Известия РАН. Серия биологическая, 2020, № 6, стр. 604-615

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали каллусные культуры стебля чайного растения C. sinensis L., выращиваемые в темноте (темновая культура, ТК) на основной питательной среде Хеллера, содержащей 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (5 мг/л), глюкозу (25 г/л), агар (7 г/л). При проведении опытов часть каллусных культур переносили в световые условия (световая культура, СК) и выращивали при 16-часовом фотопериоде (интенсивность 5000 лк). При изучении действия Сd к основной среде для культивирования ТК и СК добавляли Cd(NO₃)₂ в концентрации 25 мг/л, которая не вызывала гибели клеток и была подобрана в предварительных экспериментах.

Как контрольный, так и опытные варианты каллусной ткани чая выращивали в факторостатной камере при 26°С и относительной влажности воздуха 70%. Длительность пассажа составляла 6 нед. Анализировали культуры 20-, 30- и 40-сут возраста (соответственно середина и конец линейной, начало стационарной фаз роста). Для биохимических исследований материал фиксировали жидким азотом и хранили при –70°С до проведения определений.

Прирост каллусной ткани определяли стандартным методом, учитывая сырую массу каллусов в начале и в конце эксперимента (Носов, 2011). Содержание воды определяли после высушивания каллусов до постоянной массы при 70°С (Рогожин, Рогожина, 2013).

Содержание Cd в каллусной ткани определяли по стандартной методике (Ivanov et al., 2016). Для этого материал высушивали до постоянной массы при 60°С, заливали смесью концентрированных кислот HNO₃ : HClO₄ (2 : 1) и оставляли на 24 ч при комнатной температуре. Далее пробы инкубировали последовательно при 150°C (1.5 ч) и 180°C (2 ч) в термостате TDB-A-400 (BioSan, Латвия). Полученный раствор охлаждали, добавляли 5–6 капель 37%-ной H₂O₂ и доводили дистиллированной водой до объема 5 мл. Количество Cd в пробе определяли на атомно-абсорбционном спектрофотометре Формула ФМ400 (ЛабИст, Россия) с применением ламп с полым катодом (Hamamatsu Photonics, Япония). Прибор калибровали растворами Сd(NO₃)₂ в различной концентрации, приготовленными из стандартного раствора кадмия ГСО 7874-2000. Содержание Cd выражали в мг/г сухой массы.

Цитохимическое исследование локализации Cd в клетках каллусов чая проводили с помощью метода, основанного на способности дитизона образовывать окрашенные комплексы с этим металлом (Серегин и др., 2004). Небольшие кусочки каллусной ткани помещали в камеру микротома-криостата (Россия), замораживали в течение 58 мин при –18°С и получали срезы толщиной 25 мкм. Их помещали на предметное стекло в раствор дитизона (0.5 мг/мл) в смеси ацетон : дистиллированная вода (3 : 1), к 6 мл которого добавляли 1–2 капли ледяной уксусной кислоты для повышения чувствительности реакции. Препараты просматривали и фотографировали с помощью светового микроскопа (Ergaval, Германия).

Уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ) в каллусных тканях определяли по содержанию малонового диальдегида (МДА), используя для этого реакцию с тиобарбитуровой кислотой (ТБК). Для этого навеску замороженного растительного материала (200 мг) гомогенизировали в 5 мл 0.1 М трис-HCl-буфера (рН 7.5), содержащего 0.35 М NaCl. К полученному гомогенату добавляли 1 мл 0.5%-ного раствора ТБК в 20%-ном водном растворе трихлоруксусной (ТХУ) кислоты. Реакционную смесь инкубировали на кипящей водяной бане в течение 30 мин и измеряли оптическую плотность раствора при 532 нм. Для расчета содержания МДА (мкмоль/г сухой массы) использовали коэффициент молярной экстинкции, равный 1.56 × 10^–5 см^–1  · М^–1 (Hodges et al., 1999).

ФС извлекали из замороженного материала 96%-ным этанолом при 45°С в течение 40 мин (Олениченко, Загоскина, 2005), гомогенат центрифугировали (16 000 об./мин, 10 мин), а в надосадочной жидкости спектрофотометрическим методом определяли суммарное содержание растворимых ФС с реактивом Фолина–Дениса (поглощение при 725 нм), флаванов с ванилиновым реактивом (поглощение при 500 нм) и растворимых проантоцианидинов с бутанольным реактивом (поглощение при 550 нм) (Запрометов, 1971). Содержание суммы растворимых ФС и флаванов выражали в мг-экв. эпикатехина/г сухой массы, а содержание проантоцианидинов – в мг-экв. цианидина/г сухой массы.

Для определения активности L-фенилаланинаммиаклиазы (ФАЛ) замороженный материал гомогенизировали в 0.1 М Na-боратном буфере (рН 8.8), содержавшем 0.5 мМ ЭДТА и 3 мМ дитиотреитола, с добавлением водонерастворимого поливинилпирролидона (Олениченко, Загоскина, 2005). Гомогенат фильтровали, центрифугировали (25 000 об./мин, 20 мин), и надосадочную фракцию использовали в качестве “грубого” ферментного препарата для определения активности фермента. Все операции проводили на холоде при 4°C. Активность ФАЛ определяли спектрофотометрически по образованию из L-фенилаланина продукта реакции – транс-коричной кислоты (поглощение при 290 нм) в смеси, содержавшей 0.1 М Na-боратный буфер (рН 8.8), 0.01 М L-фенилаланин и “грубый” ферментный препарат (60 мкг белка/мл) в общем объеме 2 мл. Активность ФАЛ выражали в мкг транс-коричной кислоты/мг белка. Содержание белка определяли методом Брэдфорд (Bradford, 1976).

Опыт проводили в двух аналитических и трех биологических повторностях. Полученные результаты статистически обрабатывали с использованием программ SigmaPlot 12.3. и Microsoft Excel. На рисунках представлены средние арифметические значения определений и их стандартные ошибки (±SEM). Достоверность различий средних значений определяли по t-критерию Стьюдента при P ≤ 0.05 и обозначали ее разными латинскими буквами.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Морфофизиологические характеристики и рост культур. ТК представляла собой плотный каллус светло-бежевого цвета. К концу пассажа он приобретал более темный оттенок. Для ТК характерно постепенное увеличение свежей массы каллусов в течение всего пассажа (рис. 1). К концу пассажа ее прирост достигал 216%.

Рис. 1.

Прирост биомассы каллусных культур чайного растения, выращиваемых в темноте (ТК) или на свету (СК) на основной питательной среде (ТК, СК) или на среде с Cd (ТК + Cd, СК + Cd). Достоверные различия средних значений при P ≤ 0.05 отмечены разными латинскими буквами над барами; для рис. 1–5.

Перенесение каллусов чая в световые условия не вызывало значительных изменений в их морфофизиологических характеристиках. При этом к концу выращивания на поверхности СК отмечалось формирование небольших участков желто-зеленого цвета и отсутствовал темный оттенок, характерный для ТК. Следует также отметить, что в условиях светового воздействия происходило снижение прироста каллусной ткани: на 20-, 30- и 40-е сут он был на 3, 10 и 27% ниже такового у ТК соответственно (рис. 1). За весь период выращивания прирост свежей массы СК составил 158%.

Выращивание культур на питательной среде, содержащей поллютант, сопровождалось изменением их морфофизиологических характеристик по сравнению с культурами, растущими на основной среде. Каллусы становились менее плотными, приобретали светло-коричневый оттенок к 20-м сут роста, а к 40-м на их поверхности формировались участки темно-коричневого цвета. Оценивая рост каллусных тканей чая в присутствии поллютанта, можно отметить его снижение у ТК и СК соответственно на 31 и 18% ниже, чем в вариантах без Cd (рис. 1).

Важный показатель при оценке состояния клеток растений – их оводненность, приобретающая особое значение при действии стрессовых факторов (Brodersen, McElrone, 2013). В нашем случае у обеих культур чая в течение всего пассажа она была достаточно высокой и практически равной (94% у ТК и 93% у СК). При выращивании каллусов на среде с Cd содержание воды в клетках варьировало в тех же пределах, хотя можно отметить тенденцию к его снижению (92–93% у ТК и 92% у СК).

Содержание и локализация Cd. Для понимания воздействия Cd на рост и метаболизм in vitro культур чая было определено его содержание в каллусах в течение цикла выращивания (рис. 2а). У ТК количество этого металла постепенно повышалось по мере роста: минимальные значения были у 20-сут культуры, к 30-м сут содержание повышалось на 30%, а к 40-м еще на 19%. У СК содержание Cd уже на 20-е сут роста почти на 30% превышало таковое у ТК и сохранялось практически одинаковым до конца пассажа.

Рис. 2.

Содержание Cd (а) в каллусных культурах чайного растения различного возраста, выращиваемых на среде с Cd в темноте (ТК) или на свету (СК), и его локализация (б) в клетках (реакция с дитизоном).

Определение внутриклеточной локализации Cd гистохимическим методом (по реакции с дитизоном) в ТК и СК показало его наличие в микровакуолях и вакуолярном пространстве (рис. 2б). Отмечено также его присутствие в клеточных стенках и межклетниках, которое не зависело от условий выращивания культур (свет, темнота).

Содержание МДА. Важный показатель состояния клеток растений – уровень ПОЛ, характеризующий баланс между образованием и утилизацией АФК, о котором судят по содержанию МДА (Agati et al., 2012). В каллусах ТК оно было низким на 20-е сут роста, к 30-м сут возрастало (на 59%), а к 40-м снижалось (на 34%), но превышало таковое начального этапа роста (рис. 3). Для СК тенденция изменения в содержании МДА была аналогичной, но с меньшими различиями на разных этапах роста. Наименьшие значения МДА были у 20-сут культуры, они были равны таковым у ТК этого возраста. К 30-м сут содержание МДА повышалось (на 44%), а к 40-м снижалось (на 25%). В целом уровень ПОЛ у СК был выше такового у ТК, а его изменения по мере роста культуры проявлялись в меньшей степени.

Рис. 3.

Содержание малонового диальдегида в каллусных культурах чайного растения различного возраста, выращиваемых в темноте (ТК) или на свету (СК) на основной питательной среде (ТК, СК) или на среде с Cd (ТК + Cd, СК + Cd).

Судя по литературным данным, при воздействии Cd на клетки растений в большинстве случаев количество АФК в них повышалось, что часто сопровождалось увеличением уровня ПОЛ (Zaid et al., 2020). В нашем случае аналогичная тенденция отмечалась только у 20-сут СК, у которой содержание МДА на 30% превышало таковое в каллусе, культивируемом на среде без поллютанта (рис. 3). В остальных случаях оно было ниже или равно контрольному. При этом во всех вариантах наименьшее содержание МДА отмечено у 20-сут каллусов, более высокое – у 30-сут, которое снижалось к концу пассажа. Следует также отметить, что в условиях действия Cd более высокий уровень ПОЛ характерен для СК по сравнению с ТК, что противоположно его значениям у культур, растущих на основной среде.

Содержание суммы ФС. Основной показатель оценки уровня низкомолекулярных антиоксидантов фенольной природы – суммарное содержание ФС в растительной ткани (Загоскина и др., 2003). Определение этого параметра показало, что у обеих культур, выращиваемых на основной питательной среде, оно было наибольшим на 20-е сут роста, а затем снижалось в течение пассажа, что в большей степени было выражено у ТК (рис. 4а). У ТК суммарное содержание ФС к концу пассажа было в 2.7 раза ниже по сравнению с таковым на начальных этапах роста. У СК также отмечалось снижение этого показателя, но только до 30-х сут роста, а к концу пассажа оно было ниже, чем у 20-сут каллуса в 1.4 раза.

Рис. 4.

Содержание суммы фенольных соединений (а), флаванов (б) и проантоцианидинов (в) в каллусных культурах чайного растения различного возраста, выращиваемых в темноте (ТК) или на свету (СК) на основной питательной среде (ТК, СК) или на среде с Cd (ТК + Cd, СК + Cd).

Иная тенденция отмечалась при выращивании культур чая на средах с Cd (рис. 4а). В этом случае у ТК на начальных этапах роста отмечалось наименьшее содержание суммы ФС в отличие от такового в контроле. К середине пассажа оно повышалось (на 33%) и статистически достоверно сохранялось таким до завершения цикла культивирования, хотя можно отметить незначительную тенденцию к его снижению. Следовательно, присутствие Cd в питательной среде приводило к накоплению ФС у ТК, которое в конце пассажа почти в 3 раза превышало таковое в контроле. Суммарное содержание ФС у СК, выращиваемой на среде с Cd, во-первых, на всех этапах роста превышало таковое в контрольном варианте, а во-вторых, практически не изменялось. Все это привело к тому, что в конце пассажа его уровень почти в 1.8 раза превышал этот показатель в контрольном варианте.

Содержание флаванов. К основным компонентам фенольного комплекса каллусных культур чайного растения относятся представители класса флавоноидов – флаваны (Запрометов, 1993). Для них характерна антиоксидантная активность, обусловленная наличием большого количества фенольных оксигрупп в структуре (Agati et al., 2012; Hong, 2014). Как следует из представленных на рис. 4б данных, тенденция накопления этих соединений у культур чая, выращиваемых на основной среде или на среде с Cd, была в значительной степени аналогична тенденции накопления суммы ФС в этих вариантах. На основной среде содержание флаванов у ТК было несколько выше, чем у СК, и в обоих случаях снижалось по мере их роста. У культур, выращиваемых на среде с Cd, в начале роста их содержание было практически равным таковому у контрольных, к 30-м сут оно повышалось (на 35%), а к 40-м незначительно снижалось у ТК и сохранялось без изменений у СК. В конце пассажа содержание флаванов у ТК и СК, выращиваемых на среде с поллютантом, соответственно на 70 и 60% превышало этот показатель у культур, растущих на основной среде.

Поскольку флаваны относятся к основным компонентам фенольного комплекса как чайного растения, так и инициированных из него каллусных культур, то мы проанализировали их вклад в суммарное содержание ФС. Так, у ТК, выращиваемой на основной среде, доля флаванов уменьшалась с 61 до 52% к концу цикла культивирования. У СК она составляла в среднем 53% и незначительно изменялась в течение пассажа. При выращивании культур на среде с Cd (рис. 4б) у ТК доля флаванов в суммарном содержании ФС была выше, но, как и в контрольном варианте, уменьшалась с 68 до 61% к концу пассажа. У СК, напротив, отмечалось увеличение доли флаванов в комплексе фенольных соединений: с 46 до 68% (начало и конец пассажа соответственно).

Содержание проантоцианидинов. Для каллусных культур чайного растения характерно образование еще одной группы соединений, обладающих антиоксидантными свойствами – проантоцианидинов, представляющих собой олигомерные и полимерные соединения на основе флаван-3-олов (Запрометов, 1993; Fraser et al., 2012; Jiang et al., 2015).

Для ТК, выращиваемой на основной питательной среде, наибольшее содержание проантоцианидинов отмечалось на 20-е сут роста (рис. 4в). К 30-м сут оно снижалось в 2 раза, а к концу пассажа было уже в 6.5 раза ниже, чем на начальных этапах роста. У СК также наблюдали значительное снижение содержания проантоцианидинов с 20-х по 30-е сут выращивания (в 2.5 раза), которое затем не изменялось до конца пассажа.

При выращивании культур на среде с Cd тенденция была иной (рис. 4в). Так, для ТК отмечено более низкое содержание проантоцианидинов в начале пассажа по сравнению с контролем (на 31%). По мере дальнейшего роста каллусов оно, хотя и несколько снижалось, но всегда превышало их содержание в контрольном варианте (на 19 и 69% на 30-е и 40-е сут роста соответственно). У СК, выращиваемой на среде с Cd, на начальных этапах роста содержание проантоцианидинов было высоким и аналогичным таковому в контрольном варианте. В дальнейшем оно снижалось: на 30-е и 40-е сут роста на 25 и 13% относительно 20-х сут роста соответственно, т.е. не столь стремительно, как это было в контрольном варианте.

