Известия РАН. Серия биологическая, 2019, № 6, стр. 586-589

Криоконсервация дрозофил или как сэкономить на содержании коллекции

Л. П. Захаренко 12*

1 Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук
630090 Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 10, Россия

2 Новосибирский государственный университет
630090 Новосибирск, ул. Пирогова, 2, Россия

* E-mail: zakharlp@bionet.nsc.ru

Поступила в редакцию 15.05.2017
После доработки 22.10.2018
Принята к публикации 21.02.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

Проведен анализ литературы по криоконсервации Drosophila melanogaster, коллекции которой насчитывают сотни тысяч линий. Отмечено, что криоконсервация эмбрионов D. melanogaster возможна лишь на 14-й стадии развития после пермеабилизации хориона, препятствующего проникновению криопротекторов, и завершается успехом в 3% случаев. Успешная криоконсервация личинок и имаго дрозофил проведена пока только для вида Chymomyza costata. Установлено, что сэкономить затраты на поддержание коллекции D. melanogaster можно, удлинив онтогенез за счет снижения калорийности корма и температуры содержания, а также укорочения светового периода.

Дрозофила как объект генетических исследований пользуется большой популярностью. В мире существует несколько больших коллекций дрозофил, содержащих сотни тысяч линий (http://flybase.org/). В каждой лаборатории, использующей дрозофилу как модельный организм, также есть небольшие коллекции. Хранение коллекции дрозофил трудоемко и требует больших финансовых затрат. Кроме этого в процессе хранения есть риск потери или генетического загрязнения линии. Теряется также гетерозиготность исходной линии из-за близкородственных скрещиваний, обычно практикуемых при поддержании линий. Необходимость сохранения линий и желание сэкономить на содержании коллекций вызвали интерес к криоконсервации дрозофил. Первая попытка заморозить эмбрионы дрозофилы была предпринята в 1989 г. (Lynch et al., 1989; Myers et al., 1989). К этому времени были достигнуты значительные успехи в криоконсервации генеративных клеток и зародышей млекопитающих (в том числе человека) и клеточных линий растений (Mazur, 1970). В настоящее время >50% замороженного биологического материала сохраняет жизнеспособность после криоконсервации (Riggs et al., 2008). Попытки криоконсервации насекомых оказались менее успешными (Mazur et al., 1992a, b,1993).

КРИОКОНСЕРВАЦИЯ ЭМБРИОНОВ ДРОЗОФИЛЫ

Основная причина гибели клеток при замораживании – образование кристаллов, повреждающих клеточные структуры. По этой причине клетки перед замораживанием выдерживают в растворах криопротекторов, защищающих структуру биополимеров, и проводят так называемую витрификацию, благодаря которой вместо кристаллов льда образуется стеклоподобная структура.

Яйцо дрозофилы покрыто хорионом, не проницаемым для криопротекторов и воды, что является одним из основных препятствий для криоконсервации этого объекта. Проницаемость хориона можно увеличить с помощью пермеабилизации химическими растворителями, в частности 0.3%-ным раствором 1-бутанола в n-гептане в течение 1.5 мин (Mazur et al., 1992b). Оказалось, что эмбрионы дрозофилы на разных стадиях развития обладают разной чувствительностью к таким обработкам (Myers et al., 1989). После обработки смесью бутанола и гептана жизнеспособные личинки вылупляются из 80% эмбрионов, находящихся на 14-й стадии развития. Эмбрионы, находящиеся на более ранних или более поздних стадиях, такую обработку не выдерживают и погибают.

После пермеабилизации хориона эмбрион выдерживают в криопротекторе и замораживают. В качестве криопротекторов используют сахара и их заменители, аминокислоты и их производные, метиламины (Yancey et al., 1982; Yancey, Siebenaller, 2015), позволяющие сохранять осмотическое давление в цитоплазме и ядре. При криоконсервации популярны также глицерин и диметилсульфоксид. В экспериментах на эмбрионах дрозофилы в качестве криопротектора использовали разные концентрации этиленгликоля или смесь этиленгликоля с поливинилпирролидоном (Mazur et al., 1992a, b, 1993). На этом этапе крайне важен режим (скорость) заморозки. Яйцо дрозофилы в 3–4 раза крупнее, чем яйцеклетка человека, и содержит большое количество желтка, что, возможно, снижает скорость замораживания эмбрионов и отрицательно сказывается на результатах. К 14-й стадии развития большая часть желтка расходуется, возможно поэтому именно эта стадия развития оказывается менее чувствительной к замораживанию. Конец эмбрионального периода может быть более чувствительным к экстремальным воздействиям, в силу того что в это время начинает формироваться личиночная кутикула, которая отличается по составу от хориона яйца. После пермеабилизации хориона смесью гептана и бутанола, обработки криопротекторами, заморозки в жидком азоте и последующего размораживания личинки вылупляются только из 20–30% эмбрионов. Большая часть личинок имеет дефекты развития, и только 3% выживших личинок превращаются во взрослых мух (Steponkus et al., 1990). Режим размораживания еще более важен, чем режим замораживания, и для каждого вида подбирается индивидуально (Mazur et al., 1993). При медленном размораживании все эмбрионы погибают. Особенно критичны температуры –80…–40°С (Mazur et al., 1993).

Возникает также сложность со сбором нужного количества эмбрионов, находящихся на нужной стадии развития. Дело в том, что 14-я эмбриональная стадия длится ~1 ч и надежно синхронизовать возраст эмбрионов по времени от момента откладки яиц не удается, так как в момент откладки яйца эмбрионы находятся на разных стадиях развития, поскольку в некоторых случаях их развитие начинается уже в половых путях самки. Также нужно иметь в виду, что изменение температуры содержания дрозофилы на 1°С меняет скорость развития на 15%. Поэтому нужно ориентироваться не столько на время, прошедшее от откладки яиц, сколько на морфологию эмбрионов (Mazur et al., 1993). Следовательно, сбор больших количеств эмбрионов нужного возраста может быть дополнительным осложнением для криоконсервации больших коллекций.

Итак, из 5000 эмбрионов дрозофилы, находящихся на 14-й стадии развития, можно в лучшем случае получить 30 имаго, чтобы реанимировать линию после криоконсервации.

КРИОКОНСЕРВАЦИЯ ЛИЧИНОК И ИМАГО ДРОЗОФИЛЫ

Поскольку криоконсервация эмбрионов дрозофилы оказалась малоэффективной, были предприняты попытки заморозить дрозофил на других стадиях развития. Так, Chymomyza costata из семейства Drosophilidae выдерживает заморозку в жидком азоте и сохраняет жизнеспособность после разморозки на стадии личинки (выживает ~50% личинок) и имаго (выживает ~30% особей), но лишь при определенном режиме кормления, когда в корм вводится повышенное количество  пролина (Koštál et al., 2011).

К сожалению, успешный результат по криоконсервации C. costata не удалось повторить для Drosophila melanogaster, которая доминирует в большинстве коллекций (Koštál et al., 2016). Объяснить это можно разной эффективностью метаболических путей, обеспечивающих защиту от внешних неблагоприятных условий среды у этих видов дрозофил. C. costata выживает в природе в северных районах (Lakovaara et al., 1972) на стадии поздней личинки, впадая в диапаузу, тогда как D. melanogaster является комменсалом и в природе встречается только в умеренных широтах. Разные виды дрозофил обладают разной способностью впадать в диапаузу, более того по этому параметру могут различаться особи одного вида, но из разных климатических зон (Zonato et al., 2017).

Существует еще один способ экономии средств на содержание коллекций дрозофил – замедлить онтогенез и увеличить длительность жизни имаго.

СПОСОБЫ УДЛИНИТЬ ОНТОГЕНЕЗ

Удлинить онтогенез можно, снизив уровень метаболизма за счет пониженной температуры содержания, укорочения светового дня или снижения калорийности питания.

Известно, что включение в корм D. melanogaster живых дрожжей почти в 2 раза увеличивает массу имаго и в несколько раз увеличивает холодоустойчивость (Colinet, Renault, 2014). Увеличение массы сопровождается увеличением доли белка в теле мух на единицу сухой массы. Концентрация липидов при этом остается постоянной. Добавка разных аминокислот в корм личинкам показала, что наибольший вклад в холодостойкость мух вносят пролин, аргинин и глутатион (Colinet, Renault, 2014; Koštál et al., 2016; MacMillan et al., 2016).

Дрозофила плохо переносит температуры, близкие к нулю. Даже после гиперпролинизации мухи не выдерживают температуры ниже –7.5°С. При 5°С мухи, питавшиеся кормом с пролином, могут прожить максимум 20 сут, увеличение температуры содержания всего на 1°С (до 6°С) продлевает жизнь мух и личинок в 3 раза. Заметнее всего увеличивается устойчивость дрозофилы к пониженным температурам, если использовать не константный, а флуктуирующий температурный режим содержания. Если большую часть суток мухи живут при 6°С, но на несколько часов в течение дня температура повышается до 11°С, то длительность жизни увеличивается в 2–3 раза по сравнению с таковой в случае содержания при константной температуре 6°С.

Содержание метаболитов в теле дрозофилы также флуктуирует в соответствии с температурой содержания. При константной температуре кривая концентрации метаболитов плавная, при флуктуирующей температуре – зигзагообразная и подскакивает при 11°С, опускаясь до константной кривой при 6°С. Данные RNA-seq и данные, полученные с помощью количественной ПЦР, по экспрессии разных РНК практически равноценны. Разные методические подходы дали одинаковый результат: при флуктуирующей температуре содержания дрозофил профили экспрессии РНК при 6°С очень похожи на профили при 11°С, но сильно отличаются от профилей при константной температуре 6°С. Видимо, запаса РНК, синтезирующегося при 11°С, хватает, чтобы пережить пониженную температуру. При этом экспрессия генов, поддерживающих гомеостаз клеток, при пониженной температуре увеличилась, но большая часть генов свою активность снизила (Koštál et al., 2016).

Дрозофила перестает размножаться при 12°С. При этой температуре можно вызвать искусственную диапаузу. Интересно, что искусственная диапауза спонтанно прерывается через 6–8 нед, если дрозофил содержат при постоянной пониженной температуре с коротким световым периодом (Zonato et al., 2017). Снижение температуры содержания сказывается на диапаузе дрозофил в большей степени, чем длительность светового дня (Lakovaara et al., 1972). На Drosophila suzukii тестировали разные температурные режимы содержания личинок с разной продолжительностью светового дня (Jakobs et al., 2017). От времени откладки яиц до вылета имаго проходило 15 сут при 21.5°C и 13‑часовой длине светового дня. При флуктуирующем температурном режиме (5.5°C/19°C) и длительности освещения 11.5 ч вылет имаго наблюдали через 40 сут. При постоянной температуре содержания (11°C) и 10-часовом световом дне вылет имаго задерживался почти на 2 мес. (Jakobs et al., 2017).

Продолжительность жизни имаго увеличивает также ограничение калорийности пищи (Piper, Partridge, 2007). К сожалению, надежного универсального метода, который позволил бы гарантированно удлинить жизнь дрозофилы, нет. Для каждой линии и каждой мутации калорийность корма и режим содержания необходимо подбирать индивидуально. Обычно мутантные линии содержат на высококалорийном корме, а линии с диким фенотипом – на низкокалорийном.

Работа выполнена за счет бюджетного проекта № 0324 2019 0041.

Список литературы

  1. Colinet H., Renault D. Dietary live yeast alters metabolic profiles, protein biosynthesis and thermal stress tolerance of Drosophila melanogaster Part A // Comp. Biochem. Phys. 2014. V. 170. P. 6–14.

  2. Jakobs R., Ahmadi B., Houben S., Gariepy T.D., Sinclair B.J. Cold tolerance of third-instar Drosophila suzukii larvae // J. Insect. Physiol. 2017. V. 96. P. 45–52. https://doi.org/10.1016/j.jinsphys.2016.10.008

  3. Kostál V., Zahradnícková H., Šimek P. Hyperprolinemic larvae of the drosophilid fly. Chymomyza costata survive cryopreservation in liquid nitrogen // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2011. V. 108. P. 13041–13046. https://doi.org/10.1073/pnas.1107060108

  4. Koštál V., Korbelová J., Poupardin R., Moos M., Šimek P. Arginine and proline applied as food additives stimulate high freeze tolerance in larvae of Drosophila melanogaster // J. Exp. Biol. 2016. V. 219 (Pt 15). P. 2358–2367. https://doi.org/10.1242/jeb.142158

  5. Lakovaara S., Saura A., Koref-Santibañez S., Ehrman L. Aspects of diapause and its genetics in northern drosophilids // Hereditas. 1972. V. 70. P. 89–96.

  6. Lynch D.V., Lin T.T., Myers S.P., Leibo S.P., Macintyre R.J., Pitt R.E., Steponkus P.L. A two-step method for permeabilization of Drosophila eggs // Cryobiology. 1989. V. 26. P. 445–452.

  7. MacMillan H.A., Knee J.M., Dennis A.B., Udaka H., Marshall K.E., Merritt T.J., Sinclair B.J. // Sci. Rep. 2016. V. 6. P. 28999. https://doi.org/10.1038/srep28999

  8. Mazur P. Cryobiology: the freezing of biological systems // Science. 1970. V. 168. P. 939–949. https://doi.org/10.1126/science.168.3934.939

  9. Mazur P., Cole K.W., Mahowald A.P. Critical factors affecting the permeabilization of Drosophila embryos by alkanes // Cryobiology. 1992a. V. 29. P. 210–239.

  10. Mazur P., Cole K.W., Schreuders P.D., Mahowald A.P. Contributions of cooling and warming rate and developmental stage to the survival of Drosophila embryos cooled to –205 degrees C // Cryobiology. 1993. V. 30. P. 45–73. https://doi.org/10.1006/cryo.1993.1006

  11. Mazur P., Cole K.W., Hall J.W., Schreuders P.D., Mahowald A.P. Cryobiological preservation of Drosophila embryos // Science. 1992b. V. 258. P. 1932–1935.

  12. Myers S.P., Pitt R.E., Lynch D.V., Steponkus P.L. Characterization of intracellular ice formation in Drosophila melanogaster embryos // Cryobiology. 1989. V. 26. P. 472–484.

  13. Piper M.D.W., Partridge L. Dietary restriction in Drosophila: delayed aging or experimental artefact? // PLoS Genetics. 2007. V. 3. Iss. 4. e57 0461.

  14. Riggs R., Mayer J., Dowling-Lacey D., Chi T.F., Jones E., Oehninger S. Does storage time influence postthaw survival and pregnancy outcome? An analysis of 11.768 cryopreserved human embryos // Fertil. Steril. 2008. V. 93. P. 109–115. https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2008.09.084

  15. Steponkus P.L., Myers S.P., Lynch D.V., Gardner L., Bronshteyn V., Leibo S.P., Rall W.F., Pitt R.E., Lin T.T., MacIntyre R.J. Cryopreservation of Drosophila melanogaster embryos // Nature. 1990. V. 345. P. 170–172.

  16. Yancey P.H., Siebenaller J.F. Co-evolution of proteins and solutions: protein adaptation versus cytoprotective micromolecules and their roles in marine organisms // J. Exp. Biol. 2015. V. 218 (Pt 12). P. 1880–1896. https://doi.org/10.1242/jeb.114355

  17. Yancey P.H., Clark M.E., Hand S., Bowlus R.D., Somero G.N. Living with water stress: evolution of osmolyte systems // Science. 1982. V. 217. P. 1214–1222.

  18. Zonato V., Collins L., Pegoraro M., Tauber E., Kyriacou C.P. Is diapause an ancient adaptation in Drosophila? // J. Insect. Physiol. 2017. V. 98. P. 267–274. https://doi.org/10.1016/j.jinsphys.2017.01.017

Дополнительные материалы отсутствуют.