Известия РАН. Серия биологическая, 2019, № 5, стр. 485-494

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Отбор заселенных микофагами плодовых тел сапротрофных и микоризных грибов, а также образцов растительного опада проводили в течение вегетационного сезона (с мая по октябрь 2016 г.) на биогеоценологической станции Малинки ИПЭЭ РАН (55.4595° с.ш., 37.1794° в.д.). Территория, прилегающая к биостанции, покрыта переспелыми хвойными 150–160-летними лесами (ельники-кисличники, ельники мертвопокровные, сосняки сложные).

Ржавчинные грибы и питающиеся ими личинки Mycodiplosis sp. были собраны в июне и июле 2016 г. на территории Звенигородской биологической станции биологического факультета МГУ (55.6996° с.ш., 36.7227° в.д.). Образцы ржавчинных грибов Puccinia bromina, Coleosporium tussilaginis, Puccinia caricina и сборного вида Melampsora salicina были отобраны вместе с зелеными листьями растений, на которых они развивались (Pulmonaria officinalis, Tussilago farfara, Urtica dioica, Salix spp.).

Всего было собрано 92 плодовых тела микоризных грибов, 57 плодовых тел сапротрофных грибов, а также 20 проб ржавчинных паразитических грибов. Микоризные грибы были представлены 11 видами из 7 родов, сапротрофные – 10 видами из 8 родов, ржавчинные – 4 видами из 3 родов (табл. 1).

Средние значения δ¹³С и δ¹⁵N свежего листового опада в окрестностях биостанции Малинки составили в среднем –30.1 ± 0.3‰ и –0.5 ± 0.3‰ соответственно (n = 20).

Трофическое фракционирование (δ) определяли как разницу изотопного состава животных и субстрата, из которого они были извлечены:

Результаты анализировали с помощью регрессионного (корреляция Пирсона) и дисперсионного анализа (ANOVA). Проверка на нормальность распределения и гомогенность вариации не выявила необходимости предварительной трансформации данных. Сравнение средних величин было выполнено с помощью множественного критерия Тьюки (Tukey HSD), попарное сравнение – с помощью t-критерия Стьюдента (t-test). Расчеты были выполнены в пакете STATISTICA 8. Изотопный состав отдельных групп грибов и мицетофагов на графиках сравнивали с использованием стандартных эллипсов, ограничивающих область 95%-ного доверительного интервала (Jackson et al., 2011). Вычисления площади и перекрытий эллипсов были выполнены в пакете SIBER среды R (R Core Team, 2014). В тексте представлены средние величины ± стандартное отклонение (SD).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изотопный состав гименофоров отдельных видов макромицетов довольно сильно варьировал (табл. 1), однако закономерно различался у грибов, принадлежащих к разным функциональным группам (рис. 1). Средние значения δ¹³C составили –25.8 ± 1.4‰ у микоризных, –24.3 ± 0.7‰ у сапротрофных и –29.4 ± 1.5‰ у ржавчинных грибов. Сапротрофные грибы были в среднем сильнее обогащены ¹³C относительно опада по сравнению с другими грибами (HSD; P < 0.001). Ржавчинные грибы практически не отличались по изотопному составу от растений, на которых они паразитировали.

Рис. 1.

Изотопный состав (значения δ¹³C и δ¹⁵N) микоризных (1), сапротрофных (2) и паразитических (3) грибов. 4 – средний изотопный состав растительных тканей. Каждая точка отражает результаты анализа одной пробы; для высших грибов – гименофоров, для ржавчинных – спороношений. Эллипсы ограничивают область 95%-ного доверительного интервала.

Средние значения δ¹⁵N составили 7.4 ± 2.3‰ у микоризных, 2.1 ± 1.5‰ у сапротрофных и 0.6 ± ± 0.7‰ у ржавчинных грибов. Микоризные грибы были значительно сильнее обогащены ¹⁵N относительно опада по сравнению с прочими грибами (HSD; P < 0.05). Перекрытие областей вероятных значений составило 22.3% для микоризных и сапротрофных и только 0.2% для ржавчинных и сапротрофных грибов (рис. 1).

В выборке сапротрофных грибов ткани гименофора были обогащены ¹³С и ¹⁵N относительно тканей ножки; для δ¹⁵N различия были статистически значимы. У микоризных грибов значения δ¹³С и δ¹⁵N в шляпках и ножках не различались (рис. 2).

Рис. 2.

Изотопный состав (δ¹³C (а) и δ¹⁵N (б), среднее ± SD) гименофора (1) и ножки (2) у сапротрофных (I) и микоризных (II) и грибов. * – статистически значимые различия (HSD test, P < 0.05).

Изотопный состав личинок-мицетофагов коррелировал с изотопным составом грибных субстратов (R = 0.79 для δ¹³С и 0.82 для δ¹⁵N) и статистически значимо различался у личинок, питавшихся грибами разных функциональных групп (δ¹³С: F = = 179.4, δ¹⁵N: F = 97.6, Р < 0.001 (табл. 2)).

Значения Δ¹³С и Δ¹⁵N также различались у мицетофагов, потреблявших грибы разных функциональных групп (F = 9.8 и 41.1 соответственно, P < 0.001). Трофическое фракционирование было незначительным у личинок галлиц, питавшихся ржавчинными грибами, Δ¹³С = 0 ± 1.2‰ и Δ¹⁵N = = 0.9 ± 1.0‰. У разных видов двукрылых, питавшихся сапротрофными и микоризными грибами, трофическое фракционирование варьировало в довольно широких пределах: от –1.4 до 2.5‰ для δ¹³С и от 0.7 до 8.5‰ для Δ¹⁵N (рис. 3).

Рис. 3.

Трофическое фракционирование (Δ¹³С и Δ¹⁵N) микофагов на микоризных (1), сапротрофных (2) и паразитических (3) грибах. Каждая точка отражает результаты анализа одной пары проб (грибных тканей и мицетофага). Эллипсы ограничивают область 95%-ного доверительного интервала.

Трофическое фракционирование изотопов азота было в среднем сильнее, а фракционирование изотопов углерода слабее при питании личинок сапротрофными грибами, чем при питании микоризными грибами, однако разница была статистически значима только у некоторых таксонов (Pegomya sp., Mycetophila sp., Megaselia sp., Metalimnobia quadrimaculata (табл. 3)). В среднем по всему массиву данных Δ¹³С и Δ¹⁵N, у личинок двукрылых в макромицетах составили 0.9 ± 0.2‰ и 3.4 ± 0.4‰ соответственно (каждый вид на микоризных или сапротрофных грибах принят за одну повторность, n = 23).

Изотопная подпись микофагов и степень трофического фракционирования не зависели от локализации (шляпка или ножка), несмотря на статистически значимые (в случае сапротрофных грибов) различия изотопного состава разных частей плодовых тел. Мы не обнаружили статистически значимых корреляций между отношением С/N в тканях грибов или микофагов и величинами δ¹⁵N грибов или личинок, а также Δ¹⁵N. Величины δ¹³C_грибы и δ¹³C_{мицетофаги} отрицательно коррелировали с отношением С/N как в плодовых телах грибов, так и в тканях мицетофагов (R = –0.610 и –0.727 соответственно, P < 0.05). Величина δ¹³С слабо, но статистически значимо уменьшалась при увеличении значения С/N в тканях мицетофагов (R = –0.434, P < 0.05).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Вариабельность степени трофического фракционирования изотопов азота и иных элементов остается “узким местом изотопной экологии”. В силу невозможности экспериментальной оценки величины Δ¹⁵N в каждой паре пища–консумент при реконструкции трофических связей обычно используется усредненная величина (3.4‰ на один трофический уровень), хотя нет сомнений, что на самом деле она колеблется в широких пределах. В частности, в детритных пищевых сетях наблюдается очень небольшое обогащение первичных сапрофагов ¹⁵N по сравнению с растительным опадом, но неожиданно большое накопление ¹³С (так называемый детритный сдвиг) (Korobushkin et al., 2014; Kudrin et al., 2015; Potapov et al., 2019).

Пищей почвенных сапрофагов служат преимущественно сапротрофные микроорганизмы (Стриганова, 1980). Лабораторные опыты показывают, что особенности изотопного состава сапрофагов определяет прежде всего характер фракционирования изотопов в системе растительные остатки–микроорганизмы (Potapov et al., 2013), но это положение требует подтверждения в полевых экспериментах. Получение информации об изотопном составе обитающих в почве микроорганизмов представляет значительные методические трудности (Tiunov et al., 2015). Однако плодовые тела макромицетов и связанные с ними личинки двукрылых могут быть удобной моделью для оценки степени трофического фракционирования в системе грибы–мицетофаги. Это особенно важно в связи с выраженной разницей изотопного состава сапротрофных и микоризных грибов. Хорошо известно, что плодовые тела микоризных грибов в среднем обогащены ¹⁵N и обеднены ¹³С по сравнению с плодовыми телами сапротрофных макромицетов (Henn, Chapela, 2001; Mayor et al., 2009). Наши данные подтверждают этот феномен, хотя разница величин δ¹³С плодовых тел сапротрофных и микоризных грибов была в среднем небольшой (рис. 1). Устойчивая и существенная разница величин δ¹⁵N сапротрофных и микоризных грибов (в нашей выборке ~5‰, табл. 2) предполагает, что валовой изотопный анализ позволяет относительно четко разделять “микоризные” и “сапротрофные” потоки вещества и энергии в почвенных пищевых сетях.

Вопреки ожиданиям, анализ изотопного состава почвенных мицетофагов не дает указаний на активное питание микоризными грибами (Kudrin et al., 2015; Potapov, Tiunov, 2016). Эти данные отчасти противоречат результатам экспериментальных работ (Pollierer et al., 2007) и требуют верификации. Отсутствие “микоризного сигнала” можно объяснить как неполным соответствием изотопного состава плодовых тел и вегетативного мицелия (Wallander et al., 2004), так и особенностями трофического фракционирования при питании грибами разных функциональных групп.

Оценка изотопного состава плодовых тел макромицетов затруднена их химической и изотопной гетерогенностью. Как правило, гименофоры (или шляпки) грибов обогащены ¹⁵N и ¹³С по сравнению со стерильными тканями (или ножками). Это связано, по-видимому, с аккумуляцией в генеративных тканях грибов соединений белковой природы, которые обогащены ¹³С и ¹⁵N по сравнению с запасающими (липиды) и структурными (хитин) соединениями (Hobbie et al., 2012). Мы не ставили целью систематически исследовать вариации изотопного состава отдельных частей плодовых тел; в нашей выборке наблюдалось выраженное обогащение ¹³С и ¹⁵N гименофоров у сапротрофных, но не у микоризных грибов (рис. 2).

Изотопный состав тканей насекомых также неоднороден. Обнаруженное уменьшение значений δ¹³С тканей личинок при увеличении отношения С/N, т.е. содержания в тканях жиров, вполне соответствует известному феномену обеднения липидов ¹³С (Цуриков и др., 2015). Этим же можно объяснить уменьшение δ¹³С при увеличении отношения C/N в тканях личинок. Кроме того, мы использовали усредненные пробы, полученные после гомогенизации целого тела личинок. Наличие в пробе содержимого кишечника могло внести ошибку в определение изотопного состава животных. Подобная ошибка, по-видимому, неизбежна при работе с мелкими почвенными сапрофагами (коллемболами, клещами, нематодами), и мы не стремились избежать ее в нашей модельной системе. Отношение C/N по массе было существенно шире в тканях грибов (в среднем 11.2 ± 0.4), чем в тканях мицетофагов (5.1 ± 0.1). Таким образом, увеличение отношения C/N в пробах личинок могло отражать увеличенный вклад в изотопную подпись содержимого кишечника.

Величины трофического фракционирования изотопов азота существенно варьировали в отдельных парах пища–потребитель. В большинстве случаев значение δ¹⁵N было выше при питании личинок сапротрофными грибами, чем при питании микоризными грибами (табл. 3), однако эта тенденция наблюдалась не всегда. Нам также не удалось обнаружить четкой зависимости между величиной трофического фракционирования изотопов и таксономической принадлежностью животных или грибов. Интересно отметить, что в нашей выборке величина δ¹⁵N была в среднем выше у представителей Anthomyiidae, чем у Mycetophilidae, хотя в другом эксперименте была обнаружена обратная зависимость (Remen, 2010).

