1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Генетика
  4. T. 59, № 9, 2023

Генетика, 2023, T. 59, № 9, стр. 1094-1098

Влияние делеции в некаталитическом домене GdpP на фенотип Staphylococcus aureus посредством направленного геномного редактирования с помощью системы CRISPR/Cas9

Ю. В. Сопова 1, 2, *, М. Е. Велижанина 1, 3, Д. А. Кандина 1, 4, В. В. Гостев 5, 6, П. С. Чулкова 5, О. С. Сулян 5, С. В. Сидоренко 5, 6

1 Санкт-Петербургский государственный университет
199034 Санкт-Петербург, Россия

2 Санкт-Петербургский филиал Института общей генетики им. Н.И. Вавилова
198504 Санкт-Петербург, Россия

3 Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии
196608 Санкт-Петербург, Россия

4 Государственное автономное образовательное учреждение высшего образования “Ленинградский государственный университет им. А.С. Пушкина”
196605 Санкт-Петербург, Россия

5 Детский научно-клинический центр инфекционных болезней Федерального медико-биологического агентства
197022 Санкт-Петербург, Россия

6 Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова
191015 Санкт-Петербург, Россия

* E-mail: y.sopova@spbu.ru

Поступила в редакцию 22.03.2023
После доработки 13.04.2023
Принята к публикации 17.04.2023

Аннотация

Высокие внутриклеточные концентрации молекул циклического ди-аденозинмонофосфата (c-di-AMP) влияют на формирование устойчивости к антибиотикам, действующих на клеточную стенку у Staphylococcus aureus. Накопление молекул c-di-AMP происходит вследствие мутаций в домене DHH/DHHA1 белка GdpP. Роль мутаций в других доменах GdpP до конца не изучена. В этой связи целью настоящей работы стало получение направленной делеции в геноме без сдвига рамки считывания в линкерном участке между доменами GGDEF и DHH/DHHA1 белка GdpP. Для редактирования генома использовали штамм S. aureus RN4220 с отсутствующей системой рестрикции-модификации. Использовали двух векторную систему с термочувствительными ориджинами репликации, плазмиды: pCN-EF2132tet с геном рекомбиназы EF2132 Enterococcus faecalis и pCAS9counter с геном РНК-направляемой нуклеазы Cas9 Streptococcus pyogenes. Штамм S. aureus RN4220 трансформировали вектором pCN-EF2132tet для получения рекомбинирующих компетентных клеток, а затем вводили донорный олигонуклеотид одновременно с вектором контрселекции. После двух трансформаций был получен штамм с целевой делецией (90 пн), которая соответствовала 308–337 аминокислотному участку в белке GdpP. У мутантного штамма не было выявлено фенотипических изменений: ЛАГ-фаза роста, общая скорость роста, время деления клеток, морфология колоний не отличались от исходного штамма. Также сохранялась чувствительность к антибиотикам, действующим на клеточную стенку. Таким образом, мутации в GdpP в линкерном участке между GGDEF и DHH/DHHA1 не влияют на чувствительность к антибиотикам у S. aureus.

Ключевые слова: GdpP, Staphylococcus aureus, CRISPR/Cas9, геномное редактирование.

Список литературы

  1. Tong S.Y., Davis J.S., Eichenberger E. et al. Staphylococcus aureus infections: Epidemiology, pathophysiology, clinical manifestations, and management // Clin. Microbiol. Rev. 2015. V. 28. № 3. P. 603–661. https://doi.org/10.1128/CMR.00134-14

  2. Monk I.R., Foster T.J. Genetic manipulation of Staphylococci-breaking through the barrier // Front. Cell. Infect. Microbiol. 2012. V. 2:49. P. 1–9. https://doi.org/10.3389/fcimb.2012.00049

  3. Kreiswirth B.N., Lofdahl S., Betley M.J. et al. The toxic shock syndrome exotoxin structural gene is not detectably transmitted by a prophage // Nature. 1983. V. 305. № 5936. P. 709–712. https://doi.org/10.1038/305709a0

  4. Chen W., Zhang Y., Yeo W.S. et al. Rapid and efficient genome editing in Staphylococcus aureus by using an engineered CRISPR/Cas9 system // J. Am. Chem. Soc. 2017. V. 139. № 10. P. 3790–3795. https://doi.org/10.1021/jacs.6b13317

  5. Penewit K., Holmes E.A., McLean K. et al. Efficient and scalable precision genome editing in Staphylococcus aureus through conditional recombineering and CRISPR/Cas9-mediated counterselection // mBio. 2018. V. 9. № 1. https://doi.org/10.1128/mBio.00067-18

  6. Liu Q., Jiang Y., Shao L. et al. CRISPR/Cas9-based efficient genome editing in Staphylococcus aureus // Acta Biochim. Biophys. Sin (Shanghai). 2017. V. 49. № 9. P. 764–770. https://doi.org/10.1093/abbs/gmx074

  7. Yin W., Cai X., Ma H. et al. A decade of research on the second messenger c-di-AMP // FEMS Microbiol. Rev. 2020. V. 44. № 6. P. 701–724. https://doi.org/10.1093/femsre/fuaa019

  8. Zarrella T.M., Bai G. The many roles of the bacterial second messenger cyclic di-AMP in adapting to stress cues // J. Bacteriol. 2020. V. 203. № 1. https://doi.org/10.1128/JB.00348-20

  9. Gostev V., Sopova J., Kalinogorskaya O. et al. In vitro ceftaroline resistance selection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus involves different genetic pathways // Microb. Drug. Resist. 2019. V. 25. № 10. P. 1401–1409. https://doi.org/10.1089/mdr.2019.0130

  10. Gostev V., Kalinogorskaya O., Ivanova K. et al. In vitro selection of high-level beta-lactam resistance in methicillin-susceptible Staphylococcus aureus // Antibiotics (Basel). 2021. V. 10. № 6. https://doi.org/10.3390/antibiotics10060637

  11. Sprouffske K., Wagner A. Growthcurver: An R package for obtaining interpretable metrics from microbial growth curves // BMC Bioinformatics. 2016. V. 17. № 172. https://doi.org/10.1186/s12859-016-1016-7

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Генетика

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал