Известия РАН. Серия биологическая, 2019, № 1, стр. 19-30

ФОРМИРОВАНИЕ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ И ДЕФИНИТИВНЫХ ОСЕЙ ТЕЛА В ОНТОГЕНЕЗЕ

Полярность и симметрия тела были и сейчас остаются центральными вопросами эволюционной морфологии и эмбриологии (Беклемишев, 1964; Иванова-Казас, 1995; Martindale, 2005; Wanninger, 2015a; Озернюк, Исаева, 2016; Genikhovich, Technau, 2017). Складывающиеся в ходе проэмбрионального и раннего эмбрионального периода осевые отношения создают основу плана строения и являются важнейшим признаком для сравнения таксонов высокого ранга. Полученные при таком анализе морфологические и онтогенетические ряды широко используются для объяснения эволюции морфотипа. Несомненно, перестройки дефинитивных осей в филогенезе сопряжены с изменениями на самых ранних этапах индивидуального развития, начиная с гаметогенеза и оплодотворения.

Традиционно в яйцах и ранних зародышах выделяют анимально-вегетативную полярность, которая изначально определялась эмбриологами по проспективному значению соответствующих частей ооплазмы (Иванова-Казас, 1995). Создаваемая в ходе оогенеза и ооплазматической сегрегации неравномерность в распределении материнских детерминантов предопределяет в большинстве случаев и дефинитивные оси тела (Isaeva, 2014). Однако пространственное и временно́е соотношения этих систем позиционной информации сильно варьируют у разных видов. Как правило, протаксонию – совпадение первичной полярности яйца (и соответствующей анизoтропии гаструлы) с главной (продольной) осью тела – отмечают у базальных типов Metazoa (губки, гребневики и книдарии) и у наименее дивергировавших представителей Bilateria, таких как некоторые турбеллярии, полихеты, ракообразные, личинки иглокожих (Беклемишев, 1964; Светлов, 1967; Иванова-Казас, 1995). Для остальных животных постулируется гетераксония, т.е. перекрещивание осей раннего зародыша и взрослого организма. Основная причина появления подобных проморфологических отношений состоит в преобразовании гаструляционных морфогенезов, которые нацелены на наиболее быстрое и эффективное создание плана строения (рационализацию процесса) (Иванова-Казас, 1995; Мамкаев, 2004).

На множестве филогенетически удаленных видов показано, что Wnt/β-катениновый путь межклеточной коммуникации может быть ключевым регулятором как эмбриональной, так и дефинитивной полярности тела (Petersen, Reddien, 2009). Реализуясь в сигнальных центрах типа губа бластопора у актинии Nematostella (Kraus et al., 2016) и позвоночных (Kiecker et al., 2015), гипостом у гидры (Broun et al., 2005), наиболее вегетативные клетки ранних эмбрионов эхинодермат (Kumburegama, Wikramanayake, 2008) и полухордовых (Darras et al., 2018), каудальный конец эмбрионов и регенератов планарий (Almuedo-Castillo et al., 2012), он участвует в спецификации зародышевых листков, терминальном росте и паттернировании переднезадней оси. Наиболее очевидная и общая для различных представителей Metazoa роль β‑катенина в развитии заключается в определении анимально-вегетативной оси зародыша. Асимметричное накопление β-катенина в ядрах бластомеров вегетативного полюса на самых ранних стадиях эмбриогенеза необходимо и достаточно для спецификации энтодермы/энтомезодермы и имеет решающее значение для создания переднезадней аксиализации эктодермы (Loh et al., 2016). Последние исследования на представителях Deuterostomia уверенно показали, что при паттернировании главной оси тела Wnt-сигналинг не столько определяет судьбу задних эктодермальных территорий, сколько вовлечен в подавление передних зачатков (Darras et al., 2018). Положительные инструктирующие стимулы канонического Wnt-пути критически важны как минимум для развития средней части тела, которая у позвоночных соответствует области заднего мозга и переднего конца спинного мозга.

Помимо переднезадней полярности принципиально важна дорсовентральная разметка зачатков. У билатерий исключительно консервативную роль в этом процессе играют противоположно направленные градиенты секретируемых лигандов Bmp/dpp и их антагонистов – Chordin/Short-gastrulation (Martindale, 2005; Genikhovich, Technau, 2017). У позвоночных эмбриональный организатор (дорсальная губа бластопора) секретирует разнообразные ингибиторы каскадов TGF-β (прежде всего блокирующие BMP) и Wnt – белки Chordin, Noggin, Cerebrus, Frizby, а также оказывающийся инактивированным BMP2 (De Robertis, 2009). Распространяясь вентрально, эти молекулы ограничивают активность лигандов BMP, которые в наибольшей концентрации определяют судьбу вентральной мезодермы и эктодермы. Дорсально расположенные клетки гаструлы детерминируются организатором как хордомезодерма и нейроэктодерма.

Яркие работы последних лет, выполненные в основном на книдариях и вторичноротых, показали существование относительно консервативной молекулярно-генетической программы осевой спецификации за счет Wnt (Holstein, 2012; Kraus et al., 2016; Loh et al., 2016; Darras et al., 2018). В связи с очевидным пробелом в понимании роли Wnt-пути у базальных Metazoa, а также у первичноротых из группы Spiralia возникает вопрос об эволюционном источнике и пластичности данной программы. Богатый материал для анализа поставленной проблемы предоставляют губки и аннелиды, послужившие центральными объектами данного исследования.

Идентификация оси симметрии у губок не вызывает сложности лишь в исключительных случаях – у некоторых однооскулюмных представителей Calcarea и Hexactinellida, а также у всех личинок. У взрослых губок данных таксонов можно обозначить морфологическую апикобазальную ось, соединяющую оскулюм с местом прикрепления губки к субстрату, образованным специализированными клетками – базопинакоцитами. У личинок же переднезадняя ось проявляется в их форме, анизотропии клеточного состава и направлении плавания. Гомология плана строения тела губок с таковым у Eumetazoa не вызывала сомнения у Геккеля (Haeckel, 1870). Однако одним из ключевых доказательств общности происхождения должно служить наличие сходной генной регуляторной сети. В современных работах у губок были описаны паттерны экспрессии многих генов, вовлеченных в спецификацию осей тела и энтомезодермы у билатерий (Adamska et al., 2007, 2010; Fortunato et al., 2014, 2015; Borisenko et al., 2016). Ленинджер с соавт. (Leininger et al., 2014) продемонстрировали, что ряд участников сигнальных путей Wnt и TGF-β экспрессируются в задней части личинки, а после метаморфоза – в оскулюме взрослой губки. В то же время для многих Bilateria и стрекающих показана активация Wnt-пути в области бластопора/гипостома на оральном полюсе. Сравнивая профили экспрессии гомологичных генов, авторы предполагают, что задний конец личинки и оскулюм губок гомологичны оральному полюсу Cnidaria. Радикальные изменения, происходящие в ходе метаморфоза Porifera на клеточном уровне, позволяют усомниться в преемственности осей между личинкой и рагоном (молодой губкой).

Рассматривая систему осей в онтогенезе губок, стоит обратить внимание на один из классов стрекающих – Anthozoa. Несмотря на отсутствие дорсовентральной оси, они все же обладают осью, залегающей перпендикулярно первичной, орально-аборальной – так называемой директивной осью. Директивная ось задается направлением, в котором уплощена гастральная полость, а также положением сифоноглифа и мышечных валиков в мезентериях. Подобно дорсовентральной оси билатерий, директивная ось специфицируется за счет сигнального пути BMP (лигандов суперсемейства TGF-β и их ингибиторов) (Genikhovich, Technau, 2017). Любопытно, что лиганды TGF-β экспрессируются у губки Amphimedon queenslandica (класс Demospongiae) в передней и средней частях личинки, а белки Wnt – на заднем полюсе личинки (Adamska et al., 2007). У представителя кальциевых губок Sycon ciliatum лиганды Wnt и TGF-β экспрессируются в одних и тех же клетках – макромерах, расположенных на заднем полюсе амфибластулы (Leininger et al., 2014). Филогенетический анализ этих сигнальных молекул показывает их диффузную экспансию в разных классах губок (Leininger et al., 2014; Borisenko et al., 2016; Genikhovich, Technau, 2017), но при этом очевидно, что путь TGF-β был у губок задействован в спецификации по крайней мере переднезадней оси личинки, а затем у стрекающих переключился на директивную ось.

