Известия РАН. Серия биологическая, 2021, № 3, стр. 263-269

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для исследования формы переднего отростка постгонитов взяты 24 вида злаковых мух рода Meromyza, входящих в пять кластеров из восьми известных (Сафонкин и др., 2016). Для анализа выбраны кластеры, включающие в себя более одного вида (жирным шрифтом выделены виды, близкие к предковому гаплотипу каждого кластера; в скобках указано число экземпляров) (Сафонкин и др., 2016):

I – кластер “saltatrix”: M. acuminata Fed. 1964 (10), M. nigrofasciata Hendel, 1938 (5), M. pallida Fed. 1964 (2), M. saltatrix L. 1761 (30), M. sibirica Fed. 1961 (6), M. stackelbergi Fed. 1967 (2), M. tshernovae Fed. 1971 (10);

II – кластер “pratorum”: M. brevifasciata Fed. 1974 (2), M. conifera Fed. 1971 (10), M. jacutica Fed. 1979 (2), M. ornata Wiedmann 1817 (2), M. pratorum Mg. 1830 (5);

III – кластер “variegata”: M. bohemica Fed. 1962 (2), M. femorata Macq. 1835 (5), M. laeta Mg., 1838 (3), M. mosquensis Fed. 1960 (5), M. rufa Fed. 1962 (2), M. variegata Mg. 1830 (5);

IV – кластер “zachvatkini”: M. palposa Fed. 1960 (2), M. triangulina Fed. 1960 (4), M. zachvatkini Fed. 1960 (5);

V – кластер “pluriseta”: M. nigriseta Fed. 1960 (10), M. nigriventris Macq. 1835 (5), M. pluriseta Pet. 1961 (5).

Первоначально выделенные кластеры “nigriseta” и “pluriseta” (Сафонкин и др., 2016) были объединены в один кластер из-за филогенетической близости составляющих их видов. Название кластера “laeta” из работы Сафонкина с соавт. (Сафонкин и др., 2016) изменено на “variegata” из-за большей предполагаемой близости вида M. variegata по комплексу внешних признаков к предковому гаплотипу (Safonkin et al., 2020).

Для изучения формы постгониты вычленяли из брюшка мухи и приклеивали на бумагу. С приготовленных препаратов на микроскопе VHX-1000 с объективом VH-Z100R/W (Keyence, Япония) при 1000-кратном увеличении были получены снимки внешних боковых сторон левого и правого постгонита каждой особи. По данным фотографиям была проведена геометрическая морфометрия с использованием пакета программ TPS (Rohlf, 2001a, b) и MorphoJ (Klingenberg, 2011). Для оцифровки формы в программе tpsDig2 были расставлены четыре реперные (landmarks) (A–D) и 16 промежуточных (semi-landmarks) (1–16) точек, отражающих контур переднего отростка постгонита (рис. 1). Во избежание ошибок при расстановке точек использованы усредненные значения по четырем повторностям.

Рис. 1.

Постгонит Meromyza tshernovae: схема расположения точек, отражающих контур переднего отростка постгонита. Точки A, B, C, D – реперные, 1–16 – промежуточные. A–B – линия прикрепления постгонита к гипандрию, B–(1–8)–C – верхний контур, D– (9–16)– C – нижний контур, А–D – задний контур.

Филогенетическое дерево построено в программе MrBayes 3.0 (Ronquist, Huelsenbeck, 2003) (рис. 2) на основе анализа участка СО1 мтДНК у 26 видов злаковых мух с использованием модели GTR (1set nst=6 rates=gamma и invgamma для 990 000 генераций при частоте записи параметров 100). Нуклеотидные последовательности зарегистрированы в GenBank (Триселева и др., 2014, Сафонкин и др., 2016, Safonkin et al., 2020). В качестве внешней группы взят вид Campiglossa pygmaea.

Рис. 2.

Дендрограмма кластеризации, построенная в программе MrBayes, и схема изменения формы переднего отростка постгонита злаковых мух рода Meromyza между молодыми видами и видом, близким к гипотетическому предку по результатам дискриминантного анализа. Кластеры I–V – “saltatrix”, “pratorum”, “variegata”, “zachvatkini”, “pluriseta” соответственно. Вид, наиболее близкий к гипотетическому предку кластера, выделен жирным шрифтом и отмечен на схеме линией с точками. Цифры в основании ветвей – апостериорные вероятности. Цифра за названием вида соответствует контуру данного вида на схеме. Шкала – генетическая дистанция между гаплотипами. Внешняя группа – Campiglossa pygmaea.

