Известия РАН. Серия биологическая, 2020, № 1, стр. 30-34

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования служили личинки комара-долгоножки Tipula (Acutipula) maxima Poda, 1761 и образцы урбо-дерново-глеевой почвы, отобранные в затопленных понижениях рельефа на территории природного заказника “Воробьевы горы” (Москва, Россия). В опыте были использованы 47 личинок старших возрастов (III и IV). Личинок содержали в пяти сосудах объемом 1 л со свежей почвой с учетом естественной плотности расселения (8–10 шт. на 1 сосуд) при 4°С. Влажность почвы поддерживали на уровне 80% полной влагоемкости.

Активность азотфиксации измеряли ацетиленовым и изотопным методами. Для определения актуальной нитрогеназной активности почвы ацетиленовым методом (Методы…, 1991) использовали хроматограф “Кристалл-2000” (Россия) с пламенно-ионизационным детектором (длина колонки – 1 м, диаметр – 3 мм, наполнитель – Porapak N 80/100, температуры колонки, детектора, испарителя – 60, 160 и 100°С соответственно, расходы газа-носителя (N₂), воздуха и водорода – 50, 280 и 28 мл/мин соответственно). Определение проводили в 5-кратной повторности. Активность азотфиксации выражали в мкг С₂Н₄/(г ч).

Для определения актуальной нитрогеназной активности в кишечнике типулид предварительно взвешенных личинок поштучно помещали в пенициллиновые флаконы, которые закрывали резиновой пробкой. Во флакон вводили 1 мл ацетилена и инкубировали 1 ч при 20°С. Дальнейший анализ описан выше. Определение эндогенного этиленогенеза (контроль) проводили по той же методике без добавления ацетилена.

Для дифференцированного определения нитрогеназной активности пристеночного сообщества кишечника личинок за 1 сут до измерения высаживали в чашки Петри со стерильным 1%-ным агаром. После освобождения кишечника от содержимого проводили измерение актуальной нитрогеназной активности в девятикратной повторности, как указано выше.

Для определения актуальной нитрогеназной активности изотопным методом восемь предварительно взвешенных личинок помещали в пенициллиновые флаконы. Половину навесок (контрольные образцы) стерилизовали добавлением 1 мл толуола. Все флаконы герметично закрывали резиновыми пробками, вводили 0.4 мл газообразного изотопа азота ¹⁵N (98%) (Sigma Aldrich, США) и инкубировали в течение 1 сут при комнатной температуре. Аналогичная процедура была проведена с навесками влажной почвы (2 г). Затем фиксировали образцы этанолом, высушивали, проветривали, растирали в ступке и измеряли изотопный состав на масс-спектрометре Thermo-Finnigan Delta V Plus (Thermo Electron (Bremen) GmbH, Германия). Изотопный состав азота выражали в тысячных долях отклонения от международного стандарта (δ, ‰).

Численность аэробных и факультативно-анаэробных бактерий в содержимом отделов кишечника личинок типулид и в почве определяли методом посева на твердые питательные среды: глюкозопептонно-дрожжевую (ГПД) и Федорова‒Калининской из 3–4 разведений. Инкубировали посевы при 28°С в течение 5 сут (Методы…, 1991). Определение биомассы почвенных микроорганизмов проводили методом субстратиндуцированного дыхания (West, Sparling, 1986).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistica 8.0 (StatSoft Inc, США). Нормальность распределения оценивали с помощью критерия Шапиро‒Уилка. Для оценки различий произвольно распределенных значений использовали тесты Краскела‒Уоллиса и Манна‒Уитни. Количественные результаты представлены в виде медианы и квартилей. Для оценки различий нормально распределенных значений использовали t-критерий. Количественные результаты представлены в виде среднего и стандартного отклонения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Живые личинки типулид благодаря кишечным симбионтам способны к активной азотфиксации (рис. 1). Средняя нитрогеназная активность составляла ~0.105 мкг С₂Н₄/(г ч), что превышает значения, обнаруженные в кишечнике дождевых червей и проволочников разных эколого-трофических групп (Костина и др., 2011; Самойлова и др., 2015). Полученные нами результаты сопоставимы с оценками интенсивности нитрогеназной активности в кишечнике термитов (0.143 мкг С₂Н₄/(г ч)) (Голиченков и др., 2006), в которых до 23% азота обеспечивается за счет симбиотической азотфиксации (Fujita, Abe, 2006). Известно, что значимая бактериальная азотфиксация в пищеварительном тракте обнаруживается только у растительноядных животных: термитов (Breznak, 2000), короедов (Bridges, 1981), позвоночных-фитофагов (Вечерский и др., 2014; Кузнецова и др., 2014) и др. Вероятно, для типулид, потребляющих отмершие растительные остатки, микробная азотфиксация также имеет физиологическое значение.

Рис. 1.

Нитрогеназная активность личинок Tipula maxima. В качестве контроля приведен уровень эндогенного этиленогенеза. 1 – среднее, 2 – среднее ± стандартное отклонение, 3 – среднее ± 1.96 × стандартное отклонение. ЖКТ – желудочно-кишечный тракт.

Ацетиленовый метод может давать ложноположительную реакцию при наличии эндогенного этиленогенеза. Однако у живых типулид этиленогенез хотя и обнаруживался, но оставался на достаточно низком уровне (рис. 1, контроль). Возникает вопрос о прочности экологических взаимоотношений типулид и бактерий-азотфиксаторов. Диазотрофы могут быть либо мутуалистическими симбионтами, прочно ассоциированными со стенками кишечника, либо транзитными формами, увеличивающими активность в благоприятных условиях пищеварительного тракта (Breznak, 2000; Голиченков и др., 2006; Самойлова и др., 2015). Чтобы получить ответ на вопрос о преимущественной локализации бактерий-азотфиксаторов, было проведено сравнение нитрогеназной активности у личинок из естественной среды и личинок с пустым кишечником (после содержания их в течение 1 сут на 1%-ном голодном агаре). Длительность эксперимента позволяет добиться выведения транзитных форм бактерий, сохраняя жизнедеятельность пристеночного сообщества. Оказалось, что после опорожнения кишечника, нитрогеназная активность, измеренная у живых личинок, снижается более чем в 4 раза (t-критерий, p < 0.05) (рис. 1). Полученные результаты позволяют сделать вывод, что азотфиксаторы у личинок T. maxima представлены преимущественно транзитной микрофлорой.

Активность азотфиксации у личинок T. maxima была также исследована изотопным методом. С его помощью можно отследить закрепление атмосферного азота в бактериальной биомассе кишечника и в белке самих типулид. После суточной инкубации в атмосфере, содержащей 3.5% ¹⁵N, произошло достоверное обогащение тяжелым изотопом содержимого кишечника на 0.5‰ (критерий Манна‒Уитни, p = 0.00628) (рис. 2). Это свидетельствует о том, что атмосферный азот достаточно активно связывается прокариотами в содержимом кишечника типулид. В теле живых личинок увеличение содержания тяжелого изотопа азота после суточной инкубации не зафиксировано, что не противоречит литературным данным. Известно, что включение изотопной метки в тело термитов происходит не ранее чем на 7-е сут (Fujita, Abe, 2006). В образцах контрольной почвы, инкубируемых в атмосфере, содержащей 3.5% ¹⁵N, достоверного обогащения тяжелым изотопом не обнаружено.

Рис. 2.

Изотопный состав азота после инкубации в атмосфере ¹⁵N стерильных личинок T. maxima (личинки – контроль), стерильного изолированного кишечника типулид (кишечник – контроль) и нативных типулид и их кишечника (личинки и кишечник соответственно). 1 – медиана, 2 – верхний и нижний квартили, 3 – минимум и максимум.

Чтобы оценить влияние типулид на азотфиксацию в почвах, было проведено сравнение нитрогеназной активности в нативной почве и почве после 1 и 3 мес. пребывания в ней типулид (при естественной плотности популяции 8–10 шт./кг почвы). Через 1 мес. нитрогеназная активность возросла вдвое, а через 3 мес. – в 8 раз по сравнению с контролем (t-критерий, p < 0.05) (рис. 3).

Рис. 3.

Нитрогеназная активность контрольной почвы (контроль) и модельных почв, в которых обитали личинки T. maxima при естественной плотности популяции. 1 – среднее, 2 – среднее ± стандартное отклонение, 3 – среднее ± ± 1.96 × стандартное отклонение.

Присутствие типулид почти в 2 раза увеличивало биомассу почвенных микроорганизмов, определяемую методом субстратиндуцированного дыхания: в контрольной почве она составляла 360.64 мкг С/г почвы, а после месячного обитания в ней личинок T. maxima достоверно увеличилась до 646.69 мкг С/г почвы (критерий Манна–Уитни, p < 0.05).

Общая численность культивируемых аэробных микроорганизмов пищеварительного тракта типулид, способных к росту на глюкозопептонно-дрожжевой среде, была достаточно высокой (1.3 × 10⁷ КОЕ/г для суммарного содержимого кишечника и 2.8 × 10⁷ КОЕ/г для бродильной камеры – специализированного микробного ферментера типулид). Численность микроаэрофилов в бродильной камере личинок была на порядок выше (3.3 × 10⁸ КОЕ/г).

После инкубации личинок в почве увеличилась и численность азотфиксаторов, способных к росту на среде Федорова–Калининской с 5 × 10⁶ КОЕ/г в контрольной почве до 1.2 × 10⁷ КОЕ/г в модельной (критерий Манна–Уитни, p < 0.05). Следует отметить высокую численность азотфиксаторов в почве, сопоставимую с их численностью в кишечнике личинок типулид (0.9 × 10⁷ КОЕ/г), хотя обычно это значение для почвы не превышает 10⁶ КОЕ/г.

Таким образом, присутствие типулид достоверно увеличивает численность и активность почвенных бактерий, обеспечивающих протекание ключевого процесса азотного цикла в почве. В этом отношении типулиды, как, возможно, и другие фито- и детритофаги, являются естественными резервуарами для размножения бактерий-азотфиксаторов. Однако помимо прямого воздействия насекомые могут стимулировать азотфиксацию косвенным образом, агрегируя почвенные отдельности и осуществляя минерализацию опада в подстилке и верхней части гумусового горизонта.

Таким образом, в кишечнике личинок T. maxima зарегистрирована фиксация атмосферного азота, как газохроматографическим, так и изотопным методами. Эта нитрогеназная активность обусловлена деятельностью преимущественно транзитных кишечных микроорганизмов-диазотрофов. Покидая пищеварительный тракт, они обогащают почвенный пул азотфиксаторов, что приводит к резкому возрастанию нитрогеназной активности в почве, заселенной личинками типулид – уже через 3 мес. инкубации активность возрастает в 8 раз, что может способствовать накоплению азота в местах обитания личинок. Работа демонстрирует важность беспозвоночных, в том числе личинок насекомых, в обеспечении почвы азотом и поддержании ее азотного баланса.

Авторы признательны А.В. Тиунову за помощь при проведении изотопного анализа в Центре коллективного пользования ИПЭЭ РАН “Инструментальные методы в экологии”.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 16-04-01864а).