Известия РАН. Серия биологическая, 2023, № 1, стр. 43-51

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Использовали листья 10-дневной кукурузы (Zea mays L.) сорта Воронежская-76, выращенные гидропонно при десятичасовом световом дне и интенсивности света 25 Вт/м² в климатической камере (“LabTech”, Корея).

Группы растений без корневой системы инкубировали в растворе NaCI 24 ч. Концентрация солевого раствора хлорида натрия (NaCI) составляла 150 мМ. Контрольной группой являлись растения, помещенные в воду.

Первые образцы для исследования извлекали еще до начала инкубации (нулевой образец) из контрольной, и из опытной группы растений. Далее образцы отбирали из инкубационной среды через 1, 3, 6, 12 и 24 ч от начала эксперимента.

Получение митохондриальной и цитоплазматической форм осуществляли путем проведения дифференциального центрифугирования. Первоначально получали фракцию хлоропластов центрифугированием при 3000 g 8–10 мин. Митохондрии из цитозоля осаждали центрифугированием при 12 000 g 20 мин, добавляя 0.1%-ный ТВИН-60 (Селиванова и др., 2014). В качестве маркерных ферментов для контроля уровня загрязнения использовали сукцинатдегидрогеназу, алкогольдегидрогеназу, а также концентрацию хлорофилла.

Изоформы малик-энзимов идентифицировали в 7%-ном полиакриламидном геле (Mayer et al., 2015). Разделение исследуемых белков проводили в основной буферной системе (рН 8.3). Электрофорез белков осуществляли при температуре 2–4°С. Подавали постоянный электрический ток 1.5–2.5 мА на один карман пластинки геля (Гааль и др., 1982). Специфическое проявление малатдегидрогеназы осуществляли тетразолиевым методом. Для повышения специфичности метода и сведения до минимума возможности проявления оксидоредуцирующих малатдегидрогеназ гели проявляли при более низких значениях рН (рН 5.5 для НАД⁺-малик-энзима и 6.5 НАДФ⁺-малик-энзима). Гель инкубировали в темноте при 37°С в среде, содержащей 100 мМ Hepes-буфер; 2 мМ раствор малата натрия; 18 мг НАД⁺; 10 мг НСТ (предварительно растворенный в 0.5 мл этиленгликоля) и 0.6 мг ФМС.

Общую активность МЭ определяли в гомогенате по скорости окисления НАД(Ф)Н при 340 нм. Масса навески составляла 0.1 г листьев кукурузы. Среда спектрофотометрирования содержала 100 мМ Hepes-HCl, рН 6.5 для НАД⁺-малик-энзима и 7.0 для НАДФ⁺-малик-энзима; 1.5 мМ пируват, 0.15 мМ НАД(Ф)Н; 5 мМ MnCl₂. Соотношение навески к среде спектрофотометрирования при гомогенизации составляло 1 : 10. Ферментативной единицей активности фермента считали количество энзима, которое превращало (обратная реакция) или образовывало (прямая реакция) 1 мкмоль НАД(Ф)Н за 1 мин при 25°С.

РНК из растений выделяли методом фенол-хлороформной экстракции (Chomczynski et al., 1987).

Обратную транскрипцию мРНК проводили с использованием обратной транскриптазы M-MuLV (“Евроген”, Россия). Подбор праймеров осуществляли на основе нуклеотидных последовательностей из GenBank, с помощью программы Primer-BLAST (табл. 1). Полимеразную цепную реакцию в реальном времени проводили на приборе LightCycler96 (“Roche”, Швеция) с красителем SybrGreen I (“Евроген”). Количество матрицы контролировали с помощью параллельной амплификации фактора элонгации ef-1α (Nicot et al., 2005). В качестве отрицательного контроля использовали суммарную РНК без этапа обратной транскрипции. Относительный уровень экспрессии исследуемых генов определяли с применением 2^–ΔΔCt-метода (Livak, Schmittgen, 2001).

ДНК выделяли с помощью набора ПРОБА – ГС (“ДНК-Tехнология”, Россия) согласно рекомендациям производителя. Для исследования изменения статуса метилирования CpG-динуклеотидов промоторов генов nad-me1, nad-me2, nadf-me, кодирующих декарбоксилирующие малатдегидрогеназы, была проведена модификация образцов ДНК (Hsieh, 1999).

Анализ промоторов исследуемых генов на наличие CpG-островков и подбор праймеров для МС-ПЦР осуществляли с помощью программы MethPrimer. Последовательности праймеров для проведения МС-ПЦР представлены в табл. 2.

