Известия РАН. Серия биологическая, 2019, № 6, стр. 565-571

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом данного исследования была выбрана календула лекарственная Calendula officinalis L., ценное лекарственное растение из семейства сложноцветных Asteraceae. Семена календулы проращивали в чашках Петри на влажной фильтровальной бумаге, после чего их высевали в перлит. В фазе двух настоящих листьев проростки переносили из перлита на модифицированную питательную среду Хогланда−Снайдерс (10 мМ KNO₃, 7.4 мМ KH₂PO₄, 4.1 мМ MgSO₄ ⋅ 7H₂O, 4.2 мМ Ca(NO₃)₂ ⋅ 4H2O, 1.77 мкМ MnSO₄ ⋅ 5H₂O, 8.87 мкМ H₃BO₃, 1 мкМ ZnSO₄ ⋅ 7H₂O, 0.32 мкМ CuSO₄ ⋅ 5H₂O, 0.026 мкМ (NH₄)₆Mo₇O₂ ⋅ 4H₂O, 28.7 мкМ FeSO₄ ⋅ 7H₂O; pH 6.5 ± 0.2). Растения выращивали в камере фитотрона при 12-часовом фотопериоде, освещенности 100 ± 20 мкмоль/(м² ⋅ с), температуре воздуха 22 ± 3°C и относительной влажности воздуха 65 ± 5%. Питательную среду в сосудах меняли каждые 5−6 сут. В возрасте 4 нед растения были разделены на три группы. Растения первой группы выращивали на стандартной питательной среде (контроль). В питательную среду растений второй группы одноразово вносили NaCl до конечной концентрации 150 мМ, а растения третьей группы выращивали в присутствии различных концентраций МФ (10⁻⁷−10⁻¹¹ М) и 150 мМ NaCl. Через 7 сут экспозиции на указанных средах часть растений всех трех групп использовали для проведения биохимических анализов, а оставшиеся растения из контрольной и второй групп продолжали выращивать в течение следующих 7 сут на стандартной питательной среде без соли, но в присутствии или в отсутствие МФ. Это позволило изучать влияние МФ на восстановление растений. По окончании эксперимента в контрольных и опытных растениях были определены морфофизиологические параметры. Часть растительного материала фиксировали в жидком азоте и хранили при −70°С до проведения биохимических анализов. Биомассу растений определяли общепринятым гравиметрическим методом с точностью до 0.1 мг (весы марки OHAUS Scout STX, США).

Интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по основному продукту реакции – малоновому диальдегиду (МДА), содержание которого рассчитывали в микромолях на грамм сырой массы листьев. Для этого использовали метод, основанный на образовании окрашенного комплекса МДА с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) при нагревании (Heath, Packer, 1968). Оптическую плотность растворов измеряли на спектрофотометре Genesys 10 uv (Thermoelectron corporation, США) при длине волны 532 нм и неспецифическом помутнении раствора при 600 нм (контроль – раствор ТБК в трихлоруксусной кислоте).

Содержание свободного пролина определяли с помощью кислого нингидринового реактива методом Бэйтса с соавт. (Bates et al., 1973). Интенсивность окраски определяли спектрофотометрически при длине волны 520 нм. Содержание пролина рассчитывали с помощью калибровочной кривой, для построения которой использовали пролин (Serva, Германия).

Содержание фотосинтетических пигментов определяли методом Лихтенталера (Lichtenthaler, 1987). Для этого проводили экстракцию хлорофиллов а и b и каротиноидов холодным 80%-ным ацетоном в 3-4 кратной повторности до полного обесцвечивания образцов. Оптическую плотность экстрактов определяли при длинах волн 470, 648 и 663 нм.

Данные обрабатывали методами параметрической статистики в среде Microsoft Excel 2007. В каждом варианте опыта было по 7−10 растений. На диаграммах представлены средние значения со стандартными ошибками среднего. Количественные данные были обработаны с помощью однофакторного дисперсионного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты опытов по влиянию широкого диапазона концентраций NaCl (50−250 мМ) на рост растений показали, что календула характеризуется достаточно высокой солеустойчивостью (рис. 1а). Так, выращивание растений в течение 7 сут на питательной среде в присутствии 100 мМ NaCl ингибировало накопление биомассы целого растения лишь на 16%, тогда как рост корневой системы был подавлен на 35% (рис. 1а). Повышение концентрации NaCl до 150 мМ сопровождалось торможением роста растений и корневой системы в среднем на 42 и 70% соответственно по сравнению с контрольными растениями (рис. 1а). При повышении концентрации соли в среде (175−250 мМ NaCl) наблюдалось снижение тургора в листьях и подавление аккумуляции биомассы. В дальнейших экспериментах мы использовали концентрацию 150 мМ NaCl, которая значительно тормозила рост растений, но не приводила к их гибели.

