Известия РАН. Серия биологическая, 2021, № 2, стр. 153-162

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растения озимой пшеницы Triticum aestivum L. сорта Московская 39 выращивали в камере искусственного климата при 22°С, относительной влажности воздуха 60–70%, фотосинтетически активной радиации (ФАР) 100 мкмоль/(м² с), 14-часовом фотопериоде на питательном растворе Хогланда–Арнона с оптимальным (вариант 22°С и 2 мкМ Zn) или высоким (вариант 22°С и 1000 мкМ Zn) содержанием Zn. Спустя 7 сут (исходная точка) одну часть растений обоих вариантов переносили в климатическую камеру с температурой 4°С (варианты 4°С и 2 мкМ Zn; 4°С и 1000 мкМ Zn), а другая их часть оставалась в прежних условиях. Значения и концентрации Zn 1000 мкМ и температуры 4°С, выбранные на основе предварительных опытов, находятся в пределах субповреждающих для данного сорта пшеницы. В исходной точке, а также через 1, 3 и 7 сут у растений всех вариантов измеряли показатели, характеризующие их рост (длина корня, высота побега, сырая и сухая биомассы подземных и надземных органов), интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ), активность СОД и ПО, а также содержание Zn в органах растений.

Интенсивность ПОЛ оценивали по содержанию малонового диальдегида (МДА), которое определяли с использованием реакционной среды, содержащей 0.25%-ный раствор тиобарбитуровой кислоты в 10%-ной трихлоруксусной кислоте (Heath, Packer, 1968). Растительный материал гомогенизировали в реакционной среде. Гомогенат выдерживали на водяной бане при 95°С в течение 30 мин, быстро охлаждали и центрифугировали 10 мин при 10 000 g. Оптическую плотность супернатанта измеряли с использованием спектрофотометра СФ-2000 (Спектр, Россия) при 532 и 600 нм. Для расчета содержания МДА (мкмоль/г сырой массы) использовали коэффициент экстинкции (ε), равный 155 мМ^–1 см^–1.

Для определения активности СОД (КФ 1.15.1.1) и ПО (КФ 1.11.1.7) листья гомогенизировали в 0.1 М фосфатном буфере (pH 7.8). Гомогенат центрифугировали при 15 000 g в течение 20 мин при 4°С, полученный супернатант использовали для определения содержания белка и активности ферментов спектрофотометрическим методом. Активность СОД определяли по способности ингибировать фотохимическое восстановление нитросинего тетразолия (Beauchamp, Fridovich, 1971). Оптическую плотность раствора измеряли при 560 нм. За единицу активности принимали количество фермента, вызывающее 50%-ное ингибирование реакции. Активность ПО определяли с помощью гваякола в качестве субстрата (ε = 26.6 мМ^–1 см^–1). Динамику изменения оптической плотности раствора регистрировали при длине волны 470 нм (Maehly, Chance, 1954). Активность ферментов рассчитывали на 1 мг белка. Общее содержание белка определяли методом Брэдфорд с помощью бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта (Bradford, 1976). Содержание Zn в корнях и побегах измеряли на атомно-абсорбционном спектрофотометре АА-7000 (Shimadzu, Япония).

Все ростовые показатели изучали на выборке, представленной в каждом варианте опыта 12 растениями. Биологическая повторность при изучении биохимических показателей была 2–3-кратная, аналитическая – 3–4-кратная. Весь опыт повторяли дважды. В таблицах представлены средние значения по двум независимым опытам и их стандартные ошибки. О достоверности различий судили по критерию Стьюдента при Р < 0.05.

Исследования были выполнены на научном оборудовании Центра коллективного пользования ФИЦ “Карельский научный центр РАН”.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Анализ содержания Zn в органах растений показал, что спустя 7 сут экспозиции на растворе с высокой концентрацией металла (исходная точка) его содержание в корнях и листьях пшеницы было соответственно в 50 и 40 раз выше, чем у растений, находящихся при его оптимальной концентрации (табл. 1). В дальнейшем при 22°С содержание металла в органах растений продолжало возрастать, а при 4°С практически не менялось.

Воздействие высокой концентрации Zn ингибировало рост проростков пшеницы. Так, через 7 сут (исходная точка) длина корней и высота побегов были соответственно на 33 и 23% меньше, чем при оптимальном содержании Zn в корнеобитаемой среде (табл. 2). Помимо этого наблюдалось снижение накопления сырой и сухой биомасс корней, а также сырой биомассы побегов (на 17, 19 и 14% соответственно). В дальнейшем при 22°С в условиях избытка Zn рост проростков продолжался, хотя ингибирующее влияние высокой концентрации металла сохранялось.

Действие температуры 4°С вызывало остановку роста проростков как при оптимальном, так и при высоком содержании Zn в среде. При этом рост корней в условиях действия холода отсутствовал, а при высокой концентрации Zn в корнеобитаемой среде к концу опыта наблюдалось даже некоторое снижение их сырой биомассы. Рост побега в высоту также существенно тормозился. Однако накопление биомассы побегов в оптимальных условиях минерального питания спустя 3 сут возобновлялось. В условиях избытка Zn увеличения сырой биомассы побегов не было, а прирост сухой биомассы спустя 7 сут оказался значительно меньше, чем при оптимальном содержании Zn в среде.

Избыток Zn в клетках, как известно, может вызвать окислительный стресс, связанный с увеличением в них количества АФК (Рахманкулова и др., 2008; Wang et al., 2009; Li et al., 2013; Blasko et al., 2015). Нами было обнаружено, что после 7 сут экспозиции на растворе с высокой концентрацией Zn (исходная точка) содержание МДА, являющегося конечным продуктом ПОЛ, в корнях и листьях пшеницы было соответственно в 1.2 и 1.3 раза выше, чем у растений в оптимальных условиях минерального питания (табл. 3). В дальнейшем в варианте опыта 22°С и 1000 мкМ Zn интенсивность ПОЛ в корнях снижалась практически до контрольного значения, а в листьях продолжала увеличиваться и к концу опыта превышала исходную в 1.5 раза.

При воздействии на растения температуры 4°С в корнях в течение первых 3 сут количество МДА повышалось, причем независимо от содержания Zn во внешней среде (табл. 3). Однако к 7-м сут в варианте с концентрацией Zn 2 мкМ интенсивность ПОЛ несколько снижалась, тогда как в варианте с концентрацией 1000 мкМ она продолжала увеличиваться. В листьях при 4°С содержание МДА возрастало только при избытке Zn в корнеобитаемой среде (табл. 3).

Изучение активности антиоксидантных ферментов показало, что у растений, находящихся в течение 7 сут в условиях избытка Zn (исходная точка), активность СОД в корнях и листьях была практически такой же, как у проростков, находящихся при оптимальной концентрации металла, активность же ПО в корнях была в 2 раза выше (табл. 3). На протяжении следующих 7 сут при 22°С активность обоих ферментов увеличивалась, и к концу опыта активность СОД в корнях и листьях превышала исходную в 3 и 1.7, а активность ПО – в 3.5 и 7 раз соответственно.

При 4°С активность ферментов в целом была заметно ниже, чем при 22°С. При этом в корнях у проростков, находившихся в оптимальных условиях минерального питания, наблюдались разнонаправленные ее изменения. Так, активность СОД начиная с 1-х сут воздействия снижалась (по сравнению с исходной) и оставалась пониженной до конца опыта, тогда как активность ПО увеличивалась, достигая максимальных значений через 7 сут действия низкой температуры (табл. 3). В листьях активность СОД первоначально (1–3 сут) также снижалась, а активность ПО не менялась, но спустя 7 сут в листьях было зафиксировано повышение активности обоих ферментов. При этом активность СОД увеличивалась в 1.3, а активность ПО – более чем в 3 раза.

В случае когда температура 4°С действовала на проростки, находившиеся в условиях избытка Zn, в корнях спустя 1 сут происходило резкое снижение (по сравнению с исходным) активности ПО при сохранении неизменной активности СОД. Однако в дальнейшем активность обоих ферментов возрастала и в корнях, и в листьях, достигая максимальных значений через 7 сут. При этом в течение всего периода действия низкой температуры активность СОД и ПО в органах проростков, находившихся в условиях избытка Zn, была несколько выше, чем у растущих при нормальной концентрации металла.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Ответная реакция растений пшеницы на действие низкой температуры существенно изменялась в зависимости от концентрации Zn в корнеобитаемой среде. При этом наблюдаемые изменения интенсивности окислительных процессов и активности ключевых антиоксидантных ферментов в подземных и надземных органах проростков также различались.

Как известно, при избытке Zn во внешней среде у растений, не являющихся аккумуляторами (накопителями) тяжелых металлов, ионы металла в основном задерживаются в корнях (Титов и др., 2007). Вследствие этого их содержание в клетках корня сильно увеличивается, что в свою очередь приводит к развитию окислительного стресса (Ли и др., 2008; Wang et al., 2009; Li et al., 2013; Cuypers et al., 2016). Однако благодаря функционированию эффективных механизмов детоксикации металла, а также наличию общих механизмов устойчивости, в частности активизации компонентов АОС, растения были способны достаточно успешно адаптироваться к высоким концентрациям Zn (Broadley et al., 2007; Титов и др., 2014; Ricachenevsky et al., 2015). В наших опытах у проростков пшеницы в условиях избытка Zn в корнях первоначально наблюдалось заметное повышение содержания МДА, свидетельствующее об усилении интенсивности ПОЛ и развитии окислительного стресса. Но в дальнейшем при 22°С в клетках корня значительно увеличивалась активность СОД – ключевого фермента антиоксидантной защиты, который нейтрализует супероксид-радикал, преобразуя его в менее агрессивную АФК – перекись водорода, а также активность ПО, участвующей в разложении перекиси. Согласованная работа СОД и ПО, очевидно, способствовала восстановлению про- и антиоксидантного равновесия, о чем свидетельствует снижение интенсивности ПОЛ к концу опыта практически до ее уровня у контрольных растений. Отметим и то, что активизация ПО вносит свой вклад в ускорение процесса лигнификации клеточных стенок, что является одним из защитных механизмов, позволяющих растениям снизить поступление тяжелых металлов в клетки (Lux et al., 2011). Об отсутствии серьезных повреждений корневой системы свидетельствует и то, что в таких условиях рост и накопление биомассы корней продолжались, хотя и несколько медленнее, чем при нормальной концентрации Zn в среде.

Сведений о реакции корневой системы растений на низкотемпературное воздействие в литературе сравнительно немного. Тем не менее известно, что, например, у растений пшеницы (Rogozin et al., 2001) и табака (Попов и др., 2010) низкая закаливающая температура вызывает увеличение содержания МДА в клетках корня, т.е. усиление интенсивности ПОЛ. Предполагается, что это может быть связано с нарушением транспорта электронов в реакциях, протекающих на мембранах митохондрий, активизацией окислительных реакций в пероксисомах, ингибированием ферментов, участвующих в нейтрализации радикалов кислорода (del Rio et al., 2002; Mittler, 2002; John et al., 2016). В наших опытах в начальный период (1–3 сут) действия температуры 4°С содержание МДА в корнях пшеницы также увеличивалось, причем независимо от содержания Zn в корнеобитаемой среде. Однако спустя 7 сут в варианте опыта с оптимальным содержанием Zn количество продуктов ПОЛ снижалось, свидетельствуя об ослаблении окислительного стресса, тогда как в условиях избытка Zn оно продолжало возрастать.

Как следует из полученных нами данных, в корнях проростков, находящихся при оптимальной концентрации Zn во внешней среде, усиление интенсивности ПОЛ при низкой температуре происходит на фоне снижения активности СОД. Сходные данные были получены и другими авторами на растениях сои (Pozmyk et al., 2005) и пшеницы (Scebba et al., 1998). Снижение активности СОД в таких условиях могло быть следствием ингибирующего действия низкой температуры или связано с уменьшением содержания в клетках ее субстрата – супероксид-радикала, например, из-за замедления процесса дыхания (Гармаш, Головко, 2009). Некоторое же уменьшение содержания МДА, наблюдаемое через 7 сут действия холода, возможно, объясняется активизацией ПО, что ранее отмечали и другие авторы (Rogozin et al., 2001). О частичном восстановлении уровня метаболических процессов, нарушенного действием низкой температуры, свидетельствует и зафиксированное в этот период увеличение сухой биомассы корней.

При воздействии низкой температуры на растения, находящиеся в условиях избытка Zn в корнях, через 1 сут наблюдалось резкое снижение активности ПО. Возможно, это связано с высокой чувствительностью к холоду изоформ фермента, активизировавшихся под влиянием избытка Zn. Активность СОД при этом не менялась. Разнонаправленные изменения активности этих ферментов могли стать причиной накопления в клетках избыточных количеств перекиси водорода и усиления интенсивности ПОЛ. В дальнейшем (спустя 7 сут), несмотря на то что активность СОД и ПО в этом варианте опыта несколько увеличивалась, интенсивность окислительных процессов в клетках продолжала возрастать. По-видимому, относительно небольшое увеличение активности СОД и ПО (в 1.2 раза по отношению к исходной), наблюдаемое при одновременном действии избытка Zn и низкой температуры, было недостаточным для предотвращения развития окислительного стресса. Дополнительный негативный эффект в таких условиях могло вызывать нарушение баланса и других компонентов АОС, в частности основных низкомолекулярных антиоксидантов – аскорбата и глутатиона, как показано, например, в опытах с растениями Arabidopsis thaliana (Remans et al., 2012). Важно, что в наших опытах в таких условиях у растений пшеницы полностью прекращался рост корневой системы и даже наблюдалось некоторое уменьшение ее биомассы по сравнению с исходной, что может быть связано с частичным отмиранием клеток корня. Все это свидетельствует о том, что совместное действие изученных стресс-факторов оказывает более сильное отрицательное влияние на корневую систему растений пшеницы по сравнению с их раздельным действием.

В листьях, как правило, накапливается значительно меньше ионов металла, чем в корнях, однако при высоких концентрациях Zn в корнеобитаемой среде в клетках листа также усиливается процесс образования радикалов кислорода. В наших опытах при избытке Zn в корнеобитаемой среде его содержание в листьях было примерно в 2 раза ниже, чем в корнях. При этом на протяжении всего опыта в клетках листа наблюдалось увеличение содержания МДА, несмотря на повышение активности СОД и ПО. Обнаруженная интенсификация ПОЛ могла быть связана со снижением пула низкомолекулярных антиоксидантов, в частности каротиноидов и восстановленного глутатиона, который, как известно, расходуется на образование комплексов с ионами металла и синтез фитохелатинов (Barrameda-Medina et al., 2014). Нельзя также исключать, что увеличение содержания продуктов ПОЛ в таких условиях могло быть следствием активизации липоксигеназы – фермента, катализирующего ПОЛ, в условиях стресса, вызванного действием тяжелых металлов (Remans et al., 2012; Liptáková et al., 2013; Barrameda-Medina et al., 2014).

Действие низкой положительной температуры независимо от содержания Zn в среде первоначально вызывало у растений торможение роста побегов, что было связано с происходящими структурно-функциональными изменениями, необходимыми для повышения холодоустойчивости растений (Титов и др., 2006). Однако в оптимальных условиях минерального питания уже через 3 сут действия температуры 4°С накопление биомассы побегов возобновлялось, свидетельствуя об успешной адаптации растений. При избытке же Zn ингибирующий эффект низкой температуры на показатели роста сохранялся до конца опыта.