Опыты проводили в 3–4-кратной повторности, аналитические определения для каждой пробы осуществляли в трех повторностях. Предварительная оценка характера распределения проводилась по асимметрии и эксцессу (Excel, Microsoft Office). Полученные значения позволили оценить характер распределения как нормальный. Критерий Стьюдента использовался с применением поправки на множественные сравнения (поправка Бонферрони) (Лакин, 1990). Дополнительно применяли однофакторный дисперсионный анализ ANOVA, который показал, что исследуемый в работе фактор действительно оказывал влияние (влияние фактора достоверно при p < 0.05).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В листьях кукурузы активность малик-энзимов обнаружена преимущественно в митохондриях для НАД⁺-МЭ и в хлоропластах для НАДФ⁺-зависимой декарбоксилирующей малатдегидрогеназы. С помощью дифференциального центрифугирования были получены исследуемые фракции митохондрий и хлоропластов и определена их степень перекрестного загрязнения по маркерным ферментам, которая составляла не более 3–8%. Анализ полученных данных свидетельствует о преимущественной локализации изучаемых энзимов в митохондриях (НАД-малик-энзим, 88%) и в хлоропластах (НАДФ-малик-энзим, 91%) (табл. 3).

Исследование изоферментного состава декарбоксилирующих малатдегидрогеназ было проведено в полиакриламидном геле. НАД⁺-зависимый малик-энзим в листьях кукурузы был представлен двумя изоферментами: первая изоформа характеризуется относительной электрофоретической подвижностью 0.44, а вторая – 0.49. Для НАДФ⁺-малик-энзима была обнаружена одна форма энзима с R_f = 0.1 (рис. 1, 2). Следует обратить внимание, что изоферментный состав декарбоксилирующих малатдегидрогеназ в листьях кукурузы являлся постоянным и не менялся в стрессовых условиях, вызванных засолением.

Рис. 1.

Электрофореграмма НАД⁺-МЭ из митохондриальной фракции листьев кукурузы в нормальных условиях (а) и в условиях солевого стресса (б) F – линия фронта, P1 и P2 – искомые белки.

Рис. 2.

Электрофоретическая подвижность НАДФ⁺-МЭ из хлоропластов листьев кукурузы в нормальных условиях (а) и в условиях солевого стресса (б). F – линия фронта, P – искомый белок.

В условиях засоления активность НАД⁺-МЭ в кукурузе снижалась в течение первого часа, но затем возрастала и достигала максимального значения к 12 ч (рис. 3). Повышение активности изучаемого малик-энзима может указывать на его важное значение в перестройке клеточного метаболизма, обусловленного интенсификацией окислительных реакций в митохондриях (Davies, 1979).

Рис. 3.

Общая активность НАД⁺-МЭ в листьях кукурузы при действии солевого стресса.

Ранее в наших работах была показана роль ключевых ферментов цикла трикарбоновых кислот в осуществлении адаптивной реакции клеточного метаболизма к стрессовым условиям и, в частности, к засолению. Так, цитратсинтаза, аконитатгидратаза и сукцинатдегидрогеназа резко увеличивали свою активность, что обеспечивало интенсификацию работы центрального звена энергетического обмена (Eprintsev et al., 2017, 2018, 2020a). Следовательно, если учитывать митохондриальную локализацию НАД⁺-зависимого малик-энзима, то можно предполагать его участие в регуляции этого метаболического пути.

Динамика активности НАДФ⁺-зависимой декарбоксилирующей малатдегидрогеназы в условиях солевого стресса имела куполообразную форму с максимумом на 12 ч экспозиции. Активность фермента возрастала более, чем в 4.5 раза в растениях, находящихся в условиях солевого стресса. Следует отметить, что величина активности оставалась высокой длительный промежуток времени и снижалась только к 24 ч экспозиции (рис. 4).

Рис. 4.

Общая активность НАДФ⁺-МЭ в листьях кукурузы при действии солевого стресса.

Регуляция скорости ферментативной реакции в стрессовых условиях может осуществляться посредством конформационных трансформаций белковой молекулы, либо изменением экспрессии генов, кодирующих данные ферменты. Проведенный поиск нуклеотидных последовательностей в базе данных GenBank для декарбоксилирующих МДГ показал, что НАД⁺-зависимые малик-энзимы представлены двумя изоферментами, кодируемыми ядерными генами. Ген НАД⁺-МЭ 1 расположен в хромосоме 5 (Gene ID: 100501486), имеет длину 6148 нуклеотидов и содержит в своем составе 19 экзонов. Ген НАД⁺-МЭ 2 расположен в хромосоме 5 (Gene ID: 100191942), имеет длину 9231 нуклеотид и содержит в своем составе 18 экзонов (Eprintsev et al., 2020b).

НАДФ⁺-зависимый малик-энзим имеет в геноме кукурузы не менее 6 генов и 4 псевдогенов. Однако, для листьев кукурузы характерна только одