1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Известия РАН. Серия биологическая
  4. № 3, 2021

Известия РАН. Серия биологическая, 2021, № 3, стр. 249-255

Взаимодействие молочно-кислых бактерий при разных условиях совместного выращивания

А. Исраелян 1, *, К. Карапетян 2, Л. Арстамян 1, Л. Алексанян 1

1 Арцахский научный центр государственная некоммерческая организация
Степанакерт, Арцах, ул. Тигран Меци, 26, Нагорно-Карабахская Республика

2 Научно-производственный центр “Армбиотехнология” НАН Республики Армения
0056 Ереван, ул. Гюрджяна, 14, Армения

* E-mail: arevik_israelyan@mail.ru

Поступила в редакцию 06.03.2019
После доработки 11.06.2020
Принята к публикации 02.12.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

С целью получения заквасок для новых кисло-молочных продуктов исследовано влияние условий выращивания (температуры, соотношения количества вносимых молочно-кислых бактерий (МКБ)) на взаимодействие МКБ c пробиотическими свойствами. Показано проявление органолептических, антимикробных свойств при использовании композиций МКБ различной родовой и видовой принадлежности.

Пищевые привычки людей, живущих в разных странах, в разных регионах внутри страны, и даже разных религиозных групп развивались в течение тысяч лет и значительно различаются. Кисло-молочные продукты (КМП) питания уже давно ассоциируются с различными демографическими группами и являются неотъемлемой частью их этноса (Carr et al., 2002; Avrelija, Walter, 2010).

Один из самых распространенных методов сохранения биоразнообразия микроорганизмов и использования их органолептических и питательных свойств – изучение микрофлоры национальных традиционных КМП и создание на основе выделенных бактерий (единичных или ассоциированных) новых продуктов (Tajabadi et al., 2009). Многие традиционные КМП производились и производятся в Азии, Африке, на Ближнем Востоке, в Северной и Восточной Европе и в настоящее время используются многими учеными для исследования их микрофлоры и создания новых КМП для функционального питания. Показано, что микрофлора ферментированных продуктов варьирует от одного региона к другому, зависит от климатических условий области (Bettache, Mebrouk, 2004; Мennane et al., 2007; Dalgalarrondo et al., 2009; Tajabadi et al., 2009).

Достаточно хорошо изучена микрофлора Кавказского национального КМП мацуна (Matsoon, Мазунинская, мацони, мацун). Мацун надо рассматривать как аналог йогурта, он готовится путем ферментации коровьего, овечьего, козьего, буйволового молока или их смеси молочно-кислыми бактериями (МКБ). Показано, что микробная композиция мацуна различается в различных кавказских областях, зависит как от региона, так и от типа молока, но очень стабильна и характерна для каждого региона, что позволяет сохранять и передавать уникальность региональной микробиоты мацуна (Afrikian, 2012; Bokulich et al., 2015). Исследования по идентификации микрофлоры мацуна в различных регионах Кавказа, проведенные в последние годы, показали, что виды Lactococcus и Enterococcus встречаются во многих образцах мацуна, приготовленного из молока разных домашних животных (Bokulich et al., 2015).

В отличие от болгарского кислого молока, содержащего Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus и streptococcus, микрофлора мацуна, полученного путем ферментации коровьего молока, включает в себя различные виды микроорганизмов и их симбиотические ассоциации. Учеными Грузии выделены и описаны следующие МКБ мацуна: Lactobacillus delbrueckii – подвид lactis, L. acidophillus, L. casei, Streptococcus thermophillus, Lactococcus lactis – подвид lactis, L. lactis – подвид diacetylactis, L. lactis – подвид cremoris, Enterococcus durans (Merabishvili, Chanishvili, 2001). Штамм L. bulgaricus не был обнаружен. В образцах мацуна из различных регионов Армении встречаются и другие виды бактерии, в том числе Lactobacillus helveticus, L. plantarum, L. paracasei и Leuconostoc lactis (Karapetyan, 2011; Tkhruni et al., 2013), а также Geotrichum candidum, Saccharomyces, Candida и другие виды дрожжей (Afrikian, 2012).

Исследование пробиотических свойств эндемичных штаммов МКБ, выделенных из КМП из различных регионов Арцаха, показало, что МКБ представлены в основном различными видами рода Enterococcus (Israyelyan et al., 2016; Karapetyan et al., 2017). В последние годы научный интерес представляет создание композиций из нескольких штаммов МКБ, имеющих ряд полезных свойств, для получения новых КМП для функционального питания.

Цель работы – подбор композиций с использованием исследованных эндемичных штаммов МКБ с некоторыми пробиотическими свойствами для создания новых КМП.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования и условия роста. Объектами исследования были культуры МКБ, выделеные из разных образцов национального КМП мацуна из натуральных хозяйств различных регионов Армении и Арцаха и исследованные нами в течение 2005–2017 г. Серийно разведенные образцы мацуна наносили на чашки Петри с селективной питательной средой De Man, Rogosa and Sharpe (MRS-агар) для лактобактерий или гидролизованным молочным агаром (1.2%) и культивировали при 37°C. Были отобраны морфологически идентичные единичные колонии каждого штамма МКБ и получены чистые культуры, которые были охарактеризованы в соответствии с описанными методами (Holt et al., 1994; Roissart, Luquet, 1994). Чистые культуры МКБ хранились в замороженном виде при –20°С в MRS – бульоне или в молоке с содержанием 40% глицерина. Для выращивания МКБ в качестве инокулята использовали 6–8 ч культуры, которые вносились в питательные среды (10% объема среды). Культуры выращивали в термостате при 37 и 42°С.

Титр клеток (число жизнеспособных клеток МКБ) определяли методом высева на питательные среды (чашечный метод Коха). Ряд последующих 10-кратных разведений отобранных проб готовились в пробирках с физиологическим раствором. В чашки Петри с соответствующей агаризованной питательной средой вносили по 0.1 мл последнего и предпоследнего разведений. Засеянные чашки Петри (на каждое разведение по 2–3 чашки) инкубировали в термостате при 37°С. Число бактерий рассчитывали через 2–3 сут. Подсчитывали число формирующихся колоний, принимая во внимание, что каждая колония – потомство одной жизнеспособной клетки (Биргер, 1982).

Так как колонии разных штаммов МКБ при выращивании на агаризованных питательных средах различаются по цвету, размерам, консистенции, то после их совместного выращивания число клеток бактерий каждого вида также определяли чашечным методом Коха путем подсчета числа колоний каждого штамма в отдельности. Для культивирования штаммов МКБ применяли следующие питательные среды:

№ 1. MRS – бульон (Merck, Германия; ISO, Италия; HiMedia, Индия);

№ 2. Молоко (обезжиренное, 1.5%-ная жирность);

№ 3. Питательную среду на основе подтворожной сыворотки с добавлением солей (%, ±0.2): (NH4)2SO4-0.8, KH2PO4-0.1, MgSO4-0.2, дрожжевой экстракт-0.3, пептон-0.3, MnSO4-0.05, CH3COONa ⋅ · 3H2O-0.2, pH 6.5 ± 0.2 (Tkhruni et al., 2015).

Кислотность культуральной жидкости при раздельном и совместном выращивании штаммов МКБ выражали в градусах Тернера (° Т). Градус Тернера показывает число миллилитров 0.1 н. раствора гидроксида натрия (или гидроксида калия), необходимое для нейтрализации 100 мл или 100 г продукта.

Для идентификации штаммов МКБ был применен метод секвенирования генов 16 S rRNA с использованием универсальных праймеров для Enterobacteriaceae и маркера Genladder (100 bp, plus1.5 kb, 50 µg, GENAXXON, bioscience) (Weisburg et al., 1991). Штаммы были депонированы в отделении Центра депонирования микробов (ЦДМ) при научно-производственном центре (НПЦ) “Армбиотехнология» НАН Республики Армения.

Тест культуры. Для определения антимикробных свойств МКБ были использованы условно-патогенные бактерии Salmonella tуphimurium G38 и Bacillus subtilis G17-89, находящиеся в коллекции микрооранизмов НПЦ “Армбиотехнология” НАН РА.

Определение антибактериальной активности. Антимикробную активность бесклеточной культуральной жидкости (КЖ) определяли на тест-культурах с использованием методов диффузии в агар и серийных разведений (Биргер, 1990). На поверхность газона с тест-культурой (2.2 × 106 КОЕ/мл) наносили 20 мкл исследуемого образца. Антимикробную активность оценивали измерением размеров зон ингибирования роста тест-культуры (диаметр, мм) после 24 ч инкубирования в термостате при 30°С. Активность выражали в активных единицах (АЕ/мл) (Parente et al., 1995). Антимикробную активность при совместном выращивании определяли после 48 ч выращивания МКБ.

Подбор композиций МКБ для создания новых КМП. Были использованы эндемичные штаммы МКБ с некоторыми пробиотическими свойствами (Shenderov, 2013) разной родовой и видовой принадлежности, а также стандартные методы получения КМП согласно ГОСТ РФ (ГОСТ РФ 55577, 2013). Органолептическая оценка была проведена согласно ГОСТ Армении 4959.

Статистический анализ. Приведены данные по трем повторностям каждого эксперимента. После сбора данных был проведен статистический анализ с использованием компьютерной программы Microsoft Word 10, Exele 2010. Полученные данные действительны для p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что при совместном выращивании МКБ возможны синергизм или антогонизм между культивируемыми штаммами. Были использованы штаммы МКБ, обладающие некоторыми пробиотическими свойствами (антиоксидантной и антимикробной активностью, высокой степенью адгезии на клетки эпителия человека, устойчивостью к ферментам и различным значениям рН среды, различным концентрациям желчи) (Karapetyan, 2011; Tkhruni et al., 2013; Israyelyan et al., 2016). Результаты, полученные после совместного выращивания некоторых штаммов с пробиотическими свойствами, выделенных из мацуна на основе коровьего молока, приведены в T. 1 (37°С, 48 ч, среда на основе подтворожной сыворотки).

Таблица 1.

Антимикробная активность культуральной жидкости при раздельном и совместном выращивании штаммов молочно-кислых бактерий

Композиции молочно-кислых бактерий Число клеток,
КОЕ/мл 		Кислотность, °T Антимикробная активность
культуральной жидкости (рН 4.5), АЕ/мл
Bacillus subtilis
G17-89 		Salmonella tуphimurium
G 38
L. rhamnosus 2012 1.0 × 1010 380 900 400
L. acidophilus 1991 1.4 × 109 320 1600 500
E. faecium 64 4.0 × 109 140 300 300
S. thermophilus 103 1.6 × 109 120 300 300
S. lactis 87 5.7 × 109 150 700 500
L. paracasei 236 4.0 × 109 340 700 1000
L. rhamnosus 2012 + L. acidophilus 1991 5.0 × 107 450 1300 800
4.6 × 108
L. rhamnosus 2012 + L. paracasei 236 1.0 × 109 440 900 900
1.1 × 109
L. rhamnosus 2012 + E. faecium 64 2.5 × 109 420 1000 1200
1.8 × 109
L. rhamnosus 2012 + S. thermophilus 103 0.9 × 109 410 1200 900
8.0 × 107
L. paracasei 236 + S. thermophilus 103 4.4 × 109 320 1000 1000
4.0 × 107
L. paracasei 236 + E. faecium 64 4.6 × 109 340 700 1100
5.6 × 108
E. faecium 64 + S. thermophilus 103 8.7 × 107 180 400 400
2.4 × 109
S. thermophillus 103 + S. lactis 87 2.6 × 109 180 1000 1000
1.9 × 109

Примечание. °T – кислотность, выраженная в градусах Тернера; для табл. 1–4.

При совместном выращивании антогонизм роста в композициях наблюдается между штаммами L. rhamnosus 2012 + S. thermophilus 103, E. faecium 64 + S. thermophilus 103, L. paracasei 236 + S. thermophilus 103 и L. rhamnosus 2012 + L. acidophilus 1991, а синергизм роста – в комбинации между штаммами L. rhamnosus 2012 + L. paracasei 236, L. rhamnosus 2012 + E. faecium 64 и S. thermophilus 103 + + S. lactis 87. Антимикробные активности разных штаммов при раздельном выращивании различаются. Увеличение антимикробной активности отмечено при комбинации использования штаммов L. rhamnosus 2012 + E. faecium 64, L. rhamnosus 2012 + L. paracasei 236, L. rhamnosus 2012 + E. faecium 64, L. paracasei 236 + E. faecium 64 и L. rhamnosus 2012 + L. acidophilus 1991 и S. thermophilus 103 + + S. lactis 87.

Как видно из приведенных данных, при совместном выращивании наблюдаемые различия во взаимодействии между штаммами, антимикробная активность не связаны с родовой и видовой принадлежностью изучаемых штаммов. Исследование влияния разных параметров выращивания (температуры, соотношения количеств вносимых культур) на проявление органолептических показателей при совместном выращивании в молоке показано на примере двух штаммов S. thermophillus 103 + S. lactis 87, выделенных из мацуна коровьего молока и обладающих анимикробной активностью. Отбор был основан также на том, что закваски каждого штамма в отдельности имели сладковатый вкус, приятный запах, высокую скорость сквашивания (T. 2).

Таблица 2.

Влияние температуры выращивания на вкусовые качества кисло-молочного продукта при выращивании композиций из двух штаммов

Композиция
штаммов
               молочно-кислых
бактерий 		Соотношение
молочно-кислых
бактерий , % 		Температура выращивания, °C
30 37 42
вкус, консистенция °T вкус, консистенция °T вкус, консистенция °T
S. thermophillus 103 + S. lactis 87 50 Горечь,
плотная 		40 Вкусный,
плотная 		55 Вкусный,
плотная 		55
50
S. thermophillus 103 + S. lactis 87 60 То же 40 То же 50 То же 55
40
S. thermophillus 103 + S. lactis 87 40 Горечь, слабая 60 Вкусный, рыхлая 60 Вкусный, рыхлая 65
60
S. thermophillus 103 + S. lactis 87 70 Горечь,
плотная 		55 Невкусный,
плотная 		55 Горечь,
плотная 		55
30
S. thermophillus 103 + S. lactis 87 30 Горечь,
слабая 		40 Невкусный, слабая 40 Горечь,
слабая 		45
70

Как видно из приведенных данных, при использовании композиции штаммов S. thermophillus 103 + S. lactis 87 в соотношениях 50 : 50 и 60 : 40 при температуре культивирования 37°С вкусовые качества КМП и текстура не отличаются от показателей культивирования при 42°С, а при культивирования при 30°С вкусовые качества КМП неприятные. Образование сгустка наблюдалось после 5–6 ч выращивания. Выращивание при повышенной температуре влияет на вкус полученного продукта. Полученные данные показывают, что характеристика образуемого сгустка также зависит от соотношения МКБ в композиции штаммов. При выращивании композиции из трех штаммов L. acidophillus 1991 + S. thermophillus 103 + S. lactis 87, при соотношении штаммов 40 : 30 : 30 вкусовые качества КМП оказались положительными при температуре культивировании 42°С. Вкусовые качества КМП и текстура отличаются от показателей культивирования при 30 и 37°С (T. 3).

Таблица 3.

Влияние температуры выращивания на вкусовые качества кисло-молочного продукта при выращивании композиций из трех штаммов

Композиция
штаммов 		Соотношение
молочно-кислых
бактерий , % 		Температура выращивания, °C
30 37 42
вкус, консистенция °T вкус, консистенция °T вкус, консистенция °T
L. acidophillus 1991 +
+ S. thermophillus 103 + + S. lactis 87 		40 Горечь,
плотная 		50 Сладкий,
плотная 		55 Вкусный,
плотная 		55
30
30
L. acidophillus 1991 +
+ S. thermophillus 103 +
+ E. durans M 44 		40 То же 60 Горечь,
плотная 		60 То же 50
20
20
S. thermophillus 103 +
+ S. lactis 87+
+ E. durans M 42 		30 Не вкусный,
слабая 		60 Кислый,
рыхлая 		65 Не вкусный, рыхлая 45
30
30
Таблица 4.

Совместное выращивание пробиотических штаммов различной видовой принадлежности (молоко 1.5%, 42°C)

Источник выделения
молочно-кислых
бактерий (молокo) 		Время сквашивания,
ч 		Кислотность,
°T 		Число клеток,
КОЕ/мл 		Оценка органолептических показателей,
бал
E. durans P 13 (корова) +
+ L. helveticus G5' (буйволица) 		5.0 130 3.0 × 108
4.0 × 108		 29
E. durans P 13 (корова) +
+ E. faecium KA 3 (коза) 		5.0 110 4.0 × 109
6.0 × 109		 26
E. durans P 13 (корова) +
+ LAB sp. KE 1 (ослица) 		6.0 125 3.5 × 108
3.5 × 108		 27
E. durans P 13 (корова) +
+ E. faecium KV 15-1 (овца) 		6.0 120 2.0 × 108
1.2 × 108		 25

На проявление органолептических свойств влияют температура выращивания, соотношение в композиции используемых МКБ разной родовой и видовой принадлежности.

Ранее нами было показано, что бактерии, выделенные из молока ослиц, по своим пробиотическим свойствам существенно отличаются от МКБ, выделенных из молока остальных домашних животных (Israyelyan, 2018). В Т. 4 приведены данные по совместному выращиванию штаммов различной родовой и видовой принадлежности, выделенных из мацуна на основе молока разных домашних животных. Полученные результаты показали, что в исследуемых вариантах композиций штаммов не было антагонизма роста. Кислотность и вкусовые характеристики E. durans P 13 и L. helveticus KG5' соответствовали ГОСТ РА. Проведенные опытно-производственные испытания позволили отработать технологию производства КМП на основе этих штаммов и получить РА ТУ 90025478.01.96-2017 г.

Таким образом, полученные результаты по совместному выращиванию штаммов МКБ, обладающими некоторыми пробиотическими свойствами различной родовой и видовой принадлежности, показали возможность использования штаммов, выделенных из мацуна на основе молока разных домашних животных (овец, буйволиц, коз, ослиц) для создания новых КМП функционального питания. Антагонизм роста и антимикробная активность при совместном выращивании зависят от композиций используемых штаммов и условий культивирования (температура и соотношение штаммов).

Список литературы

  1. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследований. М.: Изд-во 1982. С. 462.

  2. Биргер Р. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследований. М.: Изд-во 1990. С. 464.

  3. ГОСТ РФ 55577-2013. Продукты пищевые функциональные. Информация об отличительных признаках и эффективности. 06 сентября 2013 г. N 852-ст.

  4. Afrikian E. Studies of lactic-acid bacteria in Armenia with emphasis on radio protective properties // J. Environ. 2012. V. 32. P. 256–268.

  5. Avrelija C., Walter C. The role of functional foods, Nutraceuticals, and food supplements in intestinal health // Nutrients J. 2010. V. 2. P. 611–625.