Известно, что, подобно другим стрессорам, низкие температуры могут вызывать в клетках листа растений окислительный стресс. Вместе с тем было показано, что холодостойкие виды способны препятствовать повышению интенсивности ПОЛ при охлаждении (Синькевич и др., 2011, 2015; Колупаев и др., 2015). Это подтверждают и наши опыты. При воздействии температуры 4°С на растения пшеницы, находившиеся в условиях сбалансированного минерального питания, содержание МДА в листьях не менялось. При этом первоначально в клетках не наблюдалось увеличения активности СОД и ПО и только спустя 7 сут была отмечена их активизация. По-видимому, на начальных этапах холодовой адаптации окислительно-восстановительный баланс в клетках листа поддерживается за счет низкомолекулярных соединений, обладающих антиоксидантными свойствами, таких как аскорбиновая кислота, восстановленный глутатион. Значительное увеличение содержания в клетках аскорбиновой кислоты и глутатиона при действии низкой температуры наблюдали у пшеницы и ячменя (Радюк и др., 2009; Dai et al., 2009; Репкина и др., 2014). Так, у ячменя уже в 1-е сут действия температуры 2°С содержание аскорбиновой кислоты и глутатиона в листьях увеличивалось в 3 и 1.3 раза соответственно (Радюк и др., 2009). У пшеницы в ответ на низкотемпературное воздействие значительно увеличивается содержание в клетках листа сахаров и пролина, которые также выполняют антиоксидантные функции (Климов и др., 2010; Keunen et al., 2013; John et al., 2016). Активизация же СОД и ПО при длительном (7 сут) воздействии холода, возможно, связана с необходимостью превентивной защиты клеток от окислительных повреждений в случае дальнейшего снижения температуры.

При низкой температуре в листьях растений, испытывающих действие избытка Zn, интенсивность ПОЛ увеличивалась, указывая на активизацию окислительных процессов. В это же время, как было обнаружено нами ранее, в таких условиях у пшеницы резко тормозилась скорость фотосинтеза (Казнина и др., 2019). Однако активность СОД и ПО в условиях избытка Zn при низкой температуре была примерно такой же, как при оптимальном уровне Zn или даже несколько превышала ее. Следовательно, присутствие в клетках большого количества ионов металла не оказывало негативного влияния на динамику СОД и ПО в условиях гипотермии. Повышение же содержания МДА в условиях избытка Zn при 4°С, возможно, объясняется снижением активности других ферментов, участвующих в антиоксидантной защите, таких как каталаза и аскорбатпероксидаза (Panda et al., 2003; Рахманкулова и др., 2008; Wang et al., 2009), или уменьшением содержания восстановленного глутатиона и аскорбата вследствие ингибирования ферментов, участвующих в их восстановлении, что наблюдали при избытке Zn (Di Baccio et al., 2005; Wang et al., 2009; Remans et al., 2012).

В целом проведенные исследования показали, что при оптимальном содержании Zn в корнеобитаемой среде действие низкой положительной температуры не вызывает усиления окислительных процессов в листьях пшеницы, а в корнях повышение интенсивности ПОЛ носит временный (транзиторный) характер. Увеличение же активности СОД и ПО в корнях и листьях, наблюдаемое через 7 сут низкотемпературного воздействия, свидетельствует об активизации антиоксидантной защиты, что необходимо для успешной адаптации растений к холоду. В отличие от этого относительно низкая активность антиоксидантных ферментов и нарушение согласованности в их работе, наблюдаемые при низкой температуре в условиях избытка Zn, а также возможное снижение в таких условиях количества неферментативных компонентов антиоксидантной системы не позволяют предотвратить развитие окислительного стресса, что неизбежно ведет к снижению способности растений к низкотемпературной адаптации.

Работа выполнена при финансовом обеспечении из средств федерального бюджета на выполнение государственного задания КарНЦ РАН № 0221-2017-0051 и № 0218-2019-0074.