Генетика, 2021, T. 57, № 9, стр. 1039-1053

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом служили 124 растения, относящиеся к шести видам: O. tragacanthoides (20 образцов) секции Hystrix подрода Tragacanthoxytropis, O. coerulea (18), O. filiformis (20) и O. mandshurica (34) секции Janthina, O. deflexa (25) и O. glabra (7) секции Mesogaea подрода Phacoxytropis из 22 природных местонахождений (табл. 1, рис. 1). Названия видов, секций и подродов рода Oxytropis приведены согласно обработке Малышева [5].

Рис. 1.

Карта-схема с указанием мест сбора растений видов Oxytropis tragacanthoides секции Hystrix подрода Tragacanthoxytropis, O. coerulea, O. filiformis и O. mandshurica секции Janthina, O. deflexa и O. glabra секции Mesogaea подрода Phacoxytropis из 22 природных местонахождений. Код популяции см. табл. 1.

ДНК экстрагировали из лиофильно высушенных листьев. Буфер для экстракции содержал 100 мM Трис-HCl (pH 8.0), 0.7 M NaCl, 40 мМ EDTA, 1% СTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide) и 10 мл/л β-меркаптоэтанола. Экстракт инкубировали при 65°С в течение 40 мин. ДНК депротеинизировали смесью хлороформ : октанол (24 : 1) и осаждали равным объемом изопропанола в присутствии 0.3 M ацетата натрия. ДНК промывали 75%-ным этанолом и растворяли в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCl (рН 8.0) и 1 мМ EDTA. Количество ДНК в образце определяли путем сравнения с ДНК фага лямбда известной концентрации методом электрофореза в 1.4%-ном агарозном геле [10]. Методы амплификации межгенных спейсеров psbA–trnH, trnL–trnF и trnS–trnG приведены в наших предыдущих работах [8, 12, 13]. ITS регион рДНК амплифицирован с праймерами ITS1 и ITS4 в реакционных условиях и температурном режиме, приведенных в работе [18]. Циклическое секвенирование обеих цепей фрагментов ДНК осуществляли с использованием набора флуоресцентно меченых нуклеотидов Big Dye Terminator v. 3.1 (Applied Biosystems, США). Нуклеотидные последовательности прямых и обратных цепей определяли на генетическом анализаторе ABI 3500 (Applied Biosystems), затем редактировали и собирали с помощью пакета программ Staden Package v. 1.5 [19]. Для каждого образца последовательности регионов выравнивали в программе SeaView v. 4.7 [20].

Матрицу объединенных последовательностей трех спейсеров хпДНК использовали для расчета гаплотипического (h) и нуклеотидного (π) разнообразия (для популяций с числом образцов пять и более), степени дивергенции (Dxy) между популяциями/видами на основе нуклеотидных замен, для анализа молекулярной дисперсии (AMOVA) и для идентификации гаплотипов с помощью пакетов программ Arlequin v. 3.5 [21] и DnaSP v. 5.0 [22]. Статистическую значимость (P) индексов фиксации (Φ_ST) оценивали на основе 1023 пермутаций. Филогенетический анализ проводили методами ML, MP и NJ с помощью пакета программ PAUP v. 4.0b10 [23]. Оптимальную модель эволюции нуклеотидных замен для ML-анализа выбирали в программе Modeltest v. 3.06 [24] с использованием иерархических тестов. Для ML и MP анализов применяли эвристический поиск оптимальной топологии с алгоритмом TBR (Tree Bisection-Reconnection). Статистическую достоверность порядка ветвления оценивали с помощью бутстреп-анализа 1000 альтернативных деревьев (BP, %). Кроме того, был использован баесовский подход (Bayesian Inference, BI) в программе MrBayes 3.1.6 [25] на портале CIPRES (http://www.phylo.org/) [26]. Для оценки достоверности определены апостериорные вероятности (Posterior Probabilities, РР). Значения BP < 50% и РР < 0.95 не рассматривались. В качестве внешней группы были использованы полученные нами ранее [8] нуклеотидные последовательности этих же спейсеров (LM653198, LM653161, LM653235) A. davuricus (Pall.) DC. Генеалогические связи риботипов ITS рДНК анализировали методом медианного связывания (MJ) в программе Network v. 5.0.1.1 [27], кодируя каждую делецию/вставку, независимо от ее размера, как единичное мутационное событие. В качестве внешней группы была использована полученная нами ранее последовательность ITS (LM653272) A. davuricus.

