Генетика, 2021, T. 57, № 6, стр. 728-732

Kalopanax septemlobus (Thunb.) Koidz., калопанакс семилопастной, или диморфант (синоним Kalopanax pictus) – листопадное, умеренно-теплолюбивое дерево, представитель монотипного реликтового рода Kalopanax Miq. семейства Araliaceae Juss. [1, 2]. Распространен в Северо-Восточной Азии, куда входят Центральный и Восточный Китай, п-ов Корея, острова Японского архипелага и южная часть российского Дальнего Востока (РДВ) [3–5]. Юг РДВ является северной границей распространения K. septemlobus; вид встречается на юге Приморского края, в юго-западной части о-ва Сахалин и на южных о-вах (Кунашир, Итуруп, Шикотан) Курильского архипелага [3, 6 ]. Вид занесен в федеральную и региональные Красные книги [6, 7 ], статус 3 (R) – редкий вид, представленный небольшими популяциями, которые в настоящее время не находятся под угрозой исчезновения и не являются уязвимыми, но рискуют оказаться таковыми. K. septemlobus является ценным медоносом и имеет декоративный внешний вид [8], содержит множество биологически активных веществ, что делает его потенциальным источником пищевых и лекарственных соединений [3, 9]. В настоящее время многие местообитания K. septemlobus на РДВ уничтожаются или деградируют из-за строительства, высокой рекреационной нагрузки и пожаров [10].

В целях сохранения этого уникального вида становится актуальным его искусственное разведение, но при культивировании растений, как правило, происходит обеднение генофонда. Так, популяционно-генетические исследования с использованием разных методов анализа (аллозимный, RAPD, ISSR, nrSSRs) выявили относительно высокий уровень генетического разнообразия в природных популяциях K. septemlobus Южной Кореи и Японии [11–13] и сравнительно низкий у культивируемых форм [14]. Огромный интерес представляет собой комплексное исследование образцов K. septemlobus из Центрального, Восточного и Западного Китая, Корейского п-ова и Японского архипелага с использованием SSR-маркеров ядерной ДНК, межгенных спейсеров psbA–trnH, rpl32–trnL и trnS–trnfM хлоропластной ДНК (хпДНК) и моделирования палеораспределения для восстановления биогеографической истории этого вида [15]. Полученные результаты являются доказательством существования множества ледниковых рефугиумов в Китае, Южной Японии и самой южной части Корейского п-ва; самые северные популяции K. septemlobus на о-ве Хоккайдо и на севере Корейского п-ва имеют постледниковое происхождение; общая генетическая структура широкоареального K. septemlobus в Восточной Азии сформировалась под воздействием колебаний четвертичного климата в условиях неоднородного ландшафта [15]. Популяционно-генетические исследования K. septemlobus на территории РДВ ранее не проводились.

Цель настоящей работы – изучение генетического разнообразия и структуры краевых популяций умеренно-теплолюбивого вида K. septemlobus на северной границе его распространения (юг РДВ), а также выявление генетических связей с представителями из основного ареала вида по данным полиморфизма хпДНК.

Индивидуальные препараты тотальной ДНК выделены CTAB-методом [16] с небольшими модификациями из листовой ткани 59 образцов K. septemlobus, собранных из 15 природных мест произрастания в Приморском крае и на о. Сахалин (табл. 1). Амплификацию некодирующих регионов psbA–trnH, rpl32–trnL и trnS–trnfM хпДНК проводили с использованием универсальных праймеров и реакционных условий, рекомендованных для этих участков с использованием “медленной и холодной” ПЦР-программы [17, 18]. Нуклеотидные последовательности цепей регионов хпДНК определяли на генетическом анализаторе ABI 3500 (Applied Biosystems, USA), затем редактировали в Chromas 2.4.4 (http://technelysium.com.au/wp/chromas), выравнивали и объединяли в одну матрицу, используя пакет программ MEGA ver. X [19]. Число гаплотипов, нуклеотидное (π) и гаплотипическое (h) разнообразие (для популяций с числом образцов пять и более), распределение генетической изменчивости внутри и между популяциями (Φ_ST, анализ молекулярной дисперсии, AMOVA) рассчитывали с помощью программы Arlequin v. 3.5 [20]. Генеалогические связи гаплотипов анализировали методом медианного связывания (Median-Joining, MJ) в программе Network 10.1 [21].

Для 59 растений K. septemlobus определены нуклеотидные последовательности трех межгенных спейсеров хпДНК. Длина региона psbA–trnH у всех образцов составила 448 пн, нуклеотидных замен нет. Спейсер rpl32–trnL у всех растений имел длину 840 пн и одну замену С→А в позиции 321 в пяти образцах. У trnS–trnfM выявлено два варианта длины – 726 и 720 пн, – вследствие присутствия вставки/делеции (индель), замен нет. У всех образцов из Приморского края спейсер trnS-trnfM длиной 726 пн, а образцы с о. Сахалин имели оба варианта. Длина объединенных последовательностей трех регионов хпДНК составила 2014 пн, из них 2007 – мономорфные сайты, один сайт вариабельный и информативный согласно методу максимальной экономии, индель длиной 6 пн. Нуклеотидные замены и индельные вариации позволили выявить три гаплотипа у K. septemlobus на юге РДВ (табл. 1). Последовательности регионов psbA–trnH, rpl32–trnL и trnS–trnfM хпДНК каждого гаплотипа депонированы в ENA/EMBL-EBI (номера для H1 – LR860506, LR860509 и LR860512; H2 – LR860508, LR860510 и LR860513; H3 – LR860507, LR860511 и LR860514 соответственно). Гаплотипы H1 и H2 обнаружены в Приморском крае и на о. Сахалин, а гаплотип H3 – только на о. Сахалин. В Приморском крае широко распространен гаплотип Н1, частота встречаемости которого составила 92.4%, и только в популяции из бухты Витязь четыре образца имели гаплотип Н2. На о. Сахалин в выборке с перевала Невельский у пяти деревьев обнаружен гаплотип H3, а у одного – гаплотип Н1; у образца из бассейна р. Китосия, расположенного в 40 км южнее, обнаружен гаплотип Н2. На рис. 1,а приведена медианная сеть генеалогических связей гаплотипов K. septemlobus РДВ. Одна нуклеотидная замена разделяет гаплотипы Н1 и Н2, индель разделяет гаплотипы Н1 и Н3.

