Известия РАН. Серия биологическая, 2019, № 4, стр. 400-406

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования были 21-й штамм бактерии P. fluorescens, который стимулировал рост и повышал биомассы различных культурных растений при их выращивании на не загрязненной тяжелыми металлами почве (Шабаев, 2006), и растения ячменя Hordeum vulgare L. Кроме того, была отмечена высокая эффективность использования данной бактерии на загрязненной Pb почве. При этом повысилась устойчивость растений ячменя к токсическому действию металла и значительно снизилось его поступление в вегетативную массу растений на ранних стадиях их развития (Шабаев, 2012). Растения выращивали в вегетационных сосудах, которые были наполнены бывшей пахотной серой лесной почвой (слой 0–20 см), находившейся в условиях залежи в последние годы на опытно-полевой станции института. В почву вносили раствор Cd(NO₃)₂ ⋅ 4H₂O квалификации х. ч. (Реахим, Россия) из расчета 10 мг Cd/кг почвы на фоне внесения азотнокислого аммония, двузамещенного фосфорнокислого калия и сернокислого калия из расчета по 100 мг действующего вещества на 1 кг почвы. При посеве пророщенные семена раскладывали на почве, инокулировали водной суспензией чистой культуры бактерии в водопроводной воде из расчета 10⁸ клеток на растение и засыпали трехсантиметровым слоем почвы. В варианте без инокуляции вносили аналогичным образом эквивалентное количество автоклавированной бактериальной суспензии. Влажность почвы в сосудах в течение вегетационного периода поддерживали на уровне 60% полной влагоемкости.

Опыт 1. В сосудах диаметром 10 см и высотой 11 см, наполненных 800 г почвы, выращивали по 5 растений ячменя сорта Московский 2 до фазы колошения в течение 45 сут. В контрольном варианте растения выращивали без внесения Cd и без инокуляции бактерией, в двух других – на фоне загрязнения почвы Cd без и с инокуляцией бактерией P. fluorescens 21.

Опыт 2. В сосудах диаметром 10 см и высотой 11 см, наполненных 800 г почвы, выращивали по 12 растений ячменя сорта Суздалец в течение 28 сут, по прошествии которых растения находились в фазе трубкования. В контрольном варианте растения выращивали без внесения Cd и без инокуляции бактерией. Загрязнение почвы Cd осуществляли без и с инокуляцией бактерией P. fluorescens 21.

Опыт 3. В сосудах, содержащих 5 кг почвы, выращивали по 13 растений ячменя сорта Суздалец до полного созревания. Загрязнение почвы Cd проводили без и с инокуляцией бактерией P. fluorescens 21. Кроме того, в опыте в качестве контроля был вариант без внесения Сd и без инокуляции бактерией.

Повторность опытов 1 и 3 была четырехкратная, а опыта 2 – трехкратная. В опытах все варианты выравнивали по количеству азота с учетом азота, внесенного в вариантах с загрязнением почвы солью Cd, и доводя дозу азота в этих вариантах дополнительным внесением NH₄NO₃ до уровня аналогичного таковому в контрольном варианте (без внесения Cd(NO₃)₂ ⋅ 4H₂O и без инокуляции бактерией).

Зеленую массу (листья и стебли), зерно, солому (листья, стебли и полова) и корни высушивали при 70°С и взвешивали. Корни отмывали от почвы водопроводной водой, а затем промывали дистиллированной водой. После сжигания в смеси концентрированных кислот HNO₃ и HСlO₄ (2 : 1) растительный материал (0.5–1 г) анализировали на содержание Cd. В опыте 1 после срезания растений в фазе колошения фракционировали соединения кадмия в почве методом последовательных селективных вытяжек (Теория…, 2006). Выделяли обменную фракцию Cd (экстрагент – Са(NO₃)₂), специфически сорбированную, связанную с карбонатами (CH₃COOH), связанную с органическим веществом (K₄P₂O₇) и с железистыми минералами (реактив Тамма). Содержание Cd в остаточной фракции (негидролизуемой, связанной с глинистыми минералами) в почве определяли по разности между внесенным в почву количеством тяжелого металла и суммарным содержанием металла во фракциях, выделенных указанными выше экстрагентами. Содержание Cd в растворах определяли методом эмиссинно-оптической спектроскопии индуктивно-связанной плазмы на спектрометре ICP OES Optima 5900 DV (Perkin Elmer, CША).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При применении бактерии P. fluorescens 21 в опыте 1 было установлено снижение более чем в 2 раза содержания Cd в вегетативной массе растений ячменя (в сумме листьев и стеблей) в фазе колошения, а также в корнях – в виде тенденции по отношению к контролю – варианту с загрязнением почвы тяжелым металлом без инокуляции бактерией (табл. 1). В корневой системе как не инокулированных, так и инокулированных бактериями растений содержалось примерно на порядок больше металла, чем в вегетативной массе. В загрязненных условиях внесение бактерии не оказывало положительного влияния на рост растений, за исключением увеличения массы корней на 15%.