  6. Bettache G., Mebrouk K. Characterization of lactic acid bacteria isolated from Algerian arid zone raw goats' milk // Afric. J. Biotechnol. 2004. V. 3. P. 339–342.

  7. Bokulich N., Amiranashvili L., Chitchyan K., Ghazanchyan N., Darbinyan K., Gagelidze N., Sadunishvili T., Goginyan V., Kvesitadze G., Torok T., Mills D. Microbial biogeography of the transnational fermented milk matsoni // Food Microbiol. 2015. P. 12–19.

  8. Carr F., Chill D., Maida N. The lactic acid bacteria: a literature survey // Critical Rev. Microbiol. 2002. V. 28. P. 281–370.

  9. Dalgalarrondo T.-M., Tolinacki M., Nikolic M., Lozo J., Begovic J., Gulahmadov S., Alekperovich Kuliev A., Chobert J., Haertlé T., Topisirovic L. Phenotypic and genotypic characterization of lactic acid bacteria isolated from Azerbaijani traditional dairy products // Afr. J. Biotechnol. 2009. V. 8. P. 2576–2588.

  10. Holt J.G., Krieg N.R. Sneath P.H.A., Staley J.T., Williams S.T. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology 9th Edn. Baltimore, MA: Williams and Wilkins, 1994.

  11. Israyelyan A. Comparative characterization of lactic acid bacteria isolated from donkey’s milk // Europ. J. Biomed. Pharmac. Sci. 2018. V. 5. Iss. 3. P. 65–69.

  12. Israyelyan A., Tkhruni N., Arstamyan L., Balabekyan Ts., Khachatryan T., Karapetyan K. Comparative characterization of endemic lactic acid bacteria isolated from several regions of Armenia and Nagorno Karabakh Republics // Biol. J. Armenia. 2016. P. 50–57.

  13. Karapetyan K.J. Comparative study of properties of some lactic acid bacteria and obtaining of antimicrobial preparations on their basis. PhD thesis, 2011.

  14. Karapetyan K., Tkhruni F., Israyelyan A., Yermolenko E., Verdyan A. Comparative characterization of endemic lactic acid bacteria of Enterococcus genus // Int. J. Sci. Technol. Res. 2017. V. 6(7). P. 357–361.

  15. Mennane Z., Faid M., La gzouli M., Ouhssine M., Ely M., Chioui A., Berny E. Ennouali M., Khedid K. Physico-chemical, microbial and sensory characterization of Moroccan Klila middle-east // J. Sci. Res. 2007. V. 2. P. 93–97.

  16. Merabishvili M., Chanishvili N. Identification of the lactic acid bacterial cultures isolated from the samples of the caucasian matsoni // Proc. Georg. Acad. Sci. 2001. V. 27. P. 91–95.

  17. Parente E., Brienza C., Moles M., Riccardi A. A comparison of methods for measurement of bactriocin activity // J. Microbiol. Meth. 1995. V. 22. P. 95–108.

  18. Roissart H., Luquet FM. Bactéries lactiques. Aspects fondamentaux et technologiques. Uriage, Lorica. 1994. 605 p.

  19. Shenderov B. Metabiotics: Novel idea or natural development of probiotic conception // J. Microbiol. Ecol. Health Desease. 2013. V. 24. P. 1–6.

  20. Tajabadi E., Hejaazi M., Jafari P. Selective screening of potential probiotic lactobacilli in traditional fermentative dairies // Quarterly J. Biol. Sci. 2009. V. 1. P. 41–47.

  21. Tkhruni F., Karapetyan K., Danova S., Dimova S., Karimpur F. Probiotic properties of endemic strains of lactic acid bacteria // J. Bio. Sci. Biotech. 2013. V. 2. P. 109–115.

  22. Weisburg W., Barns S., Pelletier D. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study // J. Bacteriol. 1991. V. 173. P. 697–703.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Известия РАН. Серия биологическая

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал