцировать пчел подвидов линий С и О. Объединение пчел A. m. caucasia и A. m. carpathica вместе с представителями A. m. ligustica в одну группу доказывает их принадлежность к линии C, как и предполагалось ранее некоторыми исследователями [29, 4547, 70] (рис. 3).

Таким образом, нами были определены нуклеотидные последовательности полной мтДНК пчел подвидов A. m. caucasia и A. m. carpathica размерами 16 341 и 16 336 пн соответственно. МтДНК обоих подвидов содержат 13 кодирующих белок генов, 22 гена тРНК, два гена рРНК и AT-обогащенную регуляторную область. Митохондриальные геномы A. m. caucasia и A. m. carpathica содержат 43% нуклеотида A, 41% – T, 6% – G, 10% – C нуклеотидов, обогащены AT на 85%. Отношение tr/tv полной мтДНК было 2.05 между A. m. caucasia и A. m. carpathica, что отражает процесс непрерывной адаптации к сменяющимся условиям среды обитания.

Большинство генов мтДНК (ND2, COX1, COX2, ATP8, ATP6, COX3, ND3, ND6, CYTB и 14 генов тРНК) расположены на тяжелой цепи, а меньшее число генов (ND1, ND4, ND4L, ND5, SrRNA, LrRNA и восемь генов тРНК) расположено на легкой цепи. Гены с наибольшим содержанием GC – COX1 (24%), COX2 (19.6%), CYTB (19.1%), COX3 (17.2%) и ND1 (17.2%) могут быть наиболее полиморфными и успешно использованы в филогенетических и популяционных исследованиях пчел.

По структуре межгенной области tRNA-Leu(UUR)–COX2 (отсутствие элемента P) подвиды пчел A. m. caucasia и A. m. carpathica могут быть отнесены к эволюционной линии С с гаплотипами C2 и C2j соответственно. Подвиды пчел A. m. caucasia и A. m. carpathica мтДНК могут быть дифференцированы друг от друга по 34 уникальным SNP в 11 генах мтДНК и маркеру рестрикции XbaI в гене ND5.

Пчелы A. m. caucasia и A. m. carpathica различаются между собой, а также от пчел A. m. ligustica и A. m. syriaca по полной мтДНК на 0.8% и имеют генетическую дистанцию Jukes–Cantor 0.005. Данные значения генетических дистанций Jukes–Cantor вписываются в пределы внутривидовых различий между подвидами насекомых. Следовательно, A. m. caucasia, A. m. carpathica – это действительно отдельные подвиды пчел, а не экотипы.

Несмотря на проведенные исследования, популяции A. m. caucasia и A. m. carpathica остаются недостаточно изученными как в России, так и странах Европы. Авторы надеются продолжить исследования пчел подвидов A. m. caucasia и A. m. carpathica в пределах их естественного ареала с целью определения структуры и генетического разнообразия популяций, предотвращения внутривидовой гибридизации и сохранения уникальности их локальных генофондов.

Авторы благодарны доктору Hisashi Okuyama за помощь в секвенировании.

Работа выполнена при поддержке государственного задания (регистрационный номер AAAA-A21-121011990120-7) – И.Р., грантов Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ) (грант № 19-54-70002 e-Asia_t) Н.А. и программ постдокторских исследований в Инчхонском Национальном университете за 2017–2019 годы – И.Р.

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Список литературы

  1. Delaplane K.S., Mayer D.F. Crop Pollination by Bees. CABI Publ., 2000. 344 p.

  2. Klein A.M., Vaissière B.E., Cane J.H. et al. Importance of pollinators in changing landscapes for world crops // Proc. Royal Society B: Biol. Sciences. 2007. V. 274. № 1608. P. 303–313. https://doi.org/10.1098/rspb.2006.3721

  3. Ollerton J., Erenler H., Edwards M., Crockett R. Extinctions of aculeate pollinators in Britain and the role of large-scale agricultural changes // Science. 2014. V. 346. № 6215. P. 1360–1362. https://doi.org/10.1126/science.1257259

  4. Papachristoforou A., Rortais A., Bouga M. et al. Genetic characterization of the cyprian honey bee (Apis mellifera cypria) based on microsatellites and mitochondrial DNA polymorphisms // J. Apicultural Sci. 2013. V. 57. № 2. P. 127–134. https://doi.org/10.2478/jas-2013-0023

  5. Tennant E., Chadwick F. The Bee Book. London: Dorling Kindersley Limited, 2016. 221 p.

  6. Ma W., Li X., Shen J. et al. Transcriptomic analysis reveals Apis mellifera adaptations to high temperature and high humidity // Ecotoxicol. Environm. Safety. 2019. V. 184. P. 109599. https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2019.109599

  7. Zhang G., St. Clair A.L., Dolezal A. et al. Honey bee (Hymenoptera: Apidea) pollen forage in a highly cultivated agroecosystem: Limited diet diversity and its relationship to virus resistance // J. Econ. Entomol. 2020. V. 113. № 3. P. 1062–1072. https://doi.org/10.1093/jee/toaa055

  8. Scott-Brown A., Koch H. New directions in pollinator research: diversity, conflict and response to global change // Emerg. Top. Life Sci. 2020. V. 4. № 1. P. 1–6. https://doi.org/10.1042/etls20200123

  9. Ильясов Р.А., Поскряков А.В., Петухов А.В., Николенко А.Г. Генетическая дифференциация локальных популяций темной лесной пчелы Apis mellifera mellifera L. на Урале // Генетика. 2015 Т. 51. № 7. С. 792–798. https://doi.org/10.7868/s0016675815070048

  10. Ильясов Р.А., Поскряков А.В., Петухов А.В., Николенко А.Г. Молекулярно-генетический анализ пяти сохранившихся резерватов темной лесной пчелы Apis mellifera mellifera Урала и Поволжья // Генетика. 2016. Т. 52. № 8. С. 931–942. https://doi.org/10.7868/s0016675816060059

  11. Iwasa T., Motoyama N., Ambrose J.T., Roe R.M. Mechanism for the differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis mellifera // Crop Protection. 2004. V. 23. № 5. P. 371–378. https://doi.org/10.1016/j.cropro.2003.08.018

  12. Decourtye A., Devillers J., Cluzeau S. et al. Effects of imidacloprid and deltamethrin on associative learning in honeybees under semi-field and laboratory conditions // Ecotoxicol. Environm. Safety. 2004. V. 57. № 3. P. 410–419. https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2003.08.001

  13. Aubert M., Ball B., Fries I. Virology and the Honey Bee. Northern Bee Books, 2008. 458 p. ISBN: 9279005863

  14. Genersch E., Evans J.D., Fries I. Honey bee disease overview // J. Invertebrate Pathol. 2010. V. 103. Suppl. 1. P. 2–4. https://doi.org/10.1016/j.jip.2009.07.015

  15. Cornman R.S., Tarpy D.R., Chen Y. et al. Pathogen webs in collapsing honey bee colonies // PLoS One. 2012. V. 7. № 8. P. e43562. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043562

  16. van der Zee R., Pisa L., Andonov S. et al. Managed honey bee colony losses in Canada, China, Europe, Israel and Turkey, for the winters of 2008–9 and 2009–10 // J. Apicultural Res. 2012. V. 51. № 1. P. 100–114. https://doi.org/10.3896/IBRA.1.51.1.12

  17. Haddad N.J., Batainh A., Saini D. et al. Evaluation of Apis mellifera syriaca Levant region honeybee conservation using comparative genome hybridization // Genetica. 2016. V. 144. № 3. P. 279–287. https://doi.org/10.1007/s10709-016-9897-y

  18. Franck P., Garnery L., Celebrano G. et al. Hybrid origins of honeybees from Italy (Apis mellifera ligustica) and Sicily (A. m. sicula) // Mol. Ecol. 2000. V. 9. № 7. P. 907–921. https://doi.org/10.1046/j.1365-294X.2000.00945.x

  19. Palmer M.R., Smith D.R., Kaftanoğlu O. Turkish honeybees: Genetic variation and evidence for a fourth lineage of Apis mellifera mtDNA // J. Heredity. 2000. V. 91. № 1. P. 42–46. https://doi.org/10.1093/jhered/91.1.42

  20. Uzunov A., Kiprijanovska H., Andonov S. et al. Morphological diversity and racial determination of the honey bee (Apis mellifera L.) population in the Republic of Macedonia // J. Apicultural Res. 2009. V. 48. № 3. P. 196–203. https://doi.org/10.3896/IBRA.1.48.3.08

  21. Potts S.G., Biesmeijer J.C., Kremen C. et al. Global pollinator declines: trends, impacts and drivers // Trends in Ecol. Evol. 2010. V. 25. № 6. P. 345–353. https://doi.org/10.1016/j.tree.2010.01.007

  22. Oleksa A., Chybicki I., Tofilski A., Burczyk J. Nuclear and mitochondrial patterns of introgression into native dark bees (Apis mellifera mellifera) in Poland // J. Apicultural Res. 2011. V. 50. № 2. P. 116–129. https://doi.org/10.3896/IBRA.1.50.2.03

  23. Özdil F., Aytekin I., Ilhan F., Boztepe S. Genetic variation in turkish honeybees Apis mellifera anatoliaca, A. m. caucasica, A. m. meda (Hymenoptera: Apidae) inferred from RFLP analysis of three mtDNA regions (16S rDNA-COI-ND5) // Eur. J. Entomol. 2012. V. 109. № 2. P. 161–167. https://doi.org/10.14411/eje.2012.021

  24. Ilyasov R., Nikolenko A., Tuktarov V. et al. Comparative analysis of mitochondrial genomes of the honey bee subspecies A. m. caucasica and A. m. carpathica and refinement of their evolutionary lineages // J. Apicultural Res. 2019. V. 58. № 4. P. 567–579. https://doi.org/10.1080/00218839.2019.1622320

  25. Spinola S.M. Insectorum Liguriae. Genoa, Italy: P. Cajetani, 1806. 160 p.

  26. Pollmann A. Werth der verschiedenen Bienenracen und deren Varietaten, bestimmt durch Urtheile namhafter Bienenzuchter. Leipzig, Germany: Voigt, 1889. 100 p.

  27. Foti N., Lungu M., Pelimon P. et al. Studies on the morphological characteristics and biological traits of the bee populations in Romania // The 20th Intern. Beekeeping Jubilee Congress Apimondia. Bucharest, Romania: Apimondia, 1965. V. 20. P. 182–188.

  28. Ivanova E.N., Bienkowska M., Petrov P.P. Allozyme polymorphism and phylogenetic relationships in Apis mellifera subspecies selectively reared in Poland and Bulgaria // Folia Biologica. 2011. V. 59. № 3–4. P. 121–126. https://doi.org/10.3409/fb59_3-4.121-126

  29. Bouga M., Alaux C., Bienkowska M. et al. A review of methods for discrimination of honey bee populations as applied to European beekeeping // J. Apicultural Res. 2011. V. 50. № 1. P. 51–84. https://doi.org/10.3896/IBRA.1.50.1.06

  30. Aizen M.A., Morales C.L., Vázquez D.P. et al. When mutualism goes bad: Density-dependent impacts of introduced bees on plant reproduction // New Phytologist. 2014. V. 204. № 2. P. 322–328. https://doi.org/10.1111/nph.12924

  31. Ollerton J., Winfree R., Tarrant S. How many flowering plants are pollinated by animals? // Oikos. 2011. V. 120. № 3. P. 321–326. https://doi.org/10.1111/j.1600-0706.2010.18644.x

  32. Tandon V., Kumar A., Rana C. Pollination – its type, threats and role in environment conservation // Intern. J. Current Res. 2016. V. 8. № 8. P. 35744–35751. https://www.journalcra.com/article/pollination–its-type-threats-and-role-environment-conservation.