В опыте 2 без внесения бактерии P. fluorescens 21 установлено токсическое действие Cd на растения ячменя в фазе трубкования, которое проявлялось в снижении вегетативной массы растений (в сумме листьев и стеблей) на 18% по сравнению с контролем (табл. 1). Применение бактерии в условиях загрязнения почвы Cd оказало положительное влияние на рост растений, увеличив суммарную массу листьев и стеблей ячменя на 20% относительно варианта без инокуляции, при этом вегетативная масса была примерно такой же, как и для не инокулированных растений, выращенных на не загрязненной металлом почве. При загрязнении почвы Cd не было установлено негативного влияния металла на рост корневой системы неинокулированных растений, а внесение бактерии cпособствовало значительному (на 27%) увеличению массы корней относительно варианта без инокуляции. Биомасса целых растений в загрязненных условиях под влиянием бактерии уменьшилась на 16%, тогда как этот показатель при внесении бактерии был практически такой же, как и в контрольном варианте – без загрязнения и инокуляции. В фазе трубкования в контрольном варианте Cd не был обнаружен в надземных органах растений, в корнях была зафиксирована следовая концентрация металла (табл. 1, опыт 2). Загрязнение почвы тяжелым металлом сопровождалось значительным увеличением содержания Cd в растениях. При внесении бактерии не было обнаружено изменений в концентрации Cd в листьях и стеблях загрязненных металлом растений, в то же время значительно (на 22%) уменьшился этот показатель в корневой системе инокулированных растений.

При загрязнении почвы Cd в опыте 3 без инокуляции бактерией P. fluorescens 21 также было обнаружено значительное ингибирующее действие металла на рост растений ячменя в фазе полной спелости (табл. 2). Это выражалось в уменьшении биомассы целых растений на 16% (в том числе зерна на 23%) по сравнению с контролем. Масса соломы загрязненных растений без использования бактерий уменьшалась в виде тенденции, а масса корней не изменялась. На фоне вызванного под влиянием загрязнения почвы Cd достоверного уменьшения надземной массы (зерна и соломы) неинокулированных растений при использовании бактерий не установлено негативного влияния тяжелого металла на растения. Внесение бактерии в загрязненных условиях обеспечило получение такой же массы зерна, как и у неинокулированных растений в незагрязненной почве. Кроме того, при этом было обнаружено увеличение в виде тенденции массы соломы и целых растений, инокулированных бактерией. В загрязненных условиях масса соломы и суммарная масса инокулированных бактерией растений были на 23–25% больше, чем у неинокулированных растений. При внесении бактерии P. fluorescens 21 в наибольшей степени (на 20%) возрастала масса корней загрязненных растений относительно варианта с загрязнением почвы Cd без инокуляции бактерией и на 18% по сравнению с контролем – вариантом без внесения Cd и бактерии (табл. 2).

Ранее было показано, что повышенное содержание Cd в корнеобитаемой зоне в первую очередь тормозит рост и уменьшает массу корней растений (Казнина, Титов, 2013). Нами в результате проведенных экспериментов установлено, что загрязнение серой лесной почвы Cd из расчета 10 мг/кг почвы не оказало негативного влияния на рост корневой системы ячменя. Внесение бактерии в загрязненных условиях оказывало положительное влияние на рост корневой системы растений, увеличивая ее массу до даже более высокого уровня, чем в контрольном варианте – без загрязнения Cd и без инокуляции.

При полной спелости ячменя в опыте 3 в контрольном варианте в надземной части растений, как и в фазе трубкования в опыте 2, не был обнаружен Cd, в корнях содержались следовые концентрации металла (табл. 2). Применение бактерии в загрязненных условиях не приводило к изменениям концентрации Сd в зерне, в котором независимо от инокуляции содержалось 2 мг/кг металла, что было на порядок выше предельно допустимых концентраций для зерна (Казнина, Титов, 2013) и, несомненно, связано с высоким уровнем загрязнения почвы. Под влиянием бактерии наблюдалось значительное (на 38%) снижение концентрации металла в корнях, однако при этом не было установлено достоверных изменений этого показателя в соломе. Содержание металла в зерне было примерно на порядок меньше такового в соломе и почти на два порядка меньше, чем в корневой системе.

Во всех исследованных фазах развития растений в опытах независимо от использования бактерий в cуммарной биомассе растений, включая корни, накапливалось ничтожно малое количество металла – максимум ~2% (табл. 1–2). Таким образом, основная часть внесенного Cd (~98%) была локализована в почве. Определение фракционного состава соединений Cd в почве методом последовательных селективных вытяжек в фазе колошения ячменя в опыте 1 показало, что в варианте с внесением бактерии P. fluorescens 21 обнаружено увеличение на 20% содержания тяжелого металла во фракции, связанной с органическим веществом почвы и извлеченной пирофосфатом калия (табл. 3). В этом варианте также установлено некоторое увеличение закрепления металла в негидролизуемой фракции, прочно связанной глинистыми минералами, причем происходило одновременное уменьшение содержания Cd во фракции, связанной с железистыми минералами. После срезания растений в почве были обнаружены следовые и незначительные концентрации Cd соответственно в обменной и специфически сорбированной карбонатами фракциях. Основная часть внесенного в почву тяжелого металла была локализована во фракциях, связанных с органическим веществом и с железистыми минералами, и в негидролизуемой фракции.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные результаты показывают, что внесение бактерии P. fluorescens 21 полностью устраняет токсическое действие Cd на растения ячменя и увеличивает биомассу растений в загрязненных условиях до уровня, который не меньше такового на не загрязненной почве без бактериальной инокуляции. Таким образом, использование бактерий стимулирует рост и повышает устойчивость растений при их выращивании на загрязненной тяжелым металлом почве. Устойчивость растений к токсическому действию Сd при внесении бактерий обусловлена повышенным ростом корней и уменьшением концентрации и аккумуляции металла в корневой системе загрязненных металлом растений. Преимущественная аккумуляция Cd в корнях по сравнению с его аккумуляцией в надземных органах растений определяется барьерными функциями корневой системы растений по отношению к токсичным тяжелым металлам (Титов и др., 2007). Таким образом, снижение поступления Cd в корневую систему инокулированных бактерией растений, несомненно, происходит вследствие усиления физиологических барьерных функций корневой системы. Уменьшение концентрации Сd в корнях инокулированных бактериями растений, обнаруженное во всех фазах развития растений, в том числе при полной спелости, могло быть также обусловлено биологическим или ростовым разведением вследствие увеличения при этом биомассы корней загрязненных тяжелым металлом растений (Lebeau et al., 2008).

Ранее было показано, что повышенное содержание Cd в корнеобитаемой зоне в первую очередь тормозит рост и уменьшает массу корней растений (Казнина, Титов, 2013). Нами в результате проведенных экспериментов установлено, что загрязнение серой лесной почвы Cd из расчета 10 мг/кг почвы не оказало негативного влияния на рост корневой системы ячменя. Это, вероятно, могло быть обусловлено тем, что ячмень – один из устойчивых к токсическому действию Cd видов в отличие от других злаковых культур (Казнина, Титов, 2013). В проведенных экспериментах данная бактерия, оказывая положительное влияние на растения при загрязнении почвы Cd, по-разному влияла на накопление вегетативной биомассы растений и поступление в них металла, что, вероятно, могло быть связано с различными условиями экспериментов. При негативном влиянии Cd на рост вегетативной массы растений не было обнаружено изменений концентрации этого элемента в растениях при внесении бактерии (опыт 2) и, напротив, этот показатель уменьшался в отсутствие негативного влияния Cd на рост вегетативной массы растений (опыт 1).

Известно, что Сd обладает высокой биодоступностью и способностью конкурировать с различными ионами за обменные позиции в молекулах различных соединений, в составе которых этот элемент поступает в растения через транспортные мембраны (Clemens, 2001; Казнина, Титов, 2013). Бактерия P. fluorescens 21 не оказывала влияния на содержание Cd в вегетативных органах растений и зерне в опытах 2 и 3. Это свидетельствуют о том, что Cd преодолевает физиологические барьеры инокулированных бактерией растений на границах корни–стебли, стебли–листья и вегетативная масса–зерно. Таким образом, нивелировалось положительное действие бактерии на снижение поступления Cd в надземную часть растений, которое было обнаружено ранее для ячменя при загрязнении почвы Pb (Шабаев, 2012).

Полученные результаты показывают, что бóльшая часть внесенного Cd локализуется в почве в составе стабильных соединений вследствие проявления барьерных функций почвы по отношению к тяжелым металлам. Уменьшение содержания Cd в корнях инокулированных бактерией P. fluorescens 21 растений также могло быть связано с усилением под влиянием бактерии барьерных функций почвы и снижением при этом подвижности металла в почве.

Аналогичное преимущественное закрепление Pb в почве в органической форме при внесении бактерии P. fluorescens 21 и усиление устойчивости растений ячменя к токсическому действию Pb были выявлены ранее при загрязнении серой лесной почвы водорастворимым соединением тяжелого металла (Шабаев, 2012). Увеличение содержания Cd в почвенной органической фракции при применении бактерии P. fluorescens 21, вероятно, обусловлено секвестированием металла продуцируемыми бактерией органическими экзометаболитами – сидерофорами. Флуоресцирующие виды Pseudomonas продуцируют высокое содержание сидерофоров – хелатирующих агентов низкомолекулярной массы, обладающих экстремально высоким сродством к Fe(III) (Смирнов, Киприанова, 1990; Loper, Buyer, 1991). Бактериальные сидерофоры также способны хелатировать тяжелые металлы, в том числе Cd, с образованием нерастворимых комплексов и вследствие этого уменьшать подвижность и токсичность этих металлов (Zawadzka et al., 2009). Образование подобных стабильных комплексов, вероятно, приводило к уменьшению концентрации свободных катионов Cd в зоне всасывания корневой системы растений. Обнаруженное при использовании бактерии P. fluorescens 21 связывание Cd в почве в составе органических соединений свидетельствует об усилении барьерных функций почвы по отношению к этому тяжелому металлу.

Кроме того, нельзя исключить, что корневые выделения инокулированных растений способствовали увеличению связывания Cd в почве, ограничивая его проникновение в корневую систему растений (Казнина, Титов, 2013). Эти же авторы предполагают, что выделение фитосидерофоров корнями злаковых культур – важный механизм детоксикации Сd (Казнина, Титов, 2013).

Вероятно, вследствие этих процессов, происходящих в растениях и в почве при внесении бактерии, уменьшилась биодоступность Cd и повысилась устойчивость инокулированных бактерией растений к тяжелому металлу в начальные, наиболее критические периоды роста растений. Таким образом, устойчивость растений ячменя к токсическому действию Cd при использовании ростстимулирующей ризосферной бактерии P. fluorescens 21, которая выражалась в отсутствии негативного влияния металла на рост вегетативных органов растений, обусловлена повышенным ростом корневой системы инокулированных растений и уменьшением поступления Cd в корни вследствие усиления барьерных функций корней и почвы по отношению к тяжелому металлу.

Применение данной бактерии может быть рекомендовано при разработке стратегий биоремедиации почв, загрязненных Cd, на основе экологически безопасных технологий. Бактерия может быть использована для создания инокулята (бактериального препарата) в целях повышения продуктивности ячменя при загрязнении почвы тяжелым металлом.

Применение бактерии P. fluorescens 21 при загрязнении почвы Сd полностью устраняло токсическое действие тяжелого металла на растения ячменя, обеспечивая при этом получение не меньшей растительной биомассы, как и на незагрязненной почве без бактериальной инокуляции. Устойчивость растений к Сd при внесении бактерии обусловлена усилением барьерных функций корневой системы (повышенным ростом корней и уменьшением поступления металла в корни) и барьерных функций почвы (увеличением закрепления металла в почвенной органической фракции).

В работе использованы материалы исследований по теме госзаданий № АААА-А18-118013190180-9, АААА-А17-117030110139-9 и № АААА-А18-118013190181-6.