Для изучения преобразования формы переднего отростка постгонита у конкретного вида по сравнению с видом, наиболее близким к предковому гаплотипу кластера, применен метод дискриминантного анализа. Для переднего отростка постгонита в кластере “pratorum” (рис. 2, II) характерна несклеротизованная область по нижнему краю постгонита (более выраженная у видов, близких к предковым гаплотипам), поэтому в сравнительном анализе использована форма контура склеротизованной части нижнего края. Для адекватного сравнения изменения формы объектов контуры передних отростков постгонитов совмещали по линии прикрепления к гипандрию (рис. 1, А–В).

Для определения общих направлений изменения формы постгонитов филогенетическое дерево было помещено в пространство форм, полученное с помощью анализа главных компонент (PCA). Порог значимости компоненты – 10% общей вариации, приходящейся на нее.

Оценка уровня филогенетического сигнала была проведена с помощью вычисления суммы квадратов парсимонии Мэдиссона (squared-changed parsimony). Для этого были построены вспомогательные деревья с минимальной и максимальной длиной в программе Mesquite (Maddison, Maddison, 2009) и вычислены индексы для оценки уровней гомоплазии (Consistency index (CI)) и синапоморфии (Retention index (RI)). В работе применяли метод ресэмплинга – перестановочный тест (кросс-валидация – 10 000).

Дополнительная статистическая обработка материала (t-критерий Стьюдента) проведена с помощью программы Statistica 10.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Анализ главных компонент выявил 4 значимые компоненты, описывающие разнообразие формы переднего отростка постгонита. Результаты метода наложения филогенетического дерева на пространство главных компонент представлены на диаграмме (рис. 3а–3в). Первая компонента (42% общей изменчивости) отражает общее растяжение контура (ABCD на рис. 1 и 3а–3в). Вторая компонента (23%) показывает степень изгибания его нижнего края (отрезок DC на рис. 1 и 3а), третья компонента (13%) демонстрирует изменение длины заднего края (отрезок AD на рис. 1 и 3б), а четвертая компонента (10%) показывает степень изгибания верхнего края (отрезок BC на рис. 1 и 3в).

Рис. 3.

Диаграмма наложения филогенетического дерева мух рода Meromyza на пространство главных компонент. Ось абсцисс – общее растяжение контура (А–В–С–D). Ось ординат: а – изменение нижнего края (D–С), б – заднего края (A–D), в – верхнего края (В–С). Области изменения формы: 1 – I, 2 – II, 3 – II, подобласть 1, 4 – III, 5 – IV. Root – внешняя группа.

При вычислении суммы квадратов парсимонии Мэдиссона с помощью перестановочного теста была оценена вероятность устойчивости деревьев с минимальной длиной (TL = 0.307, p < 0.0001), максимальной длиной (TL = 0.832, p < 0.0001) и байесовского дерева (TL = 0.317, p < 0.0001). Уровень гомоплазии данных низок, поскольку значение индекса CI близко к единице (0.97), а уровень синапоморфии высок, так как индекс RI тоже близок к единице (0.98). Это указывает на проявление отчетливого филогенетического сигнала, содержащегося в морфометрических данных. Результат наложения филогении, полученной байесовским методом, на пространство форм, представленный на графике (рис. 3а–в), показывает, что кластеры отделены один от другого, чем также подтверждается наличие филогенетического сигнала.

По расположению видов на диаграмме филогенетического дерева в пространстве форм выделяется несколько областей изменения формы (рис. 3а–3в). Первая область включает в себя виды M. rufa, M. palposa, M. acuminata и M. sibirica, сходные по утончению, наклону и изгибу выступающей части переднего отростка по отношению к виду, близкому к предковому гаплотипу (рис. 2, I, III, V). Вторая область (рис. 3а–3в) также объединяет виды из разных кластеров, сходные по наклону выступающей части переднего отростка постгонита: M. tshernovae, M. nigrofasciata, M. stackelbergi и M. pallida (рис. 2, I), M. ornata (рис. 2, II), M. bohemica, M. femorata (рис. 2, III), M. triangulina (рис. 2, IV) и M. nigriventris (рис. 2, V). Вторую область можно подразделить на две подобласти, в одну из которых входят M. tshernovae, M. pallida и M. ornata по особой степени изгибания верхнего края (подобласть 1 на рис. 3). Третья область (рис. 3) включает в себя виды M. jacutica, M. conifera и M. brevifasciata, близкие один к другому по степени изгибания нижнего края и изменениям по заднему контуру постгонитов (рис. 2, II). Сюда же по аналогичному изменению формы включается M. nigriseta (рис. 2, V). В отдельную область (рис. 3) входят виды M. laeta, M. mosquensis, M. variegata, M. saltatrix, M. zachvatkini, M. pratorum и M. pluriseta, наиболее близкие к предковым гаплотипам кластеров.