  33. Natsopoulou M.E., McMahon D.P., Doublet V. et al. The virulent, emerging genotype B of Deformed wing virus is closely linked to overwinter honeybee worker loss // Sci. Reports. 2017. V. 7. № 1. P. 5242. https://doi.org/10.1038/s41598-017-05596-3

  34. Péntek-Zakar E., Oleksa A., Borowik T., Kusza S. Population structure of honey bees in the Carpathian Basin (Hungary) confirms introgression from surrounding subspecies // Ecol. Evol. 2015. V. 5. № 23. P. 5456–5467. https://doi.org/10.1002/ece3.1781

  35. Kukrer M., Kence M., Kence A. Genetic evidences for the impact of anthropogenic factors on honey bee diversity // bioRxiv. 2017. P. 154195. https://doi.org/10.1101/154195

  36. Maa T.C. An inquiry into the systematics of the tribus Apidini or honeybees (Hym.) // Treubia. 1953. V. 21. P. 525–640.

  37. Arias M.C., Sheppard W.S. Molecular phylogenetics of honey bee subspecies (Apis mellifera L.) inferred from mitochondrial DNA sequence // Mol. Phylogenet. Evol. 1996. V. 5. № 3. P. 557–566. https://doi.org/10.1006/mpev.1996.0050

  38. Smith D.R., Slaymaker A., Palmer M., Kaftanoǧlu O. Turkish honey bees belong to the east Mediterranean mitochondrial lineage // Apidologie. 1997. V. 28. № 5. P. 269–274. https://doi.org/10.1051/apido:19970503

  39. Kandemir I., Özkan A., Fuchs S. Reevaluation of honeybee (Apis mellifera) microtaxonomy: a geometric morphometric approach // Apidologie. 2011. V. 42. № 5. P. 618–627. https://doi.org/10.1007/s13592-011-0063-3

  40. Engel M.S. The taxonomy of recent and fossil honey bees (Hymenoptera: Apidae; Apis) // J. Hymenoptera Res. 1999. V. 8. № 2. P. 165–196. https://doi.org/10.1007/978-1-4614-4960-7_18

  41. Cauia E., Usurelu D., Magdalena L.M. et al. Preliminary researches regarding the genetic and morphometric characterization of honeybees (A. mellifera L.) from Romania // Lucrări Ştiinţifice Zootehnie Şi Biotehnologii. 2008. V. 41. № 2. P. 278–286.

  42. Mărghitaş L.A., Teleky O., Dezmirean D. et al. Morphometric differences between honey bees Apis mellifera carpatica populations from Transylvanian area // Lucrări Ştiinţifice Zootehnie Şi Biotehnologii. 2008. V. 41. P. 309–315.

  43. Teleky O.R., Bojan C., Moise A. et al. Ecotypes differentiation within honeybee (Apis mellifera carpatica) from Transylvania // Bul. Univ. Agricultural Sci. and Veterinary Med. Cluj-Napoca – Animal Sci. and Biotechnol. 2007. V. 64. № 1–2. P. 195–200. https://doi.org/10.15835/buasvmcn-asb:64:1-2:2256

  44. Mărghitaş L.A., Dezmirean D., Teleky O. et al. Biodiversity testing of Transylvanian honeybee populations using mtDNA markers // Bul. Univ. Agricultural Sci. and Veterinary Med. Cluj-Napoca – Animal Sci. and Biotechnol. 2009. V. 66. P. 402–406. https://doi.org/10.15835/buasvmcn-asb:66:1-2:3391

  45. Mărghitaş L.A., Coroian C., Dezmirean D. et al. Genetic diversity of honeybees from Moldova (Romania) based on mtDNA analysis // Bul. Univ. Agricultural Sci. and Veterinary Med. Cluj-Napoca – Animal Sci. and Biotechnol. 2010. V. 67. № 1–2. P. 396–402. https://doi.org/10.15835/buasvmcn-asb:67:1-2:5330

  46. Coroian C.O., Muñoz I., Schlüns E.A. et al. Climate rather than geography separates two European honeybee subspecies // Mol. Ecol. 2014. V. 23. № 9. P. 2353–2361. https://doi.org/10.1111/mec.12731

  47. Syromyatnikov M.Y., Borodachev A.V., Kokina A.V., Popov V.N. A molecular method for the identification of honey bee subspecies used by beekeepers in Russia // Insects. 2018. V. 9. № 1. P. 10. https://doi.org/10.3390/insects9010010

  48. Ruttner F. Biogeography and Taxonomy of Honeybees. Berlin, Heidelberg: Springer, 1988. 288 p. ISBN: 978-3-642-72651-4

  49. Adl M., Gençer H.V., Firatli Ç., Bahreini R. Morphometric characterization of Iranian (Apis mellifera meda), Central Anatolian (Apis mellifera anatoliaca) and Caucasian (Apis mellifera caucasica) honey bee populations // J. Apicultural Res. 2007. V. 46. № 4. P. 225–231. https://doi.org/10.3896/IBRA.1.46.4.03

  50. Meixner M.D., Worobik M., Wilde J. et al. Apis mellifera mellifera in eastern Europe – morphometric variation and determination of its range limits // Apidologie. 2007. V. 38. № 2. P. 191–197. https://doi.org/10.1051/apido:2006068

  51. Cornuet J.M., Garnery L. Mitochondrial DNA variability in honeybees and its phylogeographic implications // Apidologie. 1991. V. 22. № 6. P. 627–642. https://doi.org/10.1051/apido:19910606

  52. Garnery L., Cornuet J.M., Solignac M. Evolutionary history of the honey bee Apis mellifera inferred from mitochondrial DNA analysis // Mol. Ecol. 1992. V. 1. № 3. P. 145–154. https://doi.org/10.1111/j.1365-294X.1992.tb00170.x

  53. Koulianos S., Crozier R.H. Mitochondrial sequence characterisation of Australian commercial and feral honeybee strains, Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae), in the context of the species worldwide // Austr. J. Entomol. 1997. V. 36. № 4. P. 359–364. https://doi.org/10.1111/j.1440-6055.1997.tb01486.x

  54. Smith D.R., Harris A., Johnson J. et al. Animal antibiotic use has an early but important impact on the emergence of antibiotic resistance in human commensal bacteria // Proc. Natl Acad. Sci. 2002. V. 99. № 9. P. 6434–6439.

  55. Алпатов В.В. Породы медоносной пчелы и их использование в сельском хозяйстве. МОИП, 1948. 183 с.

  56. Bernt M., Donath A., Jühling F. et al. MITOS: Improved de novo metazoan mitochondrial genome annotation // Mol. Phylogenet. Evol. 2013. V. 69. № 2. P. 313–319. https://doi.org/10.1016/j.ympev.2012.08.023

  57. Lowe T.M., Eddy S.R. TRNAscan-SE: A program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence // Nucl. Acids Res. 1996. V. 25. № 5. P. 955–964. https://doi.org/10.1093/nar/25.5.0955

  58. Kumar S., Stecher G., Tamura K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets // Mol. Biol. Evol. 2016. V. 33. № 7. P. 1870–1874. https://doi.org/10.1093/molbev/msw054

  59. Crozier R.H., Crozier Y.C. The mitochondrial genome of the honeybee Apis mellifera: Complete sequence and genome organization // Genetics. 1993. V. 133. № 1. P. 97–117. https://doi.org/10.1111/j.1365-2583.1993.tb00131.x

  60. Kim J.S., Kim M.J., Kim I. The complete mitochondrial genome of Italian honey bees Apis mellifera ligustica (Hymenoptera: Apidae) // GenBank: KX908209. 2016. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KX908209.

  61. Skorikov A.S. Beitrage zur Kenntnis der Kenntnis der kaukasischen Honigbienenrassen // Reports of Applied Entomol. 1929. V. 4. P. 1–59.

  62. Haddad N.J. Mitochondrial genome of the levant region honeybee, Apis mellifera syriaca (Hymenoptera: Apidae) // Mitochondrial DNA Part A: DNA Mapping, Sequencing, and Analysis. 2016. V. 27. № 6. P. 4067–4068. https://doi.org/10.3109/19401736.2014.1003846

  63. Eimanifar A., Kimball R.T., Braun E.L. et al. The complete mitochondrial genome of the Egyptian honey bee, Apis mellifera lamarckii (Insecta: Hymenoptera: Apidae) // Mitochondrial DNA Part B. 2017. V. 2. № 1. P. 270–272. https://doi.org/10.1080/23802359.2017.1325343

  64. Tan H.W., Liu G.H., Dong X. et al. The complete mitochondrial genome of the asiatic cavity-nesting honeybee Apis cerana (Hymenoptera: Apidae) // PLoS One. 2011. V. 6. № 8. P. e23008. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0023008

  65. Cockerell T.D.A. A fossil honey-bee // Entomologist. 1906. V. 40. P. 221–229.

  66. Jukes T.H., Cantor C.R. Evolution of protein molecules // Mammalian Protein Metabolism / Ed. Munro H.N. N.Y., USA: Acad. Press, 1969. P. 21–132.