Рис. 1.

Влияние различных концентраций NaCl (а) и мелафена при солевом стрессе (150 мМ NaCl) (б) на рост растений календулы. 1 − сырая масса растения, 2 − сырая масса корневой системы. Длительность экспозиции растений 7 сут. Достоверно различающиеся между собой значения (при р < 0.05) обозначены разными латинскими буквами; для рис. 1−3.

Добавление в среду МФ (10⁻⁷−10⁻¹¹ М) при оптимальных условиях выращивания растений практически не влияло на их рост (данные не приведены), тогда как введение в среду МФ (10⁻⁸−10⁻⁹ М) в присутствии 150 мМ NaCl на 13−16% снижало ингибирующее действие соли на накопление биомассы растений (рис. 1б). МФ в более низких концентрациях (10⁻¹⁰−10⁻¹¹М) практически не влиял на рост растений в условиях стресса (рис. 1б). В последующих экспериментах нами был использован препарат МФ в концентрации 10⁻⁹ М.

Физиологическое состояние растений при солевом стрессе и на этапе восстановления оценивали по ряду параметров (табл. 1). МФ в условиях солевого стресса не только снижал ингибирующее действие 150 мМ NaCl на аккумуляцию биомассы растений, но и несколько стабилизировал водный статус листьев (рис. 1, табл. 1). Засоление вызывало снижение площади листовой поверхности растений календулы на 25−28% по сравнению с контролем. При совместном действии МФ и NaCl наблюдали стимулирование роста верхушечной меристемы, о чем свидетельствуют нормальное развитие листьев V яруса и закладка листьев VI яруса, которые отсутствовали у растений при солевом стрессе в отсутствие МФ (рис. 2а, б).

Рис. 2.

Влияние мелафена на развитие листовой поверхности растений календулы. а, б − при солевом стрессе; в, г − на этапе восстановления растений после солевого стресса; а, в – площадь листовой поверхности, см²; б, г − фотографии листьев, расположенных в порядке их ярусного (I−VII) размещения на стеблях контрольных и опытных растений. 1−3 − растения выращивали 7 сут на стандартной среде (контроль), при солевом стрессе (150 мМ NaCl) и в присутствии 10⁻⁹ М мелафена соответственно, 4 − растения выращивали 14 сут на стандартной среде (контроль), 5 − растения выращивали 7 сут при солевом стрессе (150 мМ NaCl), затем 7 сут на стандартной среде (без NaCl), 6 − растения выращивали 7 сут при солевом стрессе (150 мМ NaCl) затем 7 сут на стандартной среде (без NaCl) в присутствии 10⁻⁹ М мелафена.

К негативным проявлениям избыточного засоления при клеточном метаболизме растений относятся генерация активных форм кислорода и активация ПОЛ. Содержание МДА после 7 сут экспозиции растений в присутствии 150 мМ NaCl увеличилось в среднем в 7 раз по сравнению с контролем (табл. 1). Введение в питательную среду 10⁻⁹ М МФ при засолении снижало концентрацию МДА в среднем в 1.6 раза, что свидетельствует об антиоксидантном эффекте МФ. При этом наблюдалось 10–11-кратное увеличение содержания пролина в условиях солевого стресса. МФ в 2 раза понижал индуцированную NaCl аккумуляцию пролина (табл. 1), что также является дополнительным аргументом в пользу способности МФ уменьшать интенсивность окислительного стресса при засолении. Отметим, что аккумуляция пролина – один из универсальных механизмов защиты растений от действия повреждающих факторов различной природы (Кузнецов, Шевякова, 1999).

Способность МФ понижать активность ПОЛ в растениях была отмечена ранее (Жигачева и др., 2007а, б; Бинюков и др., 2012), в частности было установлено, что в условиях умеренного охлаждения и недостаточного увлажнения проростков гороха предварительная обработка семян раствором МФ приводила к значительному снижению интенсивности ПОЛ (Бинюков и др., 2012; Жигачева и др., 2016). Данный эффект наряду с изменением морфологических характеристик митохондрий гороха авторы объясняют антиоксидантной активностью препарата МФ (Жигачева и др., 2007а, б; Бинюков и др., 2012; Жигачева и др., 2016).

Функциональная активность фотосинтетического аппарата растений зависит от содержания в листьях основных фотосинтетических пигментов. Согласно полученным нами данным, содержание хлорофиллов и каротиноидов в листьях контрольных растений календулы заметно возрастало за 14 сут эксперимента (рис. 3а, б). В условиях солевого стресса (150 мМ NaCl, 7 сут) суммарное содержание пигментов составляло в среднем 74% контрольных значений (рис. 3а). Введение в среду выращивания 10⁻⁹ М МФ при засолении (рис. 3а) не оказывало достоверного воздействия на содержание фотосинтетических пигментов (рис. 3а, б).

Рис. 3.

Влияние мелафена (10⁻⁹ М) на содержание фотосинтетических пигментов в листьях календулы. а − при солевом стрессе (150 мМ NaCl, 7 сут), б − на этапе восстановления. В последнем случае растения выращивали 7 сут при солевом стрессе, затем 7 сут на стандартной среде (без NaCl) в присутствии или в отсутствие 10⁻⁹ М мелафена. 1 − хлорофилл а; 2 − хлорофилл b; 3 − каротиноиды.

Для ответа на вопрос о том, влияет ли МФ на процесс восстановления календулы после солевого стресса, растения выращивали 7 сут при действии 150 мМ NaCl, а затем переносили на стандартную (без NaCl) среду в присутствии МФ (10⁻⁹ М) или без него. За 7 сут выращивания растений на бессолевой среде (после экспозиции в присутствии NaCl) их масса увеличилась примерно в 2 раза по сравнению с массой растений, выращиваемых в присутствии NaCl (табл. 1). На этапе восстановления в присутствии 10⁻⁹ М МФ наблюдали повышение тургора, содержания воды в листьях и увеличение площади листовой поверхности по сравнению с аналогичными показателями у растений, не получавших препарат МФ в период восстановления (табл. 1). После снятия стрессорного воздействия в растениях в присутствии МФ был отмечен верхушечный рост побега, о чем свидетельствует развитие листьев VI яруса и закладка листьев VII яруса (рис. 2в, г). Результаты по активизации роста и улучшению физиологических процессов при действии МФ были получены на Chlorella vulgaris Beijer и некоторых других видах растений (Загоскина и др., 2007; Фаттахов и др., 2014).

При солевом стрессе, как и после удаления избытка соли из среды выращивания, МФ снижал интенсивность ПОЛ в листьях растений. Об этом свидетельствует существенное уменьшение (на 40%) содержания МДА у растений, восстановление которых происходило в присутствии МФ по сравнению с растениями, на которые МФ не действовал (табл. 1).

Суммарное содержание пигментов в листьях календулы на этапе восстановления повышалось и составило в среднем 83% содержания контрольных растений (рис. 3б). При введении в среду выращивания 10⁻⁹ М МФ как при солевом стрессе (рис. 3а), так и на этапе восстановления (рис. 3б) достоверных отличий в содержании фотосинтетических пигментов в листьях обнаружено не было (рис. 3а, б). Ранее было установлено, что МФ не оказывал влияния на содержание фотосинтетических пигментов в растениях ячменя и не вовлекался в регуляцию транскрипции пластидного генома (Кузнецов и др., 2010).

Таким образом, при солевом стрессе (150 мМ NaCl) МФ (10⁻⁹ М) повышал устойчивость растений календулы к засолению, о чем свидетельствуют улучшение ростовых характеристик, стабилизация водного статуса, снижение содержания МДА и пролина. При снятии солевого стресса МФ облегчал процесс восстановления растений, что проявлялось на уровне аккумуляции биомассы, увеличения общей площади листовой поверхности, снижения интенсивности окислительного стресса. Можно полагать, что в основе повышения солеустойчивости растений и ускорения процесса их восстановления лежит антиоксидантный эффект МФ, который реализуется в его способности снижать интенсивность ПОЛ. Полученные результаты могут найти применение при разработке технологии выращивания лекарственных растений на засоленных, не используемых в настоящее время территориях.