Рис. 1.

Медианные сети гаплотипов хпДНК Kalopanax septemlobus: а – российский Дальний Восток. Размер окружностей отражает примерную частоту встречаемости гаплотипов, черная пересекающая линия – точечная мутация, белый пересекающий блок – делеция нуклеотидов; б – Восточная Азия по [15].

Из 13 выборок K. septemlobus в Приморском крае только три выборки были с числом образцов пять и более (табл. 1), для которых и были рассчитаны показатели генетического разнообразия. Популяции из окрестностей Владивостока и о. Русский оказались мономорфными, а популяция из окрестностей бухты Витязь характеризовалась низким уровнем как гаплотипического (h = 0.382), так и нуклеотидного разнообразия (π = 0.0002). Параметры генетического разнообразия общей выборки, включающей все исследуемые образцы из Приморского края, оказались еще более низкими (табл. 1).

Сахалинская популяция K. septemlobus с перевала Невельский имела практически такой же уровень гаплотипического (h = 0.400), но более высокий уровень нуклеотидного (π = 0.0012) разнообразия по сравнению с выборкой из бухты Витязь Приморского края. Общая выборка с о. Сахалин характеризовалась средними параметрами (h = 0.600, π = 0.0018) генетического разнообразия (табл. 1). Полученные данные о нуклеотидном разнообразии в суммарных выборках Приморского края и о. Сахалин (0.0001 и 0.0018 соответственно) согласуются с таковыми для основного ареала. Так, для группы популяций Юго-Западного Китая нуклеотидное разнообразие составило 0.00064, для группы Северо-Западный Китай–Окинава – 0.00019, для группы Восточный Китай–п-ов Корея–Японский архипелаг – 0.00021 [15]. Низкое генетическое разнообразие или отсутствие такового у хлоропластного генома в популяциях Приморского края может указывать на относительно недавнее происхождение от малого числа основателей.

По результатам AMOVA генетическая дифференциация между общими выборками из двух географических регионов РДВ составила 86% (Φ_ST = 0.857, P < 0.0001) и является следствием экстремально низкого потока генов между ними, что обусловлено изоляцией расстоянием. Такая же высокая генетическая дифференциация была выявлена между тремя географическими группами популяций K. septemlobus из основного ареала (F_CT = 0.84) [15].

Нуклеотидные последовательности гаплотипов H1–H3 у K. septemlobus, произрастающего на территории Приморского края и о. Сахалин, оказались идентичны последовательностям гаплотипов H1–H3 основного ареала вида [15]. Генеалогические связи гаплотипов K. septemlobus в Восточной Азии представлены на рис. 1,б. Гаплотип Н1 является анцестральным и широко распространенным как на основном ареале (fig. 3b по [15]), так и на его северной границе (рис. 1). Гаплотип Н2, обнаруженный в популяции бухты Витязь Приморского края, распространен также на японских о-вах Хоккайдо и Хонсю и на горе Цзыцзинь (Нанкин) в Восточном Китае [15]. На территории между материковыми популяциями бухты Витязь и горы Цзыцзинь, расположенных друг от друга на расстоянии около 1600 км, выявлен только гаплотип Н1. Мы предполагаем, что возможны несколько вариантов возникновения гаплотипа Н2 в популяции бухты Витязь: во-первых, деревья с гаплотипом Н2 в ближайших популяциях-донорах могли исчезнуть под воздействием природных или антропогенных факторов; во-вторых, гаплотип мог возникнуть в результате случайной мутации при расселении особей с гаплотипом Н1; в-третьих, нельзя исключить возможность заноса семян с гаплотипом Н2 птицами с северных японских островов [22, 23]. Гаплотип Н3, выявленный на о. Сахалин, также присутствует на о-вах Хоккайдо и Хонсю [15].

Известно, что на юге Приморского края представители K. septemlobus произрастали еще в нижнем миоцене [24], когда шло формирование Японского моря и дифференциация о. Сахалин и Японских о-вов от континента [25]. Климатические флуктуации, особенно в последний плейстоценовый ледниковый период, способствовали смещению северной границы ареала K. septemlobus к югу, в то время как большинство популяций в Центральном Китае и на южных островах Японского архипелага, вероятно, сохранили свою локализацию [15]. Таким образом, выявленная нами низкая вариабельность хлоропластного генома K. septemlobus обусловлена реколонизацией территории Приморского края более южными популяциями. Более высокая генетическая изменчивость K. septemlobus на о. Сахалин, чем в Приморском крае, связана с его распространением в послеледниковый период из нескольких рефугиумов, существовавших на Японских островах, через мосты суши [15, 25]. Полученные молекулярно-генетические данные могут быть использованы для разработки программ по сохранению этого редкого и ценного вида дальневосточной флоры, а также для разработки мероприятий по рациональному природопользованию.

Исследование выполнено при финансовой поддержке программы Президиума РАН “Дальний Восток” (проекты № 18-4-011).

Авторы выражают благодарность В.Ю. Баркалову, А.С. Майоровой (ННЦМБ ДВО РАН), Е.М. Булах, Т.Ю. Горпенченко за помощь в сборе материала.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.