Активность ФАЛ. ФАЛ – ключевой фермент в биосинтезе фенольных соединений, участвующий в образовании первого продукта фенольного метаболизма – транс-коричной кислоты, которая в дальнейшем служит предшественником многих полифенолов и, судя по опубликованным ранее данным, может свидетельствовать о его интенсивности (Klejdus et al., 2013). У ТК, выращиваемой в контрольных условиях, уровень активности ФАЛ оставался стабильным до 30-х сут культивирования, а концу пассажа возрастал (на 26%) (рис. 5). У СК в начале пассажа (20-е сут) активность фермента была на 25% выше, чем у ТК, и в течение всего пассажа практически не изменялась.

Рис. 5.

Активность L-фенилаланинаммиаклиазы в каллусных культурах чайного растения различного возраста, выращиваемых в темноте (ТК) или на свету (СК) на основной питательной среде (ТК, СК) или на среде с Cd (ТК + Cd, СК + Cd).

У культур, выращиваемых на среде с Cd, изменения активности ФАЛ имели другие тенденции (рис. 5). У ТК уже в начале пассажа она была на 26% выше, чем в контроле. К середине пассажа активность ФАЛ снижалась на 27%, достигая значений контрольного варианта, а к концу пассажа вновь незначительно возрастала до значений, характерных для начала цикла культивирования. В культурах, выращиваемых на среде с Cd, у СК активность ФАЛ в начале пассажа была ниже таковой у ТК на 33%. К 30-м сут она повышалась (на 29%), а затем не изменялась, но так и не достигала значений, характерных для контрольных каллусов.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Важные первичные показатели реакции растительных клеток на изменение условий окружающей среды или действие стрессовых факторов – их морфофизиологические характеристики и ростовая активность (Shanying et al., 2017).

При выращивании ТК на основной питательной среде к концу пассажа отмечалось ее потемнение, что, вероятно, было следствием старения клеток. Для нее характерен равномерный и незначительный прирост: за весь цикл культивирования масса каллусов увеличилась лишь в 2 раза (рис. 1). Такой характер роста, возможно, обусловлен высокой способностью каллусов чая к биосинтезу фенольных соединений, в том числе флаванов, которые подавляют процессы пролиферации клеток, необходимые для формирования каллусной ткани (Matkowski, 2008).

Для изучения первичного действия света гетеротрофные каллусы чая помещали в условия 16-часового фотопериода, что аналогично начальным этапам деэтиоляции клеток растений (Cortleven et al., 2016). Появление на их поверхности желто-зеленых участков к концу пассажа свидетельствовало о начальных этапах формирования в клетках хлоропластов, что отмечалось нами ранее, но после более длительного светового воздействия (Зубова и др., 2019). Следует также отметить замедление прироста каллусной массы у СК по сравнению с ТК (рис. 1). Это может быть следствием стрессовой реакции в клетках каллусных культур чая, вызванной как действием света, так и переходом от гетеротрофного к смешанному (фотомиксотрофному) типу питания (Загоскина и др., 2000; Hong et al., 2014).

К числу наиболее опасных представителей тяжелых металлов, которые, накапливаясь в растениях, могут оказывать на них сильное токсическое действие, относится Cd, что в первую очередь проявляется в изменении их ростовых и морфофизиологических параметров (Серегин, Иванов, 2001; Shanying et al., 2017; Ismael et al., 2019). О том, что присутствие Cd в питательной среде влияет на морфофизиологические характеристики культивируемых в условиях in vitro клеток и тканей высших растений, сообщалось ранее (Lux et al., 2010; Гончарук, Загоскина, 2017). Потемнение каллусов чая на среде с Cd уже в начале пассажа и постепенное формирование на их поверхности темно-коричневых участков, содержащих предположительно некротизированные клетки, явные тому доказательства. Токсическое действие этого поллютанта подтверждается также снижением интенсивности их роста, что в большей степени проявлялось у ТК (рис. 1). Таким образом, несмотря на снижение прироста биомассы на среде с Cd, каллус чая в условиях освещения оказался более устойчив к действию поллютанта по сравнению с выращиваемым в темноте. Следовательно, при совместном действии этих двух факторов токсическое действие Cd снижается.

Содержание воды в клетках растений свидетельствует о степени их растяжения и вакуолизации (Brodersen, McElrone, 2013). Отмеченная нами тенденция к незначительному снижению этого показателя в опытных вариантах позволяет предположить, что присутствие Cd в среде культивирования подавляло эти процессы в каллусах чая, что сказывалось и на приросте ткани.

Все вышеизложенное позволяет заключить, что присутствие Cd в питательной среде влияло на морфофизиологические характеристики и рост каллусных культур чая, выращиваемых в темноте и перенесенных в световые условия, что выражалось в изменении их окраски, снижении прироста и оводненности клеток (в большей степени у ТК). Следовательно, на культивируемых в условиях in vitro клетках чайного растения четко прослеживалось токсическое действие Cd, о чем сообщалось и другими авторами (Гончарук, Загоскина, 2017; Zaid et al., 2020). Однако в световых условиях оно было менее выражено, что может быть следствием активации метаболических процессов, защищающих клетки от его токсического действия, в том числе наличия антиоксидантов или “ограничения” поступления этого поллютанта (Загоскина и др., 2000; Hong et al., 2014).

Проведенные нами исследования показали наличие Cd в каллусных клетках как ТК, так и СК уже на начальных стадиях роста (рис. 2а). Такое быстрое поступление, вероятно, объясняется высокой степенью подвижности ионов данного металла и более простой структурной организацией самой каллусной ткани по сравнению с таковой у интактных растений. Примечательно, что более высокое накопление Cd в этот период характерно для СК, т.е. условия освещения активируют этот процесс на начальном этапе роста культур. В дальнейшем таких ярко выраженных различий между каллусами, растущими в темноте или на свету, не наблюдалось. Локализация Cd, судя по данным гистохимической реакции с дитизоном, была приурочена к вакуолярным компартментам клеток каллусов чайного растения, а также к клеточным стенкам и межклетникам (риc. 2б). Все это свидетельствует о традиционном его распределении в клетках и тканях растений (Гончарук, Загоскина, 2017).

Одна из наиболее распространенных неспецифических реакций растительных клеток на действие стрессовых факторов – индукция ПОЛ, обусловленная действием АФК и определяемая по содержанию МДА (Foti, Amorati, 2016). Важно отметить и тот факт, что они накапливаются и в нормальных условиях, поскольку необходимы для поддержания жизнедеятельности клеток (Agati et al., 2012; Zaid et al., 2020). В первую очередь необходимо отметить, что по мере роста каллусных культур чая содержание в них МДА изменялось: в начале роста оно было наименьшим, затем повышалось и к концу пассажа снижалось (рис. 3). Все это обусловлено изменением баланса про/антиоксидантов в их клетках (Baskar et al., 2018). При сравнении уровня ПОЛ в каллусных культурах чая, выращиваемых на основной среде, можно отметить в большинстве случаев более низкие его значения и меньшие изменения в условиях светового воздействия. Следовательно, свет “нормализовал” работу антиоксидантной системы каллусов чая, что может быть связано и с образованием в них ФС – важных низкомолекулярных антиоксидантов растительного происхождения (Запрометов, 1993; Bidel et al., 2010).

При выращивании каллусных культур чая на средах с Cd наблюдалась тенденция снижения ПОЛ, что в большей степени проявлялось у ТК (рис. 3). Примечателен факт повышения содержания МДА на начальных этапах роста СК на среде с Cd, что противоположно реакции ТК, где оно снижалось по сравнению с контролем (среда без Cd). Исходя из этого можно предположить, что в данный период происходит более выраженная стрессовая реакция у культуры чайного растения при совместном действии этих двух факторов, что не отмечалось в других случаях.

Важная характеристика работы антиоксидантной системы – накопление тех или иных антиоксидантов, в нашем случае различных ФС (Bidel et al., 2010). Отмеченное нами высокое их суммарное содержание на начальных этапах роста каллусов чая на основной питательной среде и низкое в конце пассажа может быть обусловлено характером их образования в течение пассажа, высокой способностью к накоплению в молодых активно растущих клетках, гетерогенностью, присущей каллусным культурам, а также их функциональной ролью на различных этапах роста и дифференциации (Запрометов, 1993; Sutini et al., 2016).

Известно, что свет – один из важнейших абиотических факторов, регулирующих рост и развитие растений, и в том числе активно влияющих на образование ФС в клетках растений, в большинстве случаев способствуя увеличению их содержания, что было показано и для in vitro культур чайного растения (Загоскина и др., 2000; Pérez-López et al., 2018). Это можно объяснить и тем, что многие ферменты фенольного метаболизма светозависимы, а также тем, что в этих условиях в клетках начинают формироваться хлоропласты – одни из центров синтеза ФС (Загоскина и др., 2000; Hong et al., 2014). Тем не менее в нашем случае первичное действие света практически не влияло на содержание ФС в культуре чая, за исключением завершающих этапов ее роста, когда отмечали стабилизацию в накоплении этих веществ, тогда как у ТК оно продолжало снижаться (рис. 4). Здесь могут иметь значение длительность и интенсивность светового воздействия, о чем не раз сообщалось и другими авторами (Mukhopadhyay, 2016).

В вариантах каллусных культур чая, выращиваемых на средах с Cd, наблюдалась иная картина. В клетках ТК происходила постепенная активация биосинтеза полифенолов, что четко проявлялось на завершающих этапах их роста. Это свидетельствует о постепенном (медленном) ответе культур чая на стрессовое воздействие. О том, что реакция клеток высших растений на действие тяжелых металлов зависит от их концентрации и длительности воздействия, сообщалось ранее (Серегин, Иванов, 2001; Гончарук, Загоскина, 2017).

В случае с СК наблюдали быстрый ответ клеток на стрессовое воздействие. Уже на начальных этапах роста (20-е сут) суммарное содержание ФС было высоким и сохранялось таким до конца пассажа (рис. 4а). Следовательно, можно предположить, что совместное действие двух исследуемых факторов (Cd и свет) оказывало синергический эффект и, следовательно, активизировало накопление ФС в каллусных культурах чая.

Флаваны – основные компоненты фенольного комплекса растений чая, а также инициированных из них in vitro культур, доля которых в общем содержании ФС обычно составляет >50% (Запрометов, 1993; Wang, Li, 2018). Показано, что для флаванов преимущественно характерна аналогичная накоплению суммы ФС тенденция в процессе культивирования как ТК, так и СК (рис. 4б). Вместе с тем имеющиеся небольшие различия в их содержании позволяют предполагать изменение доли этих соединений в общем содержании полифенолов, поскольку в процессе роста и дифференциации клеток пути биосинтеза различных классов ФС могут изменяться (Запрометов, 1993). В нашем случае у ТК доля флаванов в общем количестве ФС к концу пассажа снижалась, уступая место так называемым нефлавановым компонентам, например фенилпропаноидам (Зубова и др., 2019). У СК эти изменения в течение пассажа были незначительны, хотя аналогичная тенденция прослеживалась.

В условиях действия Cd доля флаванов у ТК была в целом на 7–10% выше, чем у каллусов, растущих на основной питательной среде, но в течение пассажа она снижалась по аналогии с контролем. У СК в этих условиях наблюдали противоположную тенденцию – увеличение доли “флаванового” компонента более чем на 20% к концу пассажа. Таким образом, можно заключить, что совместное действие света и Cd приводило к увеличению доли флаванов в клетках культуры чая.

Флаваны в растениях представлены как мономерными формами (флаван-3-олами или катехинами), так и их олигомерными и даже полимерными производными. К последним относятся проантоцианидины – соединения, также обладающие антиоксидантной активностью (Fraser et al., 2012). Динамика их накопления в процессе роста каллусных тканей чая может быть в определенной степени аналогична динамике флаванов, поскольку проантоцианидины составляют часть их комплекса (Зубова и др., 2019). У каллусов, растущих на основной среде, так и происходило (рис. 4в). У ТК отмечали снижение содержания проантоцианидинов в течение всего пассажа, тогда как у СК их количество уменьшалось до середины пассажа, после чего стабилизировалось до завершения цикла культивирования. Однако это снижение было значительно более резким, чем у флаванов и тем более у суммы ФС.