По результатам дискриминантного анализа типы изменения формы постгонитов внутри кластеров можно объединить в три группы, две из которых полностью совпадают с выделенными областями на диаграмме филогенетического дерева в пространстве форм, полученного с помощью анализа PCA. В группе 1 (M. acuminata и M. sibirica, M. rufa, M. palposa) выступающая часть становится узкой и направленной вниз. В группе 2 (M. nigriventris, M. brevifasciata, M. jacutica, M. triangulina, M. nigrofasciata, M. stackelbergi, M. bohemica и M. femorata) конец выступающей части направлен вниз. В группе 3 (M. ornata, M. pallida и M. tshernovae) выступающая часть расширяется. Исключениями являются виды M. conifera и M. nigriseta, у которых конец выступающей части направлен вверх (рис. 2, II, V).

Исследование относительного вклада каждой из 20 точек контура (рис. 1) в общее изменение формы контура показало, что для видов группы 1 характерно смещение точки 5 от 2.1 до 8.54%, точки 12 от 0.5 до 0.9% и точки 13 от 0.7 до 5.1%. В результате происходит изгиб вниз выступающей части переднего отростка постгонита. Для видов группы 2 характерно смещение точки A от 0.06 до 0.46%. Положение данной точки влияет на ориентацию основной части постгонита относительно выступающей. Направления изменения формы постгонитов видов из групп 1 и 2, несмотря на сходную форму переднего отростка, достоверно различаются по относительному вкладу точки A (t = –2.28, df = 10, p < 0.48). У видов из группы 3 в основном отмечается уровень вклада точки C от 5.80 до 2.34%. У представителей данной группы положение этой точки определяет положение конца выступающей части переднего отростка постгонита.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Морфологическое соответствие отдельных элементов половых структур самцов и самок, как было показано на некоторых видах двукрылых (Yassin, Orgogozo, 2013), или функционально активных элементов полового аппарата у чешуекрылых (Lepidoptera, Noctuidae, Tortricidae) (Mikkola, 2008; Сафонкин, 2010, 2012) предполагает быстрое изменение половых структур самца и самки в процессе эволюции с последующим действием стабилизирующего отбора. Как было показано ранее, размеры ПОП внутри кластера достоверно различаются. Благодаря изменениям формы, приводящей к изменению размера, существует комплементарность половых структур самца и самки одного вида. Данная комплементарность во многом определяет защиту генома вида от проникновения чужеродных генов на начальном этапе спаривания. Можно предположить, что передние отростки постгонитов самца как функционально активные элементы, с одной стороны, способствуют успешной морфологической совместимости структур половых аппаратов самца и самки, с другой – препятствуют спариванию особей, имеющих морфологические различия по данным структурам.

Анализ PCA выявил “горячие зоны”, ответственные за разделение видов (нижние и верхние края основной и выступающей частей, а также линия прикрепления постгонита). Видовые различия по активным точкам контура переднего отростка постгонита совпадают с таковыми, выявленными методом канонических переменных (CVA) (Яцук, Сафонкин, 2018).

Наличие отчетливого филогенетического сигнала, связанного с формой постгонитов, значимость которого была определена методом квадратированной парсимонии Мэдиссона, свидетельствует о возможности прослеживания путей эволюции формы по полученным с помощью морфологического картирования графикам. Оценка взаимного расположения видов и кластеров относительно друг друга при наложении филогенетического дерева на пространство форм позволяет, как было показано на мухах семейства Dolichopodinae (Чурсина, Негробов, 2018), найти общие эволюционные закономерности. Поскольку виды злаковых мух различаются по близости к предковым гаплотипам (Сафонкин и др., 2016), сопоставление изменчивости формы постгонитов с результатами молекулярно-генетического анализа по локусу СО1 мтДНК в пространстве форм позволяет обсуждать эволюционные тенденции преобразования формы передних отростков постгонитов внутри кластеров.

Обобщая результаты анализов CVA (Яцук, Сафонкин, 2018), PCA и дискриминатного анализа, можно предположить, что три выявленных направления изменения формы передних отростков постгонитов – основные стратегии изменения формы в процессе эволюции репродуктивного аппарата злаковых мух рода Meromyza. Однотипная изменчивость формы постгонитов у видов из разных кластеров (например, M. palposa и M. acuminata; M. nigriventris и M. stackelbergi) может свидетельствовать о существовании направленного отбора по изменению постгонитов в определенных “горячих зонах”.

Таким образом, проведенный анализ главных компонент в сопоставлении с филогенией рода на основе локуса СО1 мтДНК и результатами сравнения формы переднего отростка постгонитов демонстрируют ограниченное число стратегий изменения таковой в процессе эволюции злаковых мух.

Исследование выполнено при финансовой поддержке программы Президиума РАН № 41 “Биоразнообразие природных систем и биологические ресурсы России”.