Генетика, 2022, T. 58, № 6, стр. 728-732

Значительную роль в развитии растений играют регуляторные пептиды: передавая информацию от клетки к клетке, они координируют процессы пролиферации и дифференцировки клеток, а также ответы на внешние стимулы. Некоторые регуляторные пептиды растений способны к дальнему транспорту по проводящим тканям и таким образом, задействованы в коммуникации между разными органами растения [1]. К таким пептидам, в частности, относятся пептиды CEP (C-Terminally Encoded Peptides); для некоторых представителей этого семейства показана способность транспортироваться по ксилеме из корня в побег и таким образом опосредовать системный ответ на недостаток азота в почве [2]. Гены семейства CEP найдены как среди цветковых, так и голосеменных растений, а также обнаружены у галловых нематод, вызывающих мелойдогиноз [3, 4]. Продуктами генов CEP являются белки-предшественники, содержащие сигнальный домен на N-конце, один или несколько консервативных доменов CEP и вариабельный домен между ними [3–5]. В процессе посттрансляционных модификаций белки гидроксилируются по нескольким остаткам пролина и подвергаются протеолизу до образования зрелого пептида, последовательность которого включает лишь консервативный домен CEP длиной 15 аминокислот. Пептиды СЕР регулируют рост корней и побегов растений, а также оказывают влияние на развитие боковых корней и симбиотических клубеньков у бобовых растений [5–7]. Также было показано влияние пептидов CEP на процессы поглощения азота растением за счет системной регуляции экспрессии генов, кодирующих нитратные транспортеры [2].

Данные транскриптомных исследований и анализ регуляторных областей генов CEP у ряда растений позволили предположить, что роль генов CEP в развитии растений не ограничивается их участием в ответе на дефицит азота, и пептиды CEP, вероятно, являются важными регуляторами ответа на различные абиотические стрессовые факторы [8]. Однако роль генов CEP была изучена лишь у отдельных представителей цветковых растений. В частности, у картофеля к настоящему моменту не были охарактеризованы представители этого семейства генов. В связи с этим, целью нашего исследования стала идентификация и анализ экспрессии генов CEP у вида Solanum tuberosum L. (StCEP). Картофель является важной сельскохозяйственной культурой благодаря его способности образовывать клубни. Известно, что наличие азота в среде является одним из ключевых факторов, регулирующих развитие клубней у картофеля, в частности, высокая концентрация азота в среде задерживает клубнеобразование [9]. Поскольку пептиды CEP известны как важные участники ответа на недостаток азота в среде, представляется целесообразным изучение возможной роли этих регуляторов в развитии клубней у картофеля.

Для идентификации генов CEP у картофеля мы провели поиск их последовательностей в геноме картофеля SolTub 3.0 (Ensembl:GCA_000226075.1) с использованием всех известных генов CEP, выявленных ранее в работе [3], с помощью алгоритма tblastx. Также был произведен поиск доменов CEP в последовательностях картофеля с помощью программ Multiple Expectation Maximizationfor MotifElicitation (MEME) (v. 5.4.1), Find Individual Motif Occurrences (FIMO) (v. 5.4.1) и Motif Alignment&Search Tool (MAST) (v. 5.4.1) [10] с использованием доменов СЕР, обнаруженных в исследовании [3]. Полученные последовательности были проанализированы на наличие сигнального домена на N-конце с помощью программы SignalIP (v. 5.0) [11]. Результатом проделанной работы стало обнаружение 17 последовательностей StCEP (Прилож., табл. 1 ). Локализация генов StCEP на хромосомах была визуализирована с помощью программы MapInspect (http://www.softsea.com/download/MapInspect.html). При этом оказалось, что девять генов StCEP располагаются на одной хромосоме (рис. 1,а). Среди них: гены StCEP3 и StCEP9 располагаются в непосредственной близости друг от друга, а гены StCEP1, 6, 7, 13 образуют большой кластер из тандемно расположенных генов.

Рис. 1.

Характеристика генов и пептидов СЕР картофеля. а – локализация на хромосомах генов СЕР картофеля, б – филогенетическое дерево и выравнивание аминокислотных последовательностей пептидов СЕР картофеля Solanum tuberosum (StCEP). Латинские буквы (a–d) рядом с названиями пептидов обозначают различные домены CEP, выявленные в пределах одного белка-предшественника. в – Log2 значения ТPM (TranscriptsPerMillion) для генов CEP картофеля, растущих в условиях большого (4 мM, +N) и малого (0.2 мM, –N) содержания азота в среде. Желтым цветом обозначены ТPM равные 0.

На основании нуклеотидных последовательностей были определены аминокислотные последовательности белков StCEP. Аминокислотные последовательности СЕР выравнивали в программе Ugene [12], и на основании выравнивания было построено филогенетическое дерево методом максимального правдоподобия в программе MEGA11 c bootstrap-поддержкой в 1000 реплик. Среди белков StCEP оказались как белки, содержащие только один домен CEP (StCEP1–13), так и мультидоменные белки, содержащие два (в случае StCEP15, 16) или четыре (в случае StCEP14) консерватиных домена CEP. Так оказалось, что белок StСЕР14 содержит четыре практически идентичных по последовательности домена СЕР (рис. 1,б). Последовательности доменов CEP в пределах мультидоменных белков StCEP15 и StCEP16 характеризуются более выраженными различиями по аминокислотной последовательности, при этом отдельные домены из разных мультидоменных белков StCEP, обозначенные нами как StCEP15a и StCEP16b, демонстрируют высокое сходство по последовательности и различаются только по одной аминокислоте (рис. 1,б). Ранее в работе H.A. Ogilvie с соавт. было отмечено, что консенсусная аминокислотная последовательность пептидов СЕР у представителей семейства пасленовые отличается от последовательностей CEP, характерных для других семейств растений [3]. В связи с этим можно предположить, что конкретные функции выявленных нами пептидов СЕР у картофеля могут отличаться от описанных ранее для других видов растений.

Мы проанализировали транскриптомы листьев и корней трех сортов картофеля, выращенных в почве с азотом (3.3 кг/100 м² мочевины) и без него, доступные в базе данных NCBI (проект номер PRJNA511561), данные представлены в трех повторностях. Исследователями в работу были взяты сорта картофеля, различающиеся по эффективности поглощения и использования азота. Эффективность поглощения азота соответствует доле доступного азота в почве, которая была поглощена растением. Эффективность использования рассчитывается как урожай клубней, деленный на накопленный азот во всем растениям. Так, картофель сорта “Yanshu 4” эффективно поглощает азот, но имеет низкую эффективность его использования, сорт “Xiabodi” (cv. Shepody) характеризуется средними показателями эффективности поглощения и использования, а сорт “Chunshu 4” имеет малую эффективность поглощения и высокую – использования [13].

Так как выявленные нами гены StCEP не аннотированы в геномах картофеля, мы заново проводили анализ данных секвенирования. Качество прочтений проверяли с помощью программы FastQC (v. 0.11.9) [14] и визуализировали отчеты программы FastQC с помощью программы MultiQC [15]. Из сырых данных секвенирования удаляли адаптеры с помощью программы Trimmomatic-0.39 [16]. Подсчет количества прочтений на транскриптом картофеля, в который нами были включены транскрипты генов StСЕР, проводили с помощью программы kallisto (v. 0.46.2) [17]. Дифференциально экспрессирующиеся гены (p_value < 0.01, log2FoldChange>|1|, минимальное количество прочтений – десять) находили с помощью пакета DeSeq2 (v. 1.34.0) [18] в программе R 4.1.1 [19] (Прилож., табл. 2 ). Среди генов StCEP дифференциально экспрессировались всего два гена – StCEP15 и StCEP17. У сорта “Yanshu 4”, который эффективно поглощает азот, но имеет низкую эффективность использования азота, значимое снижение количества транскриптов гена StCEP17 наблюдали в корнях в условиях наличия азота (log2FoldChange = –1.19, padj < 0.025), и, соответственно, при недостатке азота уровень экспрессии этого гена в корнях был выше.

Известно, что у резуховидки экспрессия ряда генов СЕР активируется в корнях при недостатке азота, и пептиды СЕР увеличивают эффективность поглощения азота корнями за счет их участия в активации экспрессии генов нитратных транспортеров. Более высокий уровень экспрессии гена StСЕР17 в корнях сорта “Yanshu 4” в условиях нехватки азота может свидетельствовать о том, что пептид StСЕР17 также может регулировать поглощение нитрата при недостатке азота. При этом у сорта “Chunshu 4”, который характеризуется малой эффективностью поглощения и высокой эффективностью использования азота, выявлено значимое увеличение количества транскриптов гена StCEP15 (log2FoldChange = 2.77, padj < 0.003) в листьях в условиях наличия азота. Тот факт, что экспрессия StCEP15 возрастает в листьях, но не в корнях (при наличии азота в среде) позволяет предположить, что соответствующий пептид вероятно не задействован в передаче сигнала об изменении уровня азота в среде от корней в побег; и он может выполнять иные функции в ответе на изменение содержания азота в среде.

В работе [20] были также секвенированы транскриптомы картофеля, растущего на среде с высоким (4 мM) и низким (0.2 мM) содержанием азота. Азот был представлен в двух формах NO³⁻ и NH⁴⁺. В анализ были взяты разные органы картофеля: побеги, столоны и корни картофеля сорта “Kufri Jyoti”, который выращивали в условиях аэропоники [20]. В ходе данного исследования были секвенированы транскриптомы для образцов из одной повторности (проект номер PRJNA529319). Мы проанализировали данные, полученные в работе [20], по алгоритму, описанному выше. В результате этого получили значения уровней экспрессии генов, выраженные в виде единиц ТPM (TranscriptsPerMillion) (доп. табл. 3 ), сгенерированные программой kallisto (v. 0.46.2) [17]. Гены StCEP1, StCEP5, StCEP11 и StCEP14 мы исключили из анализа в связи с отсутствием транскриптов этих генов во всех анализируемых органах. Для остальных генов была построена тепловая карта уровней экспрессии генов, выраженных в единицах Log2 от значения ТPM, что было сделано с помощью функции heatmap.2 [21] из пакета gplots (https://github.com/talgalili/gplots) в программе R 4.1.1 [19] (рис. 1,в).

Гены были кластеризованы в соответствии с характером их экспрессии. Интересно отметить, что пять генов StCEP (StCEP2, 10, 13, 15, 17) продемонстрировали высокий уровень экспрессии в столоне картофеля, однако бóльшая часть генов StCEP все же экспрессировалась в корнях, при этом ген StCEP2 экпрессировался на относительно высоких уровнях как в столонах, так и в корнях. Было обнаружено изменение экспрессии некоторых генов StCEP при выращивании растений при разных условиях среды – с высоким и низким содержанием азота. Так, в побеге увеличивается количество транскриптов генов StCEP15 и StCEP17 и уменьшается экспрессия StCEP2 при сравнении транскриптомов растений, растущих с малым содержанием азота, и транскриптомов растений, растущих с высоким содержанием азотом. При этом результаты двух проанализированных транскриптомов схожи. Так, экспрессия гена StCEP17 повышается в корнях растений сорта “Yanshu 4” и “Kufri Jyoti” в условиях нехватки азота. В то же время экспрессия гена StCEP17 значимо не изменялась у сортов сортов “Xiabodi” и “Chunshu 4”. Эти сорта отличаются по эффективности поглощения и использования азота, и пептиды СЕР, как сигналы о содержании азота в среде, могут быть задействованы в процессах, связанных с определением азотного статуса растений.

Таким образом, наша работа является вкладом в исследование еще малоизученного семейства пептидов СЕР. Мы идентифицировали 17 генов StСЕР у картофеля и проанализировали их экспрессию в транскриптомах четырех сортов картофеля, различающихся по эффективности использования поступающего из среды азота, выращенных как в богатых азотом почвах, так и при его недостатке. Нами были выявлены гены StСЕР, экспрессия которых изменялась в зависимости от наличия азота в среде. Можно предположить, что кодируемые этими генами пептиды выступают в роли сигнальных молекул, задействованных в ответных реакциях на содержания азота в почве. Также мы обнаружили экспрессию ряда генов StСЕР в столонах картофеля, что позволяет предположить их возможное участие в процессах клубнеобразования.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 19-016-00177.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.