Известия РАН. Серия биологическая, 2021, № 1, стр. 19-29

Изменчивость хлоропластной ДНК видов Oxytropis секции Polyadena (Fabaceae) Азиатской России: популяционный анализ и филогенетические связи

А. Б. Холина 1*, М. М. Козыренко 1, Е. В. Артюкова 1, Т. Э. Позднякова 2

1 Федеральный научный центр биоразнообразия наземной биоты Восточной Азии Дальневосточного отделения РАН
690022 Владивосток, просп. 100 лет Владивостоку, 159, Россия

2 Санкт-Петербургский государственный аграрный университет
196601 Санкт-Петербург–Пушкин, Петербургское ш., 2, Россия

* E-mail: kholina@biosoil.ru

Поступила в редакцию 15.08.2019
После доработки 13.04.2020
Принята к публикации 14.06.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Проанализирован нуклеотидный полиморфизм межгенных спейсеров psbA–trnH, trnL–trnF и trnS–trnG хлоропластной ДНК популяций шести видов Oxytropis секции Polyadena Азиатской России. Обнаружен низкий уровень нуклеотидного разнообразия (0.0001–0.0014), за исключением двух популяций O. glandulosa (0.0036 и 0.0059). Отмечено, что гаплотипическое разнообразие варьирует от 0.133 до 0.911. Установлено, что высокие межвидовые генетические дистанции и выявленные видоспецифичные нуклеотидные замены и индели указывают на существенную дифференциацию хлоропластных геномов O. muricata, O. microphylla, O. trichophysa, O. glandulosa (линии 2, 3). Виды O. pseudoglandulosa, O. muricata, O. varlakovii и O. glandulosa (линия 1) образуют слабо дифференцированный комплекс, что обусловлено, вероятно, относительно недавней их дивергенцией.

Виды рода Oxytropis DC. (род Остролодка, Малышев, 2008) секции Polyadena Bunge (Fabaceae) – это бесстебельные растения с мутовчатым расположением листочков и бугорчатыми железками на бобах, листьях, прилистниках и чашечках, с пурпурово-лиловым, розовым или беловато-желтым венчиком (Малышев, 2008). Секция включает ~10 видов, в Азиатской России произрастает шесть видов: O. glandulosa Turcz. (остролодка железистая), O. physocarpa Ledeb. (о. вздуто-плодная), O. microphylla (Pall.) DC. (о. мелколистная), O. muricata (Pall.) DC. (о. колючковая), O. trichophysa Bunge (о. пушистопузырчатая) и O. varlakovii Serg. (о. Варлакова), четыре последних встречаются также на севере Монголии, а O. microphylla еще и в Северной Маньчжурии (Малышев, 2008). В Монголии также произрастает представитель секции Polyadena O. pseudoglandulosa Gontsch. ex Grub. (О. ложножелезистая) – эндем Монголии (Улзийхутаг, 2003). Виды O. glandulosa (узколокальный эндем Бурятии), O. trichophysa и эндем Алтая и Тывы O. physocarpa включены в Красную книгу Российской Федерации (2008) как редкие. O. glandulosa включен также в Красную книгу Республики Бурятия (2013). Реликты миоцен-плиоценовой флоры O. microphylla и O. varlakovii (Пешкова, 1972) включены в Красную книгу Иркутской области (2010), первый как уязвимый вид, второй, субэндемик юга Восточной Сибири, как вид, находящийся под угрозой исчезновения. Алтае-Саянский субэндемик O. muricata включен в Красную книгу Красноярского края (2012) как уязвимый вид, численность которого сокращается на северной границе ареала. Предполагается (Малышев, 2008), что O. microphylla возникла от гибридизации между O. muricata и O. lanata (Pall.) DC. (о. шерстистая) cекции Verticillares DC. Кроме этого O. muricata внешне сходна с O. interposita Sipl. (о. посредственная) секции Verticillares, но последняя отличается отсутствием железистости, большей высотой побегов и наличием опушения на соцветии и бобах (Сипливинский, 1966). По морфологии O. varlakovii отчасти напоминает O. interposita, но у первой бобы бородавчатые; O. varlakovii также близка к O. muricata и к O. glandulosa, но от первой отличается более короткими чашелистиками и более волосистыми бобами, а от второй – светлым венчиком (Малышев, 2008).

Известно, что многие представители рода Oxytropis, в том числе и виды секции Polyadena, используются в народной медицине Сибири, Монголии, Средней Азии и Казахстана в качестве эффективных лечебных средств, обладающих ранозаживляющими, диуретическими и сосудорасширяющими свойствами. Химические исследования растений показали наличие биологически активных веществ, таких как флавоноиды (кемпферол, рамназин, робинин, изоробинин, байкалеин и др.), алкалоиды (мурикатин, мурикатинин, мурикатид и др.), фенолкарбоновые кислоты, тритерпеноиды, сесквитерпеновые лактоны, кумарины и сапонины (Повыдыш и др., 2010). Флавоноиды обладают сосудорасширяющими, жаропонижающими, гипотензивными и желчегонными свойствами, а кумарины, обнаруженные у O. glandulosa, проявляют противоопухолевую активность (Повыдыш и др., 2010). Три алкалоида были выделены из надземной части O. pseudoglandulosa (Пурэвсурэн и др., 2002). Показано, что экстракт O. pseudoglandulosa может быть сильнодействующим средством для лечения окклюзионных сосудистых заболеваний (Lee et al., 2018).

В настоящее время из-за активной хозяйственной деятельности человека происходит резкое уменьшение численности особей, вплоть до полного исчезновения популяций в некоторых местообитаниях. Результаты ценопопуляционных исследований O. microphylla, O. varlakovii, O. trichophysa и O. glandulosa показали, что умеренная пастбищная дигрессия не наносит им вреда, а уязвимы они из-за малого размера популяций в пределах ограниченного ареала в сочетании с узкой экологической амплитудой (Селютина, Санданов, 2016). Поэтому виды секции Polyadena нуждаются в мерах по сохранению и восстановлению природных популяций. В первую очередь необходимо определить уровень генетической изменчивости и описать генофонд вида, так как один из решающих факторов при восстановлении вида – воссоздание его исторически сложившейся популяционно-генетической структуры. Эффективными и надежными молекулярными маркерами для популяционного анализа и реконструкции филогенетических связей близкородственных видов Oxytropis являются межгенные спейсеры psbA–trnH, trnL–trnF и trnS–trnG хлоропластной ДНК (хпДНК) (Холина и др., 2018, 2019; Kholina et al., 2018). По данным секвенирования этих регионов проведена оценка состояния природных популяций ряда редких и эндемичных видов Oxytropis (Холина и др., 2018; Kholina et al., 2018), уточнены филогенетические отношения видов секций Verticillares (Холина и др., 2019) и Orobia (Козыренко и др., 2020).

Цель работы – изучение генетического разнообразия видов Оxytropis секции Polyadena Азиатской России и реконструкция филогенетических связей близкородственных видов на основе анализа полиморфизма нуклеотидных последовательностей межгенных спейсеров psbA–trnH, trnL–trnF и trnS–trnG хпДНК.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом для исследования служили 129 растений из 13 природных популяций видов O. muricata, O. microphylla, O. pseudoglandulosa, O. varlakovii, O. glandulosa (по 5–15 образцов из популяции) и O. trichophysa (1 образец) секции Polyadena (табл. 1). Методы выделения ДНК, амплификации и секвенирования межгенных спейсеров psbA–trnH, trnL–trnF и trnS–trnG хпДНК описаны в наших предыдущих работах (Артюкова и др., 2004; Холина и др., 2016, 2018). Нуклеотидные последовательности были определены на генетическом анализаторе ABI 3500 (Applied Biosystems, США) в Центре коллективного пользования “Биотехнология и генетическая инженерия” ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН. Для каждого образца последовательности регионов выравнивали с использованием программы SeaView v. 4.7 (Gouy et al., 2010). Гаплотипическое (h) и нуклеотидное (π) разнообразия, генетические дистанции между популяциями/видами (FST – попарные значения индексов фиксации), межпопуляционную дифференциацию (ΦST, анализ молекулярной дисперсии, AMOVA), генный поток (Nm) и степень дивергенции (DXY) между популяциями/видами/гаплогруппами рассчитывали с помощью прикладных генетических программ Arlequin v. 3.5 (Excoffier, Lischer, 2010) и DnaSP v. 5.0 (Librado, Rozas, 2009). Генеалогические взаимоотношения гаплотипов анализировали методом медианного связывания (Median Joining (MJ)) в программе Network v. 5.0.1.1 (Bandelt et al., 1999), кодируя каждую делецию или вставку, независимо от их размера, как единичное мутационное событие. Филогенетический анализ последовательностей проводили методами максимальной экономии (Maximum Parsimony (MP)) и ближайшего связывания (Neighbour-Joining (NJ)) с помощью пакета программ PAUP v. 4.0b10 (Swofford, 2003), а также байесовского подхода (BI) в программе MrBayes 3.1.2 (Huelsenbeck, Ronquist, 2001). Устойчивость топологии MP- и NJ-деревьев оценивали с помощью бутстреп-анализа 1000 альтернативных деревьев (Bootstrap Percentage (BP), %). При BI-анализе полной матрицы создавали 10 000 000 генераций цепей Маркова, отбирая пробы каждые 1000 генераций, т.е. 10 000 проб. Апостериорные вероятности (Posterior Probabilities (PP)) рассчитаны по отобранным во время стационарной фазы деревьям. Значения BP < 50% и PP < 0.95 не принимали во внимание. В качестве внешней группы использовали образец O. glabra (Lam.) DC. (о. голая) секции Mesogaea Bunge (номера в GenBank LT856572, LT856585, LT856598) (Холина и др., 2018).

Таблица 1.

Исследуемые популяции видов Oxytropis секции Polyadena и параметры генетического разнообразия по данным полиморфизма межгенных спейсеров psbA–trnH, trnL–trnF и trnS–trnG хпДНК

Местонахождение
(число образцов)
Код
популяции
Разнообразие (SD) Гаплотипы
гаплотипическое нуклеотидное
O. muricata
Иркутская обл.
окр. оз. Гызги-Нур (9) MUR1 0.417 (0.191) 0.0009 (0.0006) P1–P3
окр. с. Сарма (8) MUR2 0.250 (0.180) 0.0007 (0.0005) P2, P4
окр. мыса Ото-Хушун (13) MUR3 0.692 (0.075) 0.0014 (0.0008) P1, P2, P5
В целом для вида (30) 0.533 (0.096) 0.0011 (0.0007) P1–P5
O. microphylla
Иркутская обл.
окр. с. Озера (9) MICR1 0.000 (0.000) 0.0000 (0.0000) P6
окр. оз. Гызги-Нур (6) MICR2 0.600 (0.215) 0.0007 (0.0005) P6, P7, P8
окр. оз. Гурби-Нур (11) MICR3 0.182 (0.144) 0.0001 (0.0001) P6, P7
окр. оз. Намиш-Нур (11) MICR4 0.182 (0.144) 0.0001 (0.0001) P6, P8
В целом для вида (37) 0.203 (0.084) 0.0002 (0.0002) P6–P8
O. pseudoglandulosa
Монголия, окр. г. Улан-Батор (7) PSEGLA 0.809 (0.130) 0.0011 (0.0007) P9–P12
O. trichophysa
Республика Тыва, хр. Монгун-Тайга, долина р. Мугур (1) TRICH P13
O. varlakovii
Забайкальский край, окр. оз. Ножий (5) VARL 0.700 (0.218) 0.0003 (0.0003) V1–V3*
O. glandulosa
Республика Бурятия
окр. с. Аргада (10) GLAKUR 0.911 (0.077)** 0.0059 (0.0033)** G1–G7**
окр. с. Уржил (14) GLABAR 0.703 (0.101)** 0.0036 (0.0020)** G4, G6–G9**
окр. с. Ширинга (15) GLASHIR 0.133 (0.112)** 0.0002 (0.0002)** G10, G11**
окр. с. Гарам (10) GLAGAR 0.356 (0.159)** 0.0006 (0.0004)** G10, G11**
В целом для вида (49) 0.763 (0.053) 0.0081 (0.0040) G1–G11

Примечание. SD – стандартное отклонение, * – гаплотипы (Холина и др., 2018), ** – значения генетического разнообразия и гаплотипы (Kholina et al., 2018).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для 75 растений видов O. muricata, O. microphylla, O. pseudoglandulosa и O. trichophysa были определены нуклеотидные последовательности межгенных спейсеров psbA–trnH, trnL–trnF и trnS–trnG хпДНК. В матрицу данных были включены полученные ранее последовательности этих же регионов 49 образцов из 4 популяций O. glandulosa (Kholina et al., 2018) и 5 образцов O. varlakovii (Холина и др., 2018). Нуклеотидные последовательности каждого региона хпДНК 129 образцов шести исследуемых видов секции Polyadena характеризуются относительно низкой нуклеотидной изменчивостью и разной длиной вследствие присутствия коротких (4–16 нуклеотидов) инсерций/делеций (инделей), моно- и динуклеотидных повторов. В последовательностях psbA–trnH обнаружены короткие индели (6 нуклеотидов) и поли-A-мотив (A9–A13), вариабельных нуклеотидных замен нет. В trnL–trnF выявлены три замены, информативные согласно методу максимальной экономии, делеция 16 нуклеотидов, поли-T-мотив (T8–T11) и динуклеотидный TA-мотив, в котором от 6 до 13 повторов. В trnS–trnG обнаружены мотивы поли-A (A10–A14) и поли-T (T7–T11), а также 8 нуклеотидных замен, информативных согласно методу максимальной экономии. Длина объединенной матрицы последовательностей psbA–trnH, trnL–trnF и trnS–trnG после выравнивания составила 2431 сайт (1–463, 464–1239 и 1240–2431 соответственно), из них 2359 мономорфных и 11 нуклеотидных замен, информативных согласно методу максимальной экономии, в позициях 602, 1238, 1239, 1263, 1295, 1403, 1585, 1686, 1727, 2113 и 2199. Все последовательности образцов O. muricata маркируются двумя нуклеотидными заменами (T в позиции 1238 и A в позиции 1239), O. microphylla – одной заменой (C в позиции 1686) и вставкой шести нуклеотидов (TAAATA, позиции 393–398), O. trichophysa – вставкой четырех нуклеотидов (TTTA, позиции 765–768). У O. pseudoglandulosa, O. varlakovii и O. glandulosa видоспецифичных маркеров нет.

Нуклеотидные замены и индельные вариации в 129 последовательностях объединенной матрицы выявили 27 гаплотипов, из них 13 гаплотипов видов O. muricata, O. microphylla, O. pseudoglandulosa и O. trichophysa были депонированы в GenBank под номерами MN199983–MN199995, MN199996–MN200008, MN200009–MN200021 (psbA–trnH, trnL–trnF, trnS–trnG соответственно), 3 гаплотипа O. varlakovii (V1–V3) и 11 гаплотипов O. glandulosa (G1–G11) были определены и депонированы в GenBank нами ранее (Холина и др., 2018; Kholina et al., 2018). O. muricata принадлежит пять гаплотипов (P1–P5), O. microphylla – 3 (P6–P8), O. pseudoglandulosa – 4 (P9–P12), O. trichophysa – 1 (P13) (табл. 1). Общих гаплотипов у исследуемых видов Oxytropis секции Polyadena не обнаружено.

Гаплотипическое и нуклеотидное разнообразия в популяциях изменяются от 0.133 до 0.911 и от 0.0001 до 0.0059 соответственно, одна популяция O. microphylla (MICR1) оказалась мономорфной (табл. 1). Виды характеризуются низким уровнем нуклеотидного разнообразия, кроме O. glandulosa, и разными уровнями гаплотипического разнообразия: низким у O. microphylla, средним у O. muricata, высоким у O. pseudoglandulosa, O. varlakovii и O. glandulosa (табл. 1). У O. muricata генетические дистанции (FST) между парами популяций MUR1–MUR2, MUR1–MUR3 и MUR2–MUR3 очень малы (0.02591, 0.03291 и 0.15937 соответственно) и статистически значимы только у последней пары (P < 0.028), генный поток (Nm) составил ~3 мигранта на поколение. У O. microphylla значения FST между всеми парами популяций также были очень малы и все статистически незначимы (данные не представлены). Анализ распределения изменчивости (AMOVA) показал, что достоверная генетическая дифференциация между географически изолированными популяциями у O. muricata и между популяциями у O. microphylla отсутствует (ΦST = 0.08395, P > 0.130 и ΦST = = 0.02361, P > 0.263 соответственно). Один из показателей степени генетической разобщенности между популяциями – дивергенция нуклеотидных последовательностей (Dxy), которая отсутствует между популяциями каждого из этих видов. Ранее было установлено (Kholina et al., 2018), что у O. glandulosa >75% изменчивости приходится на межпопуляционную компоненту и <25% – на внутрипопуляционную (ΦST = 0.75783, P < 0.0001), Nm = 0.25. Такая высокая межпопуляционная дифференциация связана с наличием трех эволюционных (филетических) линий хлоропластного генома у этого вида (Kholina et al., 2018).

Для расчета генетических дистанций и реконструкции филогенетических связей с близкородственными видами в объединенную матрицу нуклеотидных последовательностей гаплотипов видов секции Polyadena были добавлены полученные ранее последовательности гаплотипов L1–L18 O. lanata (LT994841–LT994858, LT994895–LT994912, LT994949–LT994966) (Холина и др., 2019) и H23–H27 O. interposita (LT856489–LT856493, LT856522–LT856526, LT856555–LT856559) (Холина и др., 2018) cекции Verticillares. Длина матрицы после выравнивания составила 2435 сайтов, 2347 из которых мономорфные, 16 нуклеотидных замен были информативны согласно методу максимальной экономии.

Генетические дистанции между видами/линиями секции Polyadena варьировали в значительных пределах (табл. 2). Высокие и статистически значимые значения FST определены между O. lanata и всеми видами секции Polyadena и O. interposita секции Verticillares. Генетические дистанции между парами, образованными видами O. interposita, O. muricata, O. pseudoglandulosa и O. varlakovii, оказались очень малы и статистически незначимы. Значения дивергенции нуклеотидных последовательностей между парами, образованными каждым видом O. lanata и O. interposita со всеми другими видами секции Polyadena, согласуются со значениями FST. Следует отметить, что среднее число нуклеотидных замен на один сайт между O. interposita и O. pseudoglandulosa равно нулю.

Таблица 2.

Нуклеотидная дивергенция и генетические дистанции между O. glandulosa (линии 1–3), O. muricata (4), O. microphylla (5), O. pseudoglandulosa (6), O. varlakovii (7), O. trichophysa (8), O. lanata (9) и O. interposita (10) по данным полиморфизма межгенных спейсеров psbA–trnH, trnL–trnF и trnS–trnG хпДНК

Вид 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
DXY
1 4.000 (4) 5.000 (5) 4.000 (4) 6.000 (6) 2.000 (2) 1.333 (1) 3.000 (3) 5.889 (5) 2.000 (2)
2 0.00168 5.000 (5) 6.000 (6) 6.000 (6) 4.000 (4) 3.333 (3) 3.000 (3) 5.889 (5) 4.000 (4)
3 0.00209 0.00211 7.000 (7) 1.000 (1) 5.000 (5) 4.333 (4) 2.000 (2) 6.889 (6) 5.000 (5)
4 0.00167 0.00253 0.00293 8.000 (8) 2.000 (2) 2.667 (2) 5.000 (5) 7.889 (7) 2.000 (2)
5 0.00251 0.00253 0.00042 0.00334 6.000 (6) 5.333 (5) 3.000 (3) 7.889 (7) 6.000 (6)
6 0.00083 0.00168 0.00209 0.00084 0.00251 0.667 (0) 3.000 (3) 5.889 (5) 0.000 (0)
7 0.00056 0.00140 0.00181 0.00111 0.00223 0.00028 2.333 (2) 5.222 (4) 0.667 (0)
8 0.00125 0.00126 0.00084 0.00209 0.00125 0.00125 0.00097 4.889 (4) 3.000 (3)
9 0.00246 0.00248 0.00289 0.00330 0.00330 0.00246 0.00218 0.00204 5.889 (5)
10 0.00084 0.00168 0.00209 0.00084 0.00251 0.00000 0.00028 0.00124 0.00246
FST
1 0.00000                  
2 0.54912** 0.00000                
3 0.82786** 0.67449** 0.00000              
4 0.43911** 0.57627* 0.80583*** 0.00000            
5 0.79923** 0.68848** 0.85564*** 0.78502** 0.00000          
6 0.36905** 0.59045** 0.85772*** 0.33892** 0.81150** 0.00000        
7 0.33956** 0.54812** 0.91058*** 0.37138** 0.86792*** 0.16049*** 0.00000      
8 0.67742*** 0.38462*** 0.84615*** 0.65432*** 0.81481*** 0.73099*** 0.87879*** 0.00000    
9 0.68718* 0.72446* 0.86189** 0.69489* 0.80840* 0.67706* 0.66002* 0.70918** 0.00000  
10 0.35706* 0.59282** 0.83765** 0.25758*** 0.79850** 0.05224*** 0.00319*** 0.68182*** 0.65659* 0.00000

Примечание. DXY – нуклеотидная дивергенция, выше диагонали – среднее число нуклеотидных различий (число фиксированных различий), ниже диагонали – среднее число нуклеотидных замен на один сайт; FST – парные генетические дистанции. * – P < 0.0001; ** – 0.01 < P < 0.05; *** – P > 0.05. Значимость определена на основе 1023 пермутаций; для табл. 2 и 3.

Филогенетические деревья, построенные разными методами (MP, NJ, BI), практически не различаются по топологии. На рис. 1 представлено MP-дерево (консенсус 78 деревьев: длина – 34 шага, индекс соответствия – 0.9706, индекс гомоплазии – 0.0294, индекс удерживания – 0.9923), в котором гаплотипы видов Oxytropis двух секций сформировали две клады. Все гаплотипы O. lanata образовали кладу I с невысокой поддержкой в MP- и NJ-анализах (74 и 67% соответственно) и не поддержанную в BI-анализе, а гаплотипы всех видов секции Polyadena и O. interposita cекции Verticillares образовали слабо поддержанную в MP- и NJ-анализах (63 и 62% соответственно) и высоко поддержанную в BI-анализе (PP = 1.00) монофилетическую кладу II, в которой можно выделить три поддержанные клады второго порядка (рис. 1). Кладу 1 образуют гаплотипы O. glandulosa (линия 2), кладу 2 – O. microphylla, O. trichophysa и O. glandulosa (линия 3), кладу 3 – O. muricata, O. glandulosa (линия 1), O. pseudoglandulosa, O. varlakovii и O. interposita, взаимоотношения последних трех видов остаются неразрешенными.

Рис. 1.

MP-дерево генетических взаимоотношений видов Oxytropis секции Polyadena и близкородственных им видов секции Verticillares. Числа в узлах – значения индекса бутстрепа для MP- и NJ-методов (>50%) и апостериорные вероятности для BI-анализа (>0.95). Внешняя группа – O. glabra.

На медианной сети генеалогических связей гаплотипов (рис. 2) гаплотипы восьми видов двух секций формируют шесть дивергентных гаплогрупп (I–VI). Гаплогруппу I составили все гаплотипы O. lanata (L1–L18), II – гаплотипы G4, G6–G9 O. glandulosa (линия 2), III – гаплотип P13 O. trichophysa, IV – все гаплотипы O. microphylla (P6–P8), V – все гаплотипы O. muricata (P1–P5), O. pseudoglandulosa (P9–P12), O. varlakovii (V1–V3), O. interposita (H23–H27) и гаплотипы G1–G3, G5 O. glandulosa (линия 1), VI – гаплотипы G10 и G11 O. glandulosa (линия 3). Следует отметить, что распределение гаплотипов в гаплогруппе V не соответствует ни популяционной, ни таксономической принадлежности. Так, гаплотипы O. muricata находятся на трех разных веточках, как и гаплотипы O. glandulosa (линия 1), гаплотипы V3 и V2 O. varlakovii соединены через гаплотип H24 O. interposita и, кроме того, гаплотипы V2 O. varlakovii и H26 O. interposita оказались идентичными (общий гаплотип), хотя эти виды относятся к разным секциям (рис. 2). Во всех гаплогруппах выявлены маркерные нуклеотидные замены и индели: в гаплогруппе I – A в позициях 1172 и 1462, C в позиции 2144; II – C и T в позициях 602 и 1730 соответственно; III – вставка четырех нуклеотидов (TTTA, позиции 765–768); IV – вставка шести нуклеотидов (TAAATA, позиции 393–398) и C в позиции 1689; V – T в позиции 1588; VI – делеция шести нуклеотидов (TATTTT, позиции 162–167). Генетические дистанции между гаплогруппами высоки (табл. 3), кроме пары II–III, которая объединяет гаплотипы O. glandulosa (линия 2) и O. trichophysa соответственно. Наименьшая нуклеотидная дивергенция определена между парами гаплогрупп III–VI и IV–VI, т.е. O. glandulosa (линия 3)–O. trichophysa и O. glandulosa (линия 3)–O. microphylla (табл. 3).

Рис. 2.

Медианная сеть гаплотипов видов Oxytropis секции Polyadena и близкородственных им видов секции Verticillares. Размер окружностей отражает частоту встречаемости гаплотипов, маленькие черные кружки – гипотетические гаплотипы, поперечные тонкие штрихи на ветвях – мутационные события, черные толстые штрихи – вставка нуклеотидов, белые толстые штрихи – делеция нуклеотидов, штриховыми линиями обведены гаплогруппы I–VI. Код гаплотипа см. табл. 1. * – мутации для O. glabra, используемой в качестве внешней группы, не указаны и не рассматриваются.

Таблица 3.

Нуклеотидная дивергенция и генетические дистанции между гаплогруппами I–VI (рис. 2), образованные гаплотипами хпДНК Oxytropis muricata, O. microphylla, O. pseudoglandulosa, O. trichophysa, O. varlakovii, O. glandulosa, O. lanata и O. interposita

Гаплогруппа I II III IV V VI
DXY
I 5.889 (5) 4.889 (4) 7.889 (7) 6.270 (4) 6.889 (6)
II 0.00248 3.000 (3) 6.000 (6) 4.381 (3) 5.000 (5)
III 0.00204 0.00126 3.000 (3) 3.381 (2) 2.000 (2)
IV 0.00330 0.00253 0.00125 6.381 (5) 1.000 (1)
V 0.00262 0.00184 0.00141 0.00267 5.381 (4)
VI 0.00289 0.00211 0.00084 0.00042 0.00225
FST
I 0.00000          
II 0.72446* 0.00000        
III 0.70918*** 0.38462*** 0.00000      
IV 0.80840* 0.68848*** 0.81481*** 0.00000    
V 0.60677* 0.64769* 0.58729*** 0.72947* 0.00000  
VI 0.86189* 0.67449*** 0.84615*** 0.85564** 0.78510** 0.00000

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Проведенное исследование видов Oxytropis секции Polyadena по данным нуклеотидного полиморфизма межгенных спейсеров psbA–trnH, trnL–trnF и trnS–trnG хпДНК показало, что у всех видов уровень нуклеотидного разнообразия низкий, а уровень гаплотипического разнообразия варьирует от низкого до высокого. Три исследуемые популяции O. muricata и три из четырех популяций O. microphylla характеризуются низкими показателями генетического разнообразия, что обычно связывают с прохождением популяции через “бутылочное горлышко”, т.е. резкое сокращение численности с последующим ее восстановлением (Абрамсон, 2007). Мономорфизм популяции MICR1 O. microphylla может свидетельствовать об относительно недавнем ее происхождении из небольшой группы близкородственных растений. Отсутствие достоверной внутривидовой межпопуляционной дифференциации у O. muricata и у O. microphylla, как и у O. bargusinensis (Холина и др., 2018) и у O. myriophylla (Холина и др., 2019), связано, вероятно, с постоянным генным потоком через цепь промежуточных местообитаний, а отсутствие нуклеотидной дивергенции может свидетельствовать о том, что исследуемые локальные популяции каждого вида представляют собой региональную метапопуляцию. Генетическое разнообразие у O. pseudoglandulosa и O. varlakovii сравнимо с таковым у эндемичных видов O. chankaensis (h = 0.718, π = 0.0005) (Artyukova et al., 2011), O. bargusinensis (h = 0.844, π = 0.0013), O. interposita (h = 0.769, π = 0.0015) и O. triphylla (h = = 0.915, π = 0.0020) (Холина и др., 2018).

Высокие значения генетических дистанций между O. muricata, O. microphylla, O. trichophysa, O. glandulosa (линия 2) и O. glandulosa (линия 3) (табл. 2), гаплотипы которых в филогенетических анализах находятся в разных гаплогруппах (рис. 2), а также выявленные маркерные нуклеотидные замены и индели свидетельствуют о существенной дифференциации их хлоропластных геномов. Учитывая существующие мнения ботаников (Малышев, 2008; Сипливинский, 1966) о происхождении некоторых видов секции Polyadena и их сходстве с представителями видов секции Verticillares, мы включили в филогенетические анализы близкородственные виды. Результаты проведенного исследования не подтвердили предположение, что O. microphylla возникла в результате межсекционной гибридизации O. muricata и O. lanata (Малышев, 2008). Так, у этих трех видов общих гаплотипов не обнаружено, каждый из них имеет свои видоспецифичные маркеры, в филогенетических реконструкциях виды находятся в разных кладах/гаплогруппах (рис. 1, 2), значения генетических дистанций между которыми высоки (табл. 3).

Объединение всех гаплотипов видов O. muricata, O. varlakovii, O. pseudoglandulosa и O. glandulosa (линия 1) секции Polyadena и O. interposita секции Verticillares в одну кладу/гаплогруппу (рис. 1, 2) не случайно. Генетическая близость O. interposita к видам секции Polyadena была показана при изучении эндемичных видов Oxytropis (Холина и др., 2018) и 11 видов секции Verticillares (Холина и др., 2019). Так, присутствие у O. interposita видоспецифичных нуклеотидных замен, отсутствие общих гаплотипов с остальными видами секции Verticillares, высокие статистически значимые генетические дистанции (от 0.67524 до 0.89490) между O. interposita и другими видами подтверждают существенную дивергенцию хлоропластного генома O. interposita (Холина и др., 2019). Низкие статистически незначимые значения генетических дистанций между O. interpositaO. muricata и O. interpositaO. varlakovii (0.25758 и 0.00319 соответственно), наличие общего гаплотипа у O. interposita и O. varlakovii (табл. 1) отсутствие видоспецифичных дифференцирующих маркеров подтверждают генетическую близость этих видов. Кроме того, мы сравнили морфологические признаки, приведенные ранее (Малышев, 2008), для O. interposita, O. varlakovii, O. muricata и наиболее близких к O. interposita видов O. myriophylla и O. oxyphylla секции Verticillares и обнаружили полное совпадение по ряду диагностических признаков у O. interposita и у представителей секции Polyadena в отличие от секции Verticillares. Среди этих признаков отмечены полумутовчатые или расставленные, кроме мутовчатых, листочки, крупный цветок длиной 25–30 мм в отличие от цветка длиной 15–20 мм у представителей секции Verticillares, чашечка трубчато-колокольчатая у O. interposita и видов Polyadena, но трубчатая у видов Verticillares, почти двугнездные бобы с широкой брюшной перегородкой в отличие от почти одногнездных у видов Verticillares и некоторые другие. Таким образом, полученные нами генетические данные и сходство морфологических признаков свидетельствуют в пользу предположения (Холина и др., 2018) о вероятном происхождении O. interposita от представителя секции Polyadena, но для уточнения секционной принадлежности O. interposita требуются дальнейшие исследования.

Отсутствие значительных генетических различий между O. muricata, O. varlakovii, O. pseudoglandulosa, O. glandulosa (линия 1) и O. interposita, объединение их гаплотипов в одну гаплогруппу и смешанное распределение гаплотипов, не соответствующее ни популяционной, ни таксономической принадлежности, указывают на полифилию данной группы. К наиболее распространенным причинам этого относятся общность происхождения, относительно недавняя дивергенция и быстрая радиация молодых видов, что сопровождается неполным расхождением генеалогических линий (Абрамсон, 2007; Шанцер, 2013). На основе анализа ядерных и хлоропластных маркеров показано, что быстрая радиация характерна для видов рода Oxytropis (Shavvon et al., 2017), как и ряда крупных родов сем. Fabaceae – Astragalus L. (Bagheri et al., 2017), Lupinus L. (Drummond et al., 2012) и др. Эти процессы нередко осложняются интрогрессией (Абрамсон, 2007; Шанцер, 2013), а в случае с видами Oxytropis еще и полиплоидией (Малышев, 2008). Все это справедливо для исследуемой нами группы видов. Так, O. interposita из единственной известной популяции – тетраплоид, 2n = 32, O. varlakovii с оз. Ножий – триплоид, 2n = 24 (Кониченко, Селютина, 2013), а для O. muricata известны диплоидная и тетраплоидная расы, 2n = 16 и 32 соответственно (Малышев, 2008).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение генетического разнообразия видов Оxytropis секции Polyadena Азиатской России выявило крайне низкое нуклеотидное разнообразие в популяциях (0.0001–0.0014), за исключением двух популяций O. glandulosa. Хлоропластные геномы видов O. muricata, O. microphylla, O. trichophysa и O. glandulosa (линии 2, 3) значительно дифференцированы. Группа видов O. muricata, O. varlakovii, O. pseudoglandulosa и O. glandulosa (линия 1) образует единый комплекс, что обусловлено, вероятно, относительно недавней их дивергенцией и неполным расхождением генеалогических линий. Низкий уровень полиморфизма не обеспечивает адаптивный потенциал видов и увеличивает риск их исчезновения. Поэтому необходимо проводить поиск новых местонахождений видов, изучать демографическую структуру, жизненность и генетическое разнообразие популяций, а также осуществлять регулярный мониторинг их состояния.

Авторы выражают благодарность Д.В. Санданову и И.Ю. Селютиной за предоставление растительного материала.

Список литературы

  1. Абрамсон Н.И. Филогеография: итоги, проблемы, перспективы // Информ. вестн. ВОГиС. 2007. Т. 11. № 2. С. 307–331.

  2. Артюкова Е.В., Холина А.Б., Козыренко М.М., Журавлев Ю.Н. Анализ генетической изменчивости редкого эндемичного вида Oxytropis chankaensis Jurtz. (Fabaceae) на основе RAPD маркеров // Генетика. 2004. Т. 40. № 7. С. 877–884.

  3. Козыренко М.М., Холина А.Б., Артюкова Е.В., Колдаева М.Н., Якубов В.В., Прокопенко С.В. Молекулярно-филогенетическая характеристика эндемичных дальневосточных близкородственных видов секции Orobia рода Oxytropis (Fabaceae) // Генетика. 2020. Т. 56. № 4. С. 421–432.

  4. Кониченко Е.С., Селютина И.Ю. Числа хромосом редких и эндемичных видов рода Oxytropis (Fabaceae) // Ботан. журн. 2013. Т. 98. № 5. С. 647–651.

  5. Красная книга Российской Федерации (растения и грибы). М.: КМК, 2008. 855 с.

  6. Красная книга Иркутской области. Иркутск: Время странствий, 2010. 480. c.

  7. Красная книга Красноярского края. Т. 2. Редкие и находящиеся под угрозой исчезновения виды дикорастущих растений и грибов. Красноярск: Сиб. фед. ун-т, 2012. 572 с.

  8. Красная книга Республики Бурятия: Редкие и находящиеся под угрозой исчезновения виды животных, растений и грибов. 3-е изд., перераб. и доп. Улан-удэ: БНЦ СО РАН, 2013. 688 с.

  9. Малышев Л.И. Разнообразие рода Остролодка (Oxytropis) в Азиатской России // Turczaninowia. 2008. Т. 11. № 4. С. 5–141.

  10. Пешкова Г.А. Третичные реликты в степной флоре Байкальской Сибири // Науч. чтения памяти М.Г. Попова. Иркутск. 1972. Вып. 12–13. С. 25–58.

  11. Повыдыш М.Н., Бобылева Н.С., Битюкова Н.В. Род 29. Oxytropis DC. – Остролодочник // Растительные ресурсы России. СПб.; М.: КМК, 2010. Т. 3. С. 65–69.

  12. Пурэвсурэн С., Chang Q.H., Нарантуяа С., Цэцэгмаа С. Алкалоиды остролодочника ложножелезистого (Oxytropis pseudoglandulosa Gontsch. ex Grub.), применяемого в традиционной медицине Монголии // Сиб. мед. журн. (Иркутск). 2002. Т. 34. № 5. С. 73–76.

  13. Селютина И.Ю., Санданов Д.В. Редкие виды Oxytropis секции Polyadena Bunge в Южной Сибири: оценка состояния популяций // Экосистемы Центральной Азии: исследования, сохранение, рациональное использование: Матер. XIII Убсунурского междунар. симпозиума. Кызыл: ТУвГУ, 2016. С. 326–329.

  14. Сипливинский В.Н. Флористические находки в северо-восточном Прибайкалье // Новости систематики высших растений. М; Л.: Наука, 1966. С. 272–291.

  15. Улзийхутаг Н. Бобовые Монголии (таксономия, экология, география, филогения и хозяйственное значение). Улаанбаатар: Бемби Сан, 2003. 587 с.

  16. Холина А.Б., Козыренко М.М., Артюкова Е.В., Санданов Д.В. Современное состояние популяций эндемичных видов Oxytropis Байкальской Сибири и их филогенетические связи по данным секвенирования маркеров хлоропластной ДНК // Генетика. 2018. Т. 54. № 7. С. 795–806.

  17. Холина А.Б., Козыренко М.М., Артюкова Е.В., Санданов Д.В. Дивергенция видов Oxytropis секции Verticillares (Fabaceae) степной флоры Байкальской Сибири на основе анализа хлоропластной ДНК // Генетика. 2019. Т. 55. № 6. С. 665–674.

  18. Холина А.Б., Козыренко М.М., Артюкова Е.В., Санданов Д.В., Андриянова Е.А. Филогенетические взаимоотношения видов Oxytropis DC. subg. Oxytropis и Phacoxytropis (Fabaceae) Азиатской России на основе анализа нуклеотидных последовательностей межгенных спейсеров хлоропластного генома // Генетика. 2016. Т. 52. № 8. С. 895–909.

  19. Шанцер И.А. Филогения и систематика недавно дивергировавших групп на примере рода Rosa // Тр. Зоол. ин-та РАН. 2013. Приложение № 2. С. 202–216.

  20. Artyukova E.V., Kozyrenko M.M., Kholina A.B., Zhuravlev Yu.N. High chloroplast haplotype diversity in the endemic legume Oxytropis chankaensis may result from independent polyploidization events // Genetica. 2011. V. 139. № 2. P. 221–232. https://doi.org/10.1007/s10709-010-9539-8

  21. Bagheri A., Maassoumi A.A., Rahiminejad M.R., Brassac J., Blattner F.R. Molecular phylogeny and divergence times of Astragalus section Hymenostegis: An analysis of a rapidly diversifying species group in Fabaceae // Sci. Rep. 2017. № 7: 14033. https://doi.org/10.1038/s41598-017-14614-3

  22. Bandelt H.-J., Forster P., Röhl A. Median-joining networks for inferring intraspecific phylogenies // Mol. Biol. Evol. 1999. V. 16 (1). P. 37–48.

  23. Drummond C.S., Eastwood R.J., Miotto S.T.S., Hughes C.E. Multiple continental radiations and correlates of diversification in Lupinus (Leguminosae): testing for key innovation with incomplete taxon sampling // Syst. Biol. 2012. V. 61. № 3. P. 443–460. https://doi.org/10.1093/sysbio/syr126

  24. Excoffier L., Lischer H.E.L. Arlequin suite ver. 3.5: A new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows // Mol. Ecol. Res. 2010. V. 10. P. 564–567.

  25. Gouy M., Guindon S., Gascuel O. SeaView version 4: A multiplatform graphical user interface for sequence alignment and phylogenetic tree building // Mol. Biol. Evol. 2010. V. 27. P. 221–224. https://doi.org/10.1093/molbev/msp259

  26. Huelsenbeck J.P., Ronquist F. MrBayes: Bayesian inference of phylogenetic trees // Bioinformatics. 2001. V. 17. № 8. P. 754–755.

  27. Kholina A., Kozyrenko M., Artyukova E., Sandanov D., Selyutina I., Chimitov D. Plastid DNA variation of the endemic species Oxytropis glandulosa Turcz. (Fabaceae) // Turk. J. Bot. 2018. V. 42. P. 38–50. https://doi.org/10.3906/bot-1706-11

  28. Lee J., Lee C.Y., Seo H.H., Bazarragchaa B., Batdelger G., Choi S., Hwang K.C., Lee S., Lim S. Extract of Oxytropis pseudoglandulosa inhibits vascular smooth muscle cell proliferation and migration via suppression of ERK1/2 and Akt signaling pathways // Clin. Hemorheol. Micro. 2018. V. 69. № 1–2. P. 277–287. https://doi.org/10.3233/CH-189126

  29. Librado P., Rozas J. DnaSP v5: A software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data // Bioinformatics. 2009. V. 25. № 11. P. 1451–1452.

  30. Shavvon R.S., Kazempour-Osaloo S., Maassoumi A.A., Moharrek F., Karaman Erkul S., Lemmon A., Lemmon E.M., Michalak I., Muellner-Riehl A.N., Favre A. Increasing phylogenetic support for explosively radiating taxa: The promise of high-throughput sequencing for Oxytropis (Fabaceae) // J. Syst. Evol. 2017. V. 55. № 4. P. 385–404. https://doi.org/10.1111/jse.12269

  31. Swofford D.L. PAUP*: Phylogenetic analysis using parsimony (*and other methods): version 4.04. Sunderland. MA. USA: Sinauer Associates Inc., 2003.

Дополнительные материалы отсутствуют.