Примечательно, что при выращивании ТК и СК на среде с Cd также отмечали тенденцию к снижению содержания проантоцианидинов к концу пассажа, что прямо противоположно накоплению флаванов в опытном варианте, причем у СК это снижение было более выраженным. Подобное снижение накопления проантоцианидинов в процессе роста каллусов чая отмечалось и в более ранних работах (Зубова и др., 2019). Оно может быть связано с перераспределением этих соединений внутри клетки из-за смены их функциональной роли. Дело в том, что проантоцианидины могут находиться как в свободном (растворимом), так и в связанном с клеточными стенками (нерастворимом) состоянии. Мы оценивали содержание в каллусных культурах чая только растворимых их форм. Однако в процессе их роста (или старения) часть этих соединений может прочно связываться с клеточными стенками, тем самым снижая пул растворимых форм (Ossipova et al., 2001). Встраиваясь в клеточную стенку, проантоцианидины становятся аналогами лигнина – полимера фенольной природы, выполняющего опорную и “барьерную” функцию, в том числе и при проникновении в клетки ионов металлов (Серегин, Иванов, 2001). Можно предположить, что в условиях поступления Cd в каллусные культуры чая часть проантоцианидинов встраивалась в клеточную стенку, в результате чего наблюдалось снижение содержания их растворимых форм. Важно отметить, что это снижение происходило на фоне увеличения содержания флаванов. Следовательно, можно предположить, что в условиях стрессового действия Cd в каллусных культурах чая в большей степени повышалось накопление именно катехинов (мономерных форм) и в меньшей – проантоцианидинов. Несмотря на эту тенденцию, снижение таких соединений в контроле у обеих культур происходило резче. Так, к концу пассажа содержание проантоцианидинов в культуре, выращенной на среде с Cd, превышало таковое в культуре, выращенной на основной среде, в 3 раза в случае ТК и в 1.5 раза в случае СК. Исходя из этого можно предположить, что проантоцианидины также принимают участие в защите клеток культур чая от действия стрессовых факторов, хотя и в меньшей степени. О менее выраженной антиоксидантной защите этих соединений по сравнению с их мономерными предшественниками упоминалось ранее (Min et al., 2012).

Биосинтез ФС в значительной степени зависит от активности основного фермента фенольного метаболизма – ФАЛ (Klejdus et al., 2013). В то же время в литературе встречаются противоречивые данные о взаимосвязи активности ФАЛ и содержания ФС, в том числе флаванов. В одних работах сообщалось о наличии прямой корреляции между ними (Pina, Errea, 2008), в других – об отсутствии взаимосвязи между этими показателями (Олениченко, Загоскина, 2005). Анализируя полученные данные, можно сделать вывод, что в процессе роста каллусных культур чайного растения на основной питательной среде и среде с Сd активность ФАЛ изменялась. Однако эти различия были незначительны и в целом ее уровень изменялся в одних и тех же пределах. Следовательно, прямой взаимосвязи между активностью ФАЛ и накоплением ФС, в частности флаванов и проантоцианидинов, в каллусных культурах чайного растения как при раздельном, так и при совместном действии света и Cd не прослеживалось.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Все вышеизложенное позволяет заключить, что световое воздействие, а также поступление ионов Cd в клетки каллусных культур чайного растения, выращиваемых в темноте или перенесенных в световые условия, приводили к изменению их морфофизиологических характеристик, снижению ростовой активности и к активизации работы антиоксидантной системы на уровне накопления ее низкомолекулярных компонентов фенольной природы, а именно суммарного содержания фенольных соединений, флаванов и в меньшей степени проантоцианидинов. В ряде случаев эти изменения коррелировали с уровнем ПОЛ в клетках, но не зависели от активности ключевого фермента фенольного метаболизма ФАЛ. Важно, что при совместном действии света и Cd часто отмечался синергизм их действия. Полученные данные еще раз подтверждают, что ФС играют существенную роль в функционировании системы антиоксидантной защиты клеток, что можно считать важным механизмом, участвующим в адаптации растительных клеток в период их деэтиоляции или в стрессовых условиях, в частности в присутствии поллютанта (Cd).

Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки РФ в рамках темы государственного задания Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук № АААА-А-19-11904189005-8.