Таким образом, имеются доказательства гомологии дефинитивных осей между Bilateria и представителем одного из классов губок Calcarea, тогда как для других представителей, например Demospongiae, молекулярные механизмы спецификации осей еще недостаточно изучены. В то же время преемственность осей между личинкой и взрослой губкой находится под вопросом, равно как и само наличие оси у многооскулюмных губок. Кроме того, если учитывать истинное значение анимально-вегетативной полярности в предопределении зародышевых листков, которые у губок отсутствуют (Ereskovsky, Dondua, 2006; Дондуа, Костюченко, 2013; Nakanishi et al., 2014), возникает вопрос: корректно ли гомологизировать проморфологию их ооцитов/зигот с таковой у других животных?

МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕХАНИЗМ Wnt-СИГНАЛИНГА И ЕГО РЕПЕРТУАР У Metazoa

Канонический Wnt/β-катениновый сигналинг осуществляет межклеточную коммуникацию путем секреции лигандов, белков семейства Wnt, и рецепции их компетентной клеткой (рис. 1). Ключевой цитоплазматический белок – β-катенин – играет роль в клеточной адгезии и активации генов-мишеней в ядре. В отсутствие лиганда пул β-катенина в цитоплазме разделен на две части. Одна из них вместе с α-катенином обеспечивает связь актиновых микрофиламентов с внутриклеточным доменом Е-кадгерина, т.е. β-катенин контролирует взаимодействие адгезивных контактов с цитоскелетом. Другая часть пула связана с аксином, мультидоменным белком, входящим вместе с киназами GSK3β и CK1 и белком АРС в состав разрушающего комплекса. Находясь в комплексе, СК1 и GSK3β последовательно фосфорилируют консервативные остатки серина и треонина на N-конце связанного β-катенина, формируя сайт распознавания для убиквитинлигазы β-Trcp (Aberle et al., 1997; Zeng et al., 2005). Убиквитинилированный β-катенин подвергается быстрой деградации в протеасомах. Таким образом, в отсутствие Wnt-лиганда в цитоплазме поддерживается низкий уровень β-катенина.

Рис. 1.

Схема канонического Wnt-пути. Слева неактивное состояние: в отсутствие лиганда Wnt многокомпонентный разрушающий комплекс (destruction complex) обеспечивает фосфорилирование и деградацию β-катенина. Справа активированное состояние: после связывания лиганда с рецепторами и диссоциации разрушающего комплекса происходит накопление β-катенина в цитоплазме и ядре клетки, где запускается транскрипция генов-мишеней.

Вне зависимости от Wnt-сигналинга транскрипционный фактор Tcf/Lef связывается в ядре с энхансерами и промоторами генов-мишеней. В отсутствие в ядре β-катенина Tcf функционирует как репрессор транскрипции генов-мишеней путем привлечения кофакторных белков семейства Groucho/TLE (Cavallo et al., 1998; Roose et al., 1998).

Секретированный Wnt-лиганд связывается с рецептором Frizzled (Fzd) и корецептором LRP5/6. Тримерный комплекс Wnt–Fzd–LRP5/6 рекрутирует к мембране цитоплазматический аксин из разрушающего комплекса и белок Dishevelled, что ведет к подавлению фосфорилирования β-катенина и обеспечивает его стабилизацию. β-катенин накапливается в цитоплазме и входит в ядро, где связывается с N-концом Tcf, смещает ингибитор Groucho/TLE и привлекает активаторы транскрипции (например, гистоновые ацетилазы), запуская экспрессию генов-мишеней (Behrens et al., 1996). В геноме млекопитающих идентифицировано >400 генов-мишеней комплекса Tcf/β-катенин. Лишь небольшая их часть может быть активирована в данный момент в данной клетке. Это ограничивает потенциальный эффект активации сигнального каскада наиболее актуальными потребностями самой клетки (Clevers, 2006).

Во время диффузии между клетками лиганд может быть блокирован секретируемой формой рецептора secreted Frizzled-related protein (sFRP), что предотвращает активацию цитоплазматического рецептора. Также ингибирование пути происходит при связывании белка Dickkopf с рецептором Frizzled. Два этих антагониста Wnt-каскада, sFRP и Dickkopf, выполняют модулирующую функцию (Cruciat, Niehrs, 2013).

Все Wnt представляют собой секретируемые гликопротеины, особенность которых – наличие 22 почти инвариантно расположенных остатков цистеина. Они формируют внутримолекулярные дисульфидные связи, поддерживающие глобулярную вторичную структуру лиганда (Miller, 2002). За счет цистеиновых остатков Wnt связывается с цистеин-богатым доменом (CRD), расположенным во внеклеточной части рецептора Frizzled. Рецептор имеет обширный N-концевой CRD, семь трансмембранных доменов и короткий C-концевой участок, обращенный в цитоплазму. Взаимодействие с Dishevelled происходит за счет консервативных аминокислотных мотивов KTxxxW, расположенных в цитоплазматических участках Frizzled между трансмембранными доменами. Вторичный мессенджер Dishevelled связывается с этими участками высококонсервативным PDZ-доменом, расположенным в центральной части молекулы. N-терминальный домен DIX обеспечивает полимеризацию Dishevelled по принципу “голова к хвосту”, С-терминальный домен DEP несет сильный положительный заряд и отвечает за рекрутирование Dishevelled к плазмалемме. Полимеризация Dishevelled позволяет использовать его как динамичную платформу для сборки белковых комплексов с низкой авидностью (Dishevelled/аксин, например). Аксин представляет собой крупный мультидоменный белок, взаимодействующий с Dishevelled за счет своего С-концевого домена, а также непосредственно с β-катенином и с входящими в состав разрушающего комплекса белками GSK3β, CK1 и АРС. Рекрутирование аксина к мембране за счет связанного с ним Dishevelled ведет к разборке комплекса и стабилизации β-катенина (MacDonald, He, 2013).

Сигнальный путь Wnt играет важную роль в различных процессах развития, но доминирующим среди них считается процесс спецификации осей. Участие Wnt в спецификации осей в развитии показано у многих Metazoa, начиная с Cnidaria (Holstein et al., 2011). Несмотря на то что элементы внутриклеточного каскада передачи сигнала идентифицированы у одноклеточных эукариот (например, гомологи β-катенина, киназы GSK3β, рецепторов Frizzled), гены wnt появляются в эволюции только у Metazoa, включая губок. Чем больше видов губок подвергаются филогенетическому анализу в разрезе репертуара лигандов, в том числе Wnt, тем очевиднее становится, что эволюция Wnt-пути шла по отдельному сценарию с дупликациями и утратами отдельных сигнальных молекул в каждом из классов губок – Demospongiae, Hexactinellida, Calcarea и Homoscleromorpha. Так, у кальциевых губок число лигандов близко к таковому у позвоночных из-за дупликации генома, а у стеклянных губок лиганды Wnt отсутствуют, хотя имеются многие другие участники Wnt-пути (вероятно, вследствие синцитиальной природы губок данного класса) (Leininger et al., 2014; Schenkelaars et al., 2017).

На основании филогенетического анализа лиганды Eumetazoa (Cnidaria+Bilateria) группируют в 13 подсемейств: от Wnt1 до Wnt11, Wnt16 и WntA. Все первичноротые лишены wnt3, тогда как wnt1, wnt5 и wntA высококонсервативны у большинства Protostomia (Holstein et al., 2011). Остается открытым вопрос о числе первых wnt-генов и их происхождении.

По проведенному нами анализу in silico можно судить о сохранении анцестрального для билатерий состава участников Wnt у нереидных полихет Alitta virens и Platynereis dumerilii. Напротив, у губок отсутствуют некоторые внеклеточные модуляторы (DKK, WIF, Wise/SOST), а набор лигандов Wnt неповторим в разных филогенетических линиях, что может свидетельствовать об альтернативных путях создания отличающихся регуляторных состояний на единой основе Wnt-сигналинга (рис. 2). Дендрограмма (рис. 2) демонстрирует, что гены нереид хорошо укладываются в семейства, образованные известными wnt билатерий, тогда как сиквенсы демоспонгии Halisarca dujardini кластеризуются вместе или (с низкой поддержкой) с последовательностями других губок и ктенофор, не показывая аффинность к какому-либо из описанных семейств.

Рис. 2.

Филогенетическое древо (алгоритм Neighbor-Joining), отражающее положение последовательностей wnt у губки Halisarca dujardini и аннелид Alitta virens и Platynereis dumerilii среди остальных Metazoa. Amq – Amphimedon queenslandica; Bf – Branchiostoma floridae; Hs – Homo sapiens; Ml – Mnemiopsis leidyi; Nv – Nematostella vectensis; Ol – Oscarella lobularis; Osp – Oscarella sp.; Sp – Strongylocentrotus purpuratus; Tc – Tribolium castaneum. 1 – гены H. dujardini, 2 – A. virens, 3 – P. dumerilii.

ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ИНДУКТИВНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ КОМПОНЕНТОВ Wnt В РАЗВИТИИ Porifera

В качестве аргументов в пользу участия сигнального пути Wnt в спецификации осей у губок рассматриваются две группы результатов. Первая группа включает в себя данные по пространственной экспрессии участников сигнального пути – лигандов, рецепторов, внутриклеточных мессенджеров. Так, у губок Oscarella lobularis (Homoscleromorpha), S. ciliatum (Calcarea) и H. dujardini (Demospongiae) показана экспрессия некоторых Wnt-лигандов в оскулюме взрослой губки и на заднем полюсе личинки (Lapébie et al., 2009; Leininger et al., 2014; Borisenko et al., 2016). Однако у пресноводной демоспонгии Ephydatia muelleri экспрессия wnt была показана в отдельных клетках мезохила, но не в районе оскулюма.

Вторая группа результатов получена в ходе экспериментов с фармакологическими агентами, нарушающими (блокирующими или активирующими) сигнальный путь Wnt. Для O. lobularis была показана зависимость между искусственной активацией сигналинга и формированием эктопических остий – приносящих отверстий водоносной системы (Lapébie et al., 2009). У пресноводной E. muelleri такая же зависимость была описана в отношении формирующихся de novo оскулюмов (Windsor, Leys, 2010). Однако авторы признают, что фармакологические ингибиторы не являются абсолютно специфичными, имеют побочные эффекты, а результаты их действия не всегда поддаются однозначной интерпретации (Windsor Reid et al., 2018).

Хотя Виндзор Рейд с соавт. (Windsor Reid et al., 2018) критически относятся к участию Wnt-пути в спецификации осей у губок и считают совпадением экспрессию лигандов в оскулюме и на заднем полюсе личинки, у демоспонгии со слабо выраженной аксиализацией – морского вида-космополита H. dujardini – был показан комплексный паттерн экспрессии различных wnt. Так, HduWntD и HduWntE экспрессируются в оскулюме, HduWntG – в экзопинакоцитах, за исключением клеток оскулюма, а HduWntH – на границе экзо- и базопинакодермы (Borisenko et al., 2016). По нашим новым результатам, у личинки H. dujardini гены wnt экспрессируются перекрывающимися доменами в заднем полушарии: HduWntJ – полосой по экватору, HduWntK – в задней половине тела личинки (за исключением клеток заднего полюса), HduWntL – только в клетках заднего полюса (рис. 3). Полученная картина напоминает проявление Wnt-кода у стрекающих, который позволил рассматривать Wnt-сигналинг механизмом спецификации переднезадней оси, предшествующим появлению системы Hox-генов (Guder et al., 2006). Впрочем, в последних работах на стрекающих показано, что, хотя их система Hox-генов гораздо скуднее таковой у Bilateria, они все же принимают участие в разметке орально-аборальной оси, а Wnt-сигналинг опосредует взаимодействие между оральным и аборальным сигнальными центрами (DuBuc et al., 2018).

Рис. 3.

Экспрессия генов wnt у личинки губки Halisarca dujardini. Передний полюс направлен вверх. а–в – гибридизация in situ, локализация транскриптов показана стрелками. а – экспрессия HduWntK (1), поверхностный фокус; б – экспрессия HduWntJ (2), фокусировка в глубине; в – экспрессия HduWntL (3), фокусировка в глубине; г – схема взаимного расположения доменов экспрессии у личинки (продольный срез).

Таким образом, имеются две точки зрения, одна из которых постулирует гомологию между орально-аборальной осью Cnidaria и апикобазальной осью губок (по крайней мере, у Calcarea), имея основным доводом участие Wnt-сигналинга в определении этих осей (Leininger et al., 2014). Авторы, придерживающиеся противоположных взглядов, отрицают участие Wnt в спецификации осей у губок (Windsor Reid et al., 2018), опираясь на эксперименты с ингибиторами и результаты гибридизации in situ на одном виде. Мы поддерживаем возможность участия Wnt-пути в спецификации осей у губок: даже у взрослой H. dujardini экспрессия различных лигандов задает подобие оси. Вместе с тем следует признать, что более фундаментальный вопрос наличия поляризованных осей у дефинитивных особей остается недостаточно проработанным и дискуссионным. Дальнейшее исследование представителей всех классов губок, а также других механизмов межклеточной коммуникации, поможет решить эту задачу.

РОЛЬ Wnt В ОСЕВОМ ПАТТЕРНИРОВАНИИ И СПЕЦИФИКАЦИИ МЕЗЭНТОДЕРМЫ У Spiralia

Среди животных, традиционно относимых к группе Spiralia, исключительной ценностью для теоретического обобщения роли Wnt в обеспечении переднезадней полярности обладают свободноживущие плоские черви – планарии. Во взрослом состоянии задний конец тела планарий является источником сигнальных молекул, в том числе нескольких лигандов семейства Wnt (Almuedo-Castillo et al., 2012). Нокдаун соответствующих генов ведет к развитию по всей периферии червя головных структур: церебральных ганглиев и глаз. Подобный антериоризованный фенотип получают и при подавлении ортологов β-катенина, что подтверждает необходимость постоянно работающего сигнального центра у взрослых животных (Cebrià et al., 2015). Двухголовые планарии образуются и в случае регенерации из передних фрагментов тела, если подавлен канонический Wnt-сигналинг. При этом отмечается дозозависимый эффект экспериментального воздействия: от умеренной антериоризации до замещения срединных участков туловища, содержащих глотку, и далее вплоть до полной утраты главной оси, т.е. радиализации. На противоположном (переднем) конце тела активно экспрессируются антагонисты Wnt, такие как sFRP и Notum. Без них, равно как при подавлении APC и аксина, наблюдается обратный феномен – постериоризация. Все эти данные убеждают в существовании градиента морфогенов – компонентов функционирующего канонического Wnt-пути, определяющих переднезаднюю полярность, начиная с поздних стадий эмбриогенеза (Martín-Durán et al., 2012; Cebrià et al., 2015).

Хотя данных о работе Wnt в развитии других представителей Spiralia совсем немного, определенный консерватизм экспрессии лигандов ближе к заднему концу тела наблюдается у аннелид (Cho et al., 2010; Janssen et al., 2010; Pruitt et al., 2014) и брахиопод (Vellutini, Hejnol, 2016), а по предварительным сообщениям – у моллюсков и немертин (Wanninger, 2015b). Следует, однако, отметить, что указанные опубликованные работы преимущественно носят описательный характер, т.е. выполнены без функционального теста. Единственное исключение – недавнее исследование Wnt-сигналинга у зародышей двух видов дальнеродственных брахиопод (Vellutini, Hejnol, 2016). Авторы уверенно продемонстрировали как консерватизм экспрессии wnt1 на заднем полюсе (в дорсальной губе бластопора), так и эффект постериоризации в условиях ингибирования антагонистов каскада, т.е. при его гиперактивации.

Наиболее подробно локализацию транскриптов компонентов Wnt изучали у нереидной полихеты P. dumerilii (Prud’homme et al., 2003; Janssen et al., 2010; Pruitt et al., 2014; Bastin et al., 2015). Примечательно, что самые ранние домены экспрессии нескольких wnt приурочены к дорсальной стороне в протяженной экваториальной и анимальной областях зародыша (Pruitt et al., 2014). Ближе к анимальному/переднему полюсу обнаруживаются транскрипты рецепторов Frizzled и растворимых блокаторов (sFRP), что укладывается в общую для билатерий модель встречно-направленных градиентов морфогенов, размечающих переднезаднюю ось тела. На более поздних стадиях, начиная с ранней трохофорной личинки P. dumerilii, сигнал мРНК большинства паралогов wnt появляется на заднем полюсе тела. По нашим данным, wnt1 сходным образом экспрессируется у личинок и ювенильных особей нереиды A. virens (рис. 4а–в). До стадии поздней трохофоры транскрипты Avi-wnt1 выявляются в области проктодеума в поверхностных клетках. У метатрохофор появляются дополнительные посегментно организованные полосы экспрессии, а терминально сигнал Avi-wnt1 маркирует развивающуюся заднюю кишку. На несколько более продвинутой стадии, чем у нереид, начинает экспрессироваться wnt1 в анальной области седентарной полихеты Capitella teleta (Seaver, Kaneshige, 2006).

Рис. 4.

Распределение компонентов Wnt-сигналинга в развитии аннелиды Alitta virens. а–в – экспрессия гомолога wnt1/wg у личинок, гибридизация in situ. 1 – каудальный домен экспрессии, 2 – домены вдоль задних границ зачатков сегментов, 3 – стомодеум, 4 – прототрох. а – ранняя трохофора; б – средняя трохофора; в – ранняя метатрохофора; г–е – выявление β-катенина моноклональными антителами PY489 (DSHB) на стадии ранней гаструлы, конфокальная проекция нескольких поверхностных срезов, вид с вегетативного полюса одного и того же зародыша; г – канал флуоресцентных антител, подчеркнуты бластомеры с пониженным содержанием ядерного белка; д – канал красителя ДНК DAPI, подписаны все идентифицированные клетки; е – совмещение каналов антител и DAPI.

Пожалуй, наиболее модифицированный паттерн активности wnt демонстрируют зародыши пиявки Helobdella (Cho et al., 2010). Транскрипты почти всех паралогов wnt запасаются в ходе оогенеза и специфически сегрегируются по мере дробления в определенные клеточные линии. Интересно, что экспрессия wnt не затрагивает у пиявки задние отделы кишечника, тогда как у полихет и моллюсков именно зачаток ануса (а также заднюю часть стомодеума и соединяющую их вентральную срединную линию), по нашему мнению, можно рассматривать сигнальным центром, сходным с губами бластопора. Эта идея подтверждается экспрессией в месте замыкания бластопора таких консервативных мишеней канонического Wnt-пути, как FoxA и Brachyury у нереид (Arendt et al., 2001; Kostyuchenko et al., 2018), седентарных полихет Hydroides elegans (Arenas-Mena, 2006, 2013) и C. teleta (Boyle, Seaver, 2008; Boyle et al., 2014), а также моллюсков (Lartillot et al., 2002a, b; Le Gouar et al., 2004; Kin et al., 2009; Tan et al., 2017). Сопоставимым с другими Spiralia каудальным доменом экспрессии лигандов Wnt у пиявки является популяция эмбриональных стволовых клеток (телобластов). Таким образом, у Spiralia клетки заднего конца тела (независимо от тканевой принадлежности и происхождения) как в эмбриогенезе, так и в дефинитивном состоянии – важнейший элемент разметки осей билатеральной симметрии с помощью системы Wnt.

Совершенно иначе проявляется участие элементов Wnt-пути в самом начале эмбрионального развития, еще до гаструляции. Как правило, после оплодотворения яйца устанавливается закономерная локализация внутриклеточных регуляторов, которая приводит к полярному распределению β-катенина, причем собственно лиганды Wnt в этом процессе не задействованы. Во время дробления молекулярная разметка вдоль анимально-вегетативной оси показана у единственного представителя Spiralia – немертины Cerebratulus lacteus (Henry et al., 2008). Ядерный β-катенин необходим здесь для развития наиболее вегетативных клеток, дающих энтодерму. При манипуляциях с этим эффектором Wnt-пути авторам удалось добиться двух противоположных фенотипов: анимализованного с отсутствием кишечной ткани в случае разрушения β-катенина и при его стабилизации – вегетализованного, при котором кишечные маркеры выявлялись практически во всех клетках (Henry et al., 2008).

Сходной функцией определения судьбы вегетативных территорий зародыша обладает β-катенин у брюхоногого моллюска Crepidula fornicata (Henry et al., 2010). Однако если у немертины происходит последовательная сегрегация этого белка в вегетативные бластомеры в каждом цикле дробления, то у гастроподы отмечен единовременный переход от экспрессии во всех клетках к специфической локализации в мезэнтобласте 4d. По мере развития мезодермальной полоски белок подвергается деградации от ее заднего конца к переднему (Henry et al., 2010). Все экспериментальные результаты приводят авторов к выводу об участии β-катенина в спецификации и паттернировании мезэнтодермальных клеток моллюска.

Своеобразное поведение β-катенина описано в ходе дробления полихеты P. dumerilii, при котором почти все бластомеры от деления к делению демонстрируют повторяющийся паттерн накопления белка в ядрах (Schneider, Bowerman, 2007). Независимо от аксиальной локализации клетки во время прохождения митоза за разрушением ядерной оболочки следует примерно равномерное распределение β-катенина на оба полюса веретена. В поздней телофазе отмечается самая ранняя асимметрия накопления β-катенина, так что в ядре анимальной сестринской клетки остается меньшее количество белка, а в вегетативной клетке происходит аккумуляция ядерного β-катенина. На протяжении интерфазы эта начальная асимметрия постепенно усиливается. Анализируя результаты функциональных тестов, Шнайдер и Боверман (Schneider, Bowerman, 2007) приходят к выводу об участии β-катенина P. dumerilii в механизме бинарной спецификации клеточной судьбы, описанном в раннем развитии еще двух модельных организмов (Bertrand, 2016). Предполагается, что в каждом митозе происходит определение одного из двух альтернативных путей развития дочерних клеток.

Наши предварительные данные по иммуноцитохимическому выявлению β-катенина и модуляции канонического Wnt-сигналинга в ходе дробления зародышей нереиды A. virens не подтверждают обнаруженные для P. dumerilii закономерности. При использовании четырех различных антител к β‑катенину, специфичность одного из которых идентична указанной в работе американских коллег (Schneider, Bowerman, 2007), мы обнаружили в вегетативных бластомерах (как линии 4d, так и макромерах) пониженное содержание этого белка в интерфазных ядрах по сравнению с цитоплазмой (рис. 4г–е). Хотя антитела не всегда успешно выявляют ядерные антигены, наши данные свидетельствуют о том, что избирательной стабилизации β-катенина в наиболее вегетативных бластомерах – предшественниках мезодермы и энтодермы – не происходит, т.е. на проанализированных стадиях (от 8 клеток до начала гаструляции) канонический путь на вегетативном полюсе не задействован. Применение негативных регуляторов endo-IWR-1 (10 мкМ) и PNU-74654 (5 и 25 мкM) в период дробления незначительно повлияло на спецификацию и морфогенез мезодермальных полосок. Однако гиперактивация Wnt-пути с помощью агентов Azakenpaullone-1 (2 и 5 мкМ) и BIO (1 и 5 мкM) вела к масштабным нарушениям развития. Многие ткани оставались малоклеточными образованиями, нарушалась организация ресничных шнуров, но у подопытных личинок сохранялись признаки билатеральной симметрии и дифференциации туловищной мезодермы (например, присутствовала экспрессия гена-маркера Avi-twist (Козин, Костюченко, 2016; Kozin et al., 2016), с помощью меченого фаллоидина выявлялись мышечные элементы). Таким образом, в противоположность результатам на видах с гомоквадрантным спиральным дроблением (немертина C. lacteus и моллюск C. fornicata) необходимость канонического Wnt-сигналинга для формирования и дифференциации вегетативных производных (мезэнтодермы) у зародышей аннелид остается недоказанной. По-видимому, эмбриональный организатор мезэнтодермальной природы, описанный у некоторых Spiralia (Lambert, 2008; Козин и др., 2013; Козин, Костюченко, 2016), при гетероквадрантном дроблении имеет совершенно особые (независимые в разных таксонах) механизмы развития, в большей степени использующие автономную спецификацию.

Исследования проведены при финансовой поддержке РФФИ (грант 18-04-01335 (анализ механизмов развития мезодермы аннелид)) и РНФ (грант 17-14-01089 (биоинформационный анализ)) с использованием оборудования ресурсных центров “Развитие молекулярных и клеточных технологий”, “Центр микроскопии и микроанализа” и Учебно-научной базы “Беломорская” Санкт-Петербургского государственного университета.