  67. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol. Biol. Evol. 1987. V. 4. P. 406–425. https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.molbev.a040454

  68. Clary D.O., Wolstenholme D.R. The mitochondrial DNA molecule of Drosophila yakuba: Nucleotide sequence, gene organization, and genetic code // J. Mol. Evol. 1985. V. 22. № 3. P. 252–271. https://doi.org/10.1007/BF02099755

  69. Kent C.F., Minaei S., Harpur B.A., Zayed A. Recombination is associated with the evolution of genome structure and worker behavior in honey bees // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2012. V. 109. № 44. P. 18012–18017. https://doi.org/10.1073/pnas.1208094109

  70. Özdil F., Yildiz M.A. Molecular characterization of Turkish honey bee populations (Apis mellifera) inferred from mitochondrial DNA RFLP and sequence results // Apidologie. 2009. V. 40. № 5. P. 570–576. https://doi.org/10.1051/apido/2009032

  71. Rand D.M., Kann L.M. Mutation and selection at silent and replacement sites in the evolution of animal mitochondrial DNA // Genetica. 1998. V. 102–103. P. 393–407. https://doi.org/10.1007/978-94-011-5210-5_32

  72. Ilyasov R.A., Park J., Takahashi J., Kwon H.W. Phylogenetic uniqueness of honeybee apis cerana from the Korean peninsula inferred from the mitochondrial, nuclear, and morphological data // J. Apicultural Sci. 2018. V. 62. № 2. P. 189–214. https://doi.org/10.2478/JAS-2018-0018

  73. Okuyama H., Tingek S., Takahashi J.I. The complete mitochondrial genome of the cavity-nesting honeybee, Apis cerana (Insecta: Hymenoptera: Apidae) from Borneo // Mitochondrial DNA Part B: Resources. 2017. V. 2. № 2. P. 475–476. https://doi.org/10.1080/23802359.2017.1361344

  74. DeSalle R., Freedman T., Prager E.M., Wilson A.C. Tempo and mode of sequence evolution in mitochondrial DNA of Hawaiian Drosophila // J. Mol. Evol. 1987. V. 26. № 1–2. P. 157–164. https://doi.org/10.1007/BF02111289

  75. Tian D., Wang Q., Zhang P. et al. Single-nucleotide mutation rate increases close to insertions/deletions in eukaryotes // Nature. 2008. V. 455. № 7209. P. 105–108. https://doi.org/10.1038/nature07175

  76. McDonald M.J., Wang W.C., Huang H.D., Leu J.Y. Clusters of nucleotide substitutions and insertion/deletion mutations are associated with repeat sequences // PLoS Biology. 2011. V. 9. № 6. P. e1000622. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1000622

  77. Koren A., Polak P., Nemesh J. et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation // Am. J. Hum. Genet. 2012. V. 91. № 6. P. 1033–1040. https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2012.10.018

  78. Keightley P.D., Trivedi U., Thomson M. et al. Analysis of the genome sequences of three Drosophila melanogaster spontaneous mutation accumulation lines // Genome Res. 2009. V. 19. № 7. P. 1195–1201. https://doi.org/10.1101/gr.091231.109

  79. Seplyarskiy V.B., Kharchenko P., Kondrashov A.S., Bazykin G.A. Heterogeneity of the transition/transversion ratio in drosophila and hominidae genomes // Mol. Biol. Evol. 2012. V. 29. № 8. P. 1943–1955. https://doi.org/10.1093/molbev/mss071

  80. Han T., Lee W., Lee S. et al. Reassessment of species diversity of the subfamily Denticollinae (Coleoptera: Elateridae) through DNA barcoding // PLoS One. 2016. V. 11. № 2. P. e0148602. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148602

Дополнительные материалы отсутствуют.