Работа проводилась с использованием оборудования ЦКП “Биотехнология и генетическая инженерия” ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Нуклеотидные последовательности каждого из регионов psbA–trnH, trnL–trnF и trnS–trnG хпДНК у 124 образцов исследованных видов характеризуются относительно низкой нуклеотидной изменчивостью и разной длиной вследствие присутствия коротких (1–8 пн) и длинных (52–168 пн) инсерций/делеций (инделей), моно- и динуклеотидных повторов. Длина объединенной матрицы трех регионов после выравнивания составила 2769 сайтов. Обнаружено 42 вариабельные нуклеотидные замены, из них 38 были информативны согласно методу максимальной экономии и 4 единичные. Выявлено 59 хлоротипов (P1–P59), из них 40 (67.8%) уникальные, общих хлоротипов у видов не обнаружено (табл. 1). Последовательности хлоротипов депонированы в GenBank/ENA/EMBL-EBI, номера доступа приведены в табл. 2. У всех изученных видов, кроме O. coerulea и O. filiformis, обнаружены видоспецифичные маркеры. Так, последовательности O. mandshurica и O. tragacanthoides имеют нуклеотид A в позициях 862 и 1658 соответственно. У O. deflexa выявлены четыре нуклеотидные замены (T в позициях 332 и 1406, C в позиции 2105, G в позиции 1410) и вставка 97–110 пн (позиции 684–793); у O. glabra – шесть нуклеотидных замен (G в позициях 261, 332, 1935, 2099, 2597 и T в позиции 2346) и делеция нуклеотида А в позиции 861. Кроме того, обнаружены маркерные нуклеотидные замены, специфичные для секции Mesogaea: все последовательности представителей этой секции имеют шесть замен (G в позиции 136, T в позиции 618, С в позициях 650 и 1087, A в позициях 1393 и 1394) и шесть инделей длиной от 1 до 6 пн, отсутствующих у других. Популяции O. tragacanthoides подрода Tragacanthoxytropis и видов O. coerulea, O. filiformis и O. mandshurica секции Janthina подрода Phacoxytropis характеризуются высоким гаплотипическим и низким/средним нуклеотидным разнообразием, а популяция O. glabra – низким гаплотипическим и нуклеотидным разнообразием. В популяции O. deflexa DEF3 при низком гаплотипическом разнообразии выявлен достаточно высокий уровень нуклеотидного разнообразия, а популяция DEF4 оказалась мономорфной (табл. 1).

Согласно результатам AMOVA (табл. 3), самые большие и значимые межпопуляционные различия у O. deflexa и у O. tragacanthoides (Φ_ST = 0.81602 и Φ_ST = 0.75975 соответственно, P < 0.0001), около 35% от общей генетической изменчивости приходится на межпопуляционную компоненту у O. coerulea и у O. mandshurica (Φ_ST = 0.34055, P < 0.05 и Φ_ST = 0.33889, P < 0.0001 соответственно). Статистически незначимая высокая дифференциация определена между популяциями O. glabra (Φ_ST = 0.71429, P > 0.05), а у O. filiformis дифференциация между популяциями отсутствует (Φ_ST = = –0.08489, P > 0.05). Другим показателем степени генетической разобщенности между популяциями является дивергенция нуклеотидных последовательностей (Dxy). У O. tragacanthoides межпопуляционные значения Dxy (среднее число нуклеотидных замен на один сайт и среднее число нуклеотидных различий (число фиксированных различий)) изменяются от 0.00142 до 0.00226 и от 3.400 (3) до 5.400 (2) соответственно. Наименьшие значения Dxy определены между популяциями у O. mandshurica и у O. filiformis (табл. 4), наибольшие – между популяциями O. deflexa, между двумя популяциями O. glabra дивергенция отсутствует (табл. 5).

В табл. 6 приведены значения Dxy между видами. Низкая дивергенция определена между O. coerulea и O. filiformis, значение которой ниже таковых между популяциями O. coerulea (табл. 4). Дивергенция между O. filiformis и O. mandshurica соответствует межпопуляционным значениям, а дивергенция O. coerulea от O. mandshurica в ≈ 1.4 раза превышает межпопуляционную. Нуклеотидная дивергенция O. tragacanthoides от видов секций Janthina в ≈ 1.8 раз выше межпопуляционных значений, а от видов секции Mesogaea в ≈ 5 раз выше (табл. 6). По данным иерархического AMOVA (табл. 3), дифференциация между O. coerulea и O. filiformis низка и незначима (Φ_CT = 0.19727, P > 0.075), а дифференциация между тремя видами секций Janthina составляет более 57% (Φ_CT = 0.57412, P < 0.0001). Наибольшие различия выявлены между секциями Mesogaea и Janthina (Φ_CT = 0.89754, P < 0.0001), чуть меньшие – между O. tragacanthoides и секцией Mesogaea (Φ_CT = 0.79942, P < 0.004), а генетические различия между O. tragacanthoides и секцией Janthina оказались ниже популяционных значений (Φ_CT = 0.32227, P < 0.009).

Для реконструкции филогенетических связей в матрицу, включающую 46 из 59 выявленных хлоротипов видов двух подродов (некоторые уникальные хлоротипы были исключены в связи с большой представленностью), добавлены полученные нами ранее последовательности хлоротипов пяти видов подрода Oxytropis: O. triphylla (Pall.) Pers. (8 хлоротипов) секции Xerobia Bunge, O. lanata (Pall.) DC. (10) и O. gracillima Bunge (5) секции Verticillares DC., O. sordida (Willd.) Pers. (5) и O. ochotensis Bunge (10) секции Orobia Bunge (табл. 2). Длина объединенной матрицы 84 последовательностей хлоротипов трех регионов после выравнивания составила 2790 сайтов. Обнаружено 48 вариабельных нуклеотидных замен, из них 43 были информативны согласно методу максимальной экономии и 5 единичные. Общих хлоротипов у видов не обнаружено. Филогенетический анализ методами MP, NJ, ML дал деревья сходной топологии. На рис. 2 представлено MP-дерево (консенсус 10 000 деревьев: длина 413 шагов, CI = = 0.5617, HI = 0.4383, RI = 0.8002), в котором хлоротипы видов Oxytropis формируют две сестринские клады. Клада I с высокой степенью поддержки только в MP-анализе объединяет хлоротипы O. deflexa и O. glabra секции Mesogaea подрода Phacoxytropis, при этом хлоротипы каждого из видов формируют высокоподдержанные группы (рис. 2). Клада II с высокой степенью поддержки во всех анализах объединяет хлоротипы видов подродов Tragacanthoxytropis, Oxytropis и секции Janthina подрода Phacoxytropis, но взаимоотношения между ними остались неразрешенными. Хорошо поддержанные группы образуют хлоротипы видов O. mandshurica, O. sordida, O. gracillima, O. lanata. Следует отметить, что три хлоротипа O. tragacanthoides (P1, P3 и P4) подрода Tragacanthoxytropis объединились в одну группу со средней поддержкой в MP, ML, NJ и высокой в BI анализах с хлоротипами O. triphylla секции Xerobia подрода Oxytropis (рис. 2).

Рис. 2.

MP-дерево филогенетических связей хлоротипов хпДНК видов Oxytropis подродов Tragacanthoxytropis, Phacoxytropis и Oxytropis. Числами над ветвью обозначены значения индекса бутстрепа, рассчитанные для MP/NJ/ML методов (>50%), под ветвью – значения апостериорной вероятности, рассчитанные для BI анализа (>0.95). Названия видов, секций и подродов рода Oxytropis приведены согласно обработке Малышева [5].

Регион ITS рДНК отсеквенирован у 49 образцов: O. tragacanthoides (13), O. coerulea (11), O. filiformis (7), O. mandshurica (9), O. deflexa (6) и O. glabra (3), представляющих большинство выявленных в данной работе хлоротипов хпДНК. ITS регион характеризуется одинаковой длиной (603 пн) и низкой нуклеотидной изменчивостью: 592 сайта были мономорфными и 11 вариабельными и информативными согласно методу максимальной экономии. Шесть замен (позиции 57, 68, 90, 122, 200, 201) обнаружено в спейсере ITS1 и пять (позиции 422, 427, 513, 548, 555) – в ITS2. Выявлено шесть риботипов: O. coerulea принадлежат два риботипа (RP1 и RP2), у всех других видов по одному: O. filiformis – RP3, O. mandshurica – RP4, O. deflexa – RP5, O. glabra – RP6, O. tragacanthoides – RP1, который является общим с O. coerulea. Последовательности риботипов видов депонированы в GenBank/ENA/ EMBL-EBI под номерами доступа MW186811, LR898459–LR898464. Для выявления генеалогических связей в матрицу риботипов видов двух подродов были добавлены полученные нами ранее последовательности ITS видов подрода Oxytropis: O. triphylla (MW015143) секции Xerobia, O. lanata (LM653259, LM653260), O. chankaensis Jurtz. (FR839001, FR839010) и O. oxyphylla (Pall.) DC. (FR839000) секции Verticillares и O. ochotensis (MK795939, MK795941–MK795943) секции Orobia, а также A. davuricus в качестве внешней группы. Построенная медианная сеть представлена на рис. 3. Наиболее близким видом к Astragalus является O. deflexa, риботип которого через 42 мутационных шага и гипотетический риботип (вымерший или не выявленный в данном исследовании) связан с риботипом A. davuricus. Пять мутационных шагов и гипотетический риботип разделяют виды O. deflexa и O. glabra секции Mesogaea подрода Phacoxytropis. К ним близки риботипы O. mandshurica и O. filiformis секции Janthina этого же подрода. Наиболее распространенный и общий для шести видов, относящихся к трем подродам, риботип RP1 занимает центральное положение в сети и образует звездчатую структуру с другими риботипами, связанными одномутационными переходами (рис. 3).