Весьма значительный разброс значений δ¹⁵N и δ¹³С в пределах одной таксономической группы микофагов был отмечен и в других опубликованных работах, в том числе в лабораторных экспериментах (рис. 4). Наши оценки δ¹⁵N и δ¹³С оказываются примерно в середине диапазона значений, полученных ранее. Более того, среднее трофическое фракционирование изотопов азота (3.4‰) и углерода (0.9‰) в системе шляпочные грибы–личинки двукрылых близко к значениям, полученным в результате усреднения данных многих экспериментальных работ с разными видами консументов, преимущественно в пастбищных пищевых цепях (Post, 2002; Vanderklift, Ponsard, 2003; Тиунов, 2007).

Рис. 4.

Величины трофического фракционирования изотопов углерода и азота (∆¹³С и ∆¹⁵N) в парах гриб–микофаг (опубликованные ранее дaнные). Полевые сборы, личинки двукрылых: Anthomyiidae (1) и Mycetophilidae (2) на микоризных макромицетах, личинки Mycetophilidae (3) на cапротрофных макромицетах. Коллемболы на сапротрофных микромицетах: Xenylla grisea (4), Vertagopus pseuodocinereus (5), Sinella tenebricosa (6), Protaphorura fimata (7), Heteromurus nitidus (8), Folsomia candida (9). Вертикальные линии показывают среднее трофическое фракционирование мицетофагами на сапротрофных (сап) и микоризных (мик) грибах в наших экспериментах (табл. 3). Использованы ранее опубликованные данные (Scheu, Folger, 2004; Haubert et al., 2005; Ruess et al., 2005; Larsen et al., 2009; Remen, 2010; Staaden et al., 2010; Semenina, Tiunov, 2011; Potapov et al., 2013).

Из общей закономерности выпадают личинки галлиц Mycodiplosis sp., питавшиеся паразитическими грибами. В этой системе отмечена минимальная степень обогащения консументов тяжелыми изотопами. Грибы почти не отличались по изотопному составу от зеленых листьев, которыми они питались (рис. 1), а личинки галлиц были всего лишь на 0.9‰ обогащены ¹⁵N по сравнению с грибами (рис. 3). Причины этого явления до конца неясны, но в целом оно соответствует ситуации, которая наблюдается в пищевых цепях с участием паразитов. Паразиты часто бывают обеднены ¹⁵N по сравнению с хозяевами, что нехарактерно для “нормальных” пищевых отношений (Pinnegar et al., 2001; Navarro et al., 2014). Однако эта особенность проявляется далеко не во всех случаях, и стоящие за ней механизмы пока не расшифрованы (Lafferty et al., 2008).

Таким образом, наиболее важный результат нашей работы – оценка степени трофического фракционирования изотопов азота и углерода в системе грибы–мицетофаги в естественных условиях. Полученные оценки δ¹⁵N и δ¹³С вполне соответствуют величинам, наблюдаемым в пастбищных пищевых цепях. Фракционирование изотопов азота было несколько сильнее у мицетофагов, питающихся сапротрофными грибами, но разница с мицетофагами из микоризных грибов была невелика и в среднем не достигала уровня статистической значимости. Следовательно, вариации степени трофического фракционирования изотопов не должны препятствовать эффективному выявлению “микоризного” и “сапротрофного” энергетических каналов в почвенных пищевых сетях. Наши результаты основаны на исследовании плодовых тел грибов; следующим шагом на пути эффективного использования изотопного анализа в реконструкции трофических связей почвенных грибов и связанных с ними мицетофагов должно стать подробное исследование изотопного состава вегетативного мицелия грибов разных функциональных групп.

Авторы выражают благодарность за помощь в сборе материала Е.А. Астаховой, В.О. Бакуменко, М.И. Варсанофьевой, А.А. Горшковой, Т.В. Логиновой, М.А. Перфильевой, А.Д. Семенову и Д.А. Федорову.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 17-04-01856).