Рис. 3.

Генеалогическая сеть риботипов ITS рДНК видов Oxytropis подродов Tragacanthoxytropis (RP1), Phacoxytropis (RP1–RP6) и Oxytropis (RP1, RP7–RP12), построенная с помощью MJ-метода. Размер окружностей отражает частоту встречаемости риботипов, маленькие черные кружки – гипотетические гаплотипы, поперечные тонкие штрихи на ветвях – мутационные события.

ОБСУЖДЕНИЕ

Генетическое разнообразие исследованных популяций видов O. tragacanthoides подрода Tragacanthoxytropis и O. coerulea, O. filiformis и O. mandshurica секции Janthina подрода Phacoxytropis характеризуется сочетанием высоких значений гаплотипического и низких/средних значений нуклеотидного разнообразия (табл. 1), которое было отмечено для ряда эндемичных видов Oxytopis [12], некоторых популяций O. glandulosa [13] и O. ruthenica [16], а также других представителей сем. Fabaceae – Astragalus onobrychis L. [28], видов рода Sophora L. [29]. Это указывает на быстрый рост популяции после падения численности, сопровождающийся восстановлением гаплотипической изменчивости за счет мутационного процесса [28, 30]. Низкое гаплотипическое разнообразие в популяциях видов O. deflexa и O. glabra секции Mesogaea подрода Phacoxytropis (табл. 1) может быть следствием дрейфа генов в изолированных малочисленных популяциях и влияния отбора в суровых условиях существования. Высокий уровень межпопуляционной дифференциации у O. deflexa (табл. 3) объясняется, в первую очередь, значительной географической удаленностью местонахождений (Южная Сибирь, Магаданская обл., Таймыр, рис. 1). Отсутствие нуклеотидной дивергенции между удаленными популяциями O. glabra (табл. 5) может быть проявлением анцестрального полиморфизма широко распространенного вида. У O. deflexa и O. glabra выявлены видоспецифичные маркерные нуклеотидные замены хпДНК, а также маркерные замены для секции Mesogaea. Виды секции Mesogaea значительно дивергированы от видов секции Janthina этого же подрода и O. tragacanthoides подрода Tragacanthoxytropis (табл. 6). Базальная позиция риботипов ITS рДНК O. deflexa и O. glabra в генеалогической сети (рис. 3) свидетельствует об их более древнем происхождении. Обособленное положение было показано ранее для O. deflexa [31] по данным полиморфизма маркеров TRPT ядерного и matK хлоропластного геномов, а также для O. deflexa и O. glabra по изменчивости ITS рДНК [32]. Кроме этого, изучение полиморфизма межгенного спейсера trnL–trnF и интрона trnL хпДНК видов Oxytropis, обитающих в Турции, показало, что O. kotschyana секции Mesogaea значительно дивергирована как от видов секции Janthina, так и от видов других подродов [33].

В данном исследовании секция Janthina представлена тремя видами. У O. filiformis отсутствует межпопуляционная дифференциация (табл. 3) и выявлен очень низкий уровень нуклеотидной дивергенции (табл. 4), что обусловлено, вероятно, активным обменом генами между близко расположенными популяциями. У O. coerulea популяции значительно дивергированы друг от друга (табл. 4), при этом такой же уровень нуклеотидной дивергенции выявлен между популяциями O. coerulea и O. filiformis, а между популяцией СОЕ1 O. coerulea, расположенной восточнее оз. Байкал (Бурятия), и популяциями FIL1, FIL3 и FIL4 O. filiformis из Забайкалья и Монголии нуклеотидная дивергенция отсутствует (табл. 4). Результаты анализа полиморфизма межгенных спейсеров хпДНК (отсутствие видоспецифичных маркеров хпДНК и значимой генетической дифференциации у O. coerulea и O. filiformis и объединение хлоротипов в одну, хотя и слабо поддержанную, филогруппу (рис. 2)), указывают на генетическую близость этих двух видов, тем не менее отсутствие общих хлоротипов и наличие разных риботипов ITS рДНК подтверждают самостоятельность O. coerulea и O. filiformis. У O. mandshurica выявлен видоспецифичный маркер в спейсере trnL–trnF хпДНК, хлоротипы образуют высокоподдержанную филогруппу (рис. 2), отмечен индивидуальный риботип. Эти результаты, а также высокий уровень дифференциации между видами секции Janthina (табл. 3), все в целом подтверждает статус O. mandshurica как самостоятельного вида.

Между популяциями O. tragacanthoides выявлены значительная нуклеотидная дивергенция и высокая межпопуляционная дифференциация, что может быть связано с изоляцией местонахождений и приуроченностью вида к специфическим экотопам, а также с наличием кариологических рас. Так, у O. tragacanthoides обнаружены как диплоидные (2n = 16), так и тетраплоидные (2n = 32) представители [5, 9, 34]. Выявленные хлоротипы O. tragacanthoides в MP-дереве разделились на две группы, в одной из них со средней в MP, ML, NJ и высокой в BI анализах поддержками (рис. 2) три хлоротипа объединены с хлоротипами O. triphylla секции Xerobia подрода Oxytropis, который является диплоидом с 2n = 16 [35]. Кроме этого, эти виды имеют один общий риботип ITS (рис. 3). Однако морфологически O. tragacanthoides и O. triphylla резко отличаются как друг от друга, так и от других видов Oxytropis. Представители подрода Tragacanthoxytropis – это подушковидные колючие кустарнички, а характерной особенностью O. triphylla являются листья с одной, редко двумя парами листочков, в целом по морфологическим признакам вид выделяют в особый олиготипный ряд Triphyllae внутри секции Xerobia [5]. Можно предположить, что генетическая близость этих реликтовых видов, обитающих в Южной Сибири, обусловлена широким распространением предковых форм Oxytropis на данной территории [9].

Филогенетические связи хлоротипов видов Oxytropis Азиатской России подродов Tragacanthoxytropis, Oxytropis и секции Janthina подрода Phacoxytropis, образующих высокоподдержанную кладу II (рис. 2), остались неразрешенными. Кроме того, анализ генеалогических связей риботипов ITS рДНК выявил у видов O. tragacanthoides, O. coerulea, O. lanata, O. chankaensis, O. oxyphylla и O. triphylla, относящихся к этим трем подродам, общий риботип RP1 (рис. 3). Все это может быть проявлением сетчатой эволюции, отмеченной для видов рода Oxytropis [5]. Выявленная генетическая близость при четких морфологических различиях характерна для таксонов с общим происхождением, испытавших относительно недавнюю быструю адаптивную радиацию, что отмечено для ряда родов сем. Fabaceae [1]. Учитывая обособление группы бобовых, в которую входят Astragalus и Oxytropis, около 39 млн лет назад [36], можно сказать, что дивергенция рода Oxytropis, появившегося на границе миоцена–плиоцена около 5.6 млн лет назад, была относительно недавней. Быстрая адаптивная радиация показана для видов Oxytropis [1] и других родов сем. Fabaceae: Pultenaea [37], Astragalus [38], Sophora [29] и др. Определенный вклад в полученную картину взаимосвязей видов Oxytropis трех подродов может вносить и происходившая на ранних этапах эволюции рода гибридизация между не полностью специализированными таксонами после быстрой радиации, но перед расхождением генеалогических линий, как это было отмечено для видов рода Pultenaea [37].

Таким образом, проведенный анализ нуклеотидного полиморфизма межгенных спейсеров psbA‒trnH, trnL–trnF и trnS–trnG хпДНК и ITS рДНК расширенной выборки образцов из разных популяций видов O. coerulea, O. filiformis и O. mandshurica секции Janthina подрода Phacoxytropis подтвердил, что три этих таксона являются самостоятельными видами. Результаты реконструкции филогенетических связей хлоротипов и анализа генеалогических связей риботипов ITS видов подродов Phacoxytropis, Tragacanthoxytropis и Oxytropis согласуются с мнением Zhu с соавт. [6] о принадлежности видов O. coerulea, O. filiformis и O. mandshurica подроду Oxytropis, однако необходимы дальнейшие исследования с привлечением других видов этой секции.

Авторы выражают благодарность И.Н. Поспелову и Е.Б. Поспеловой за предоставление образцов O. deflexa с п-ова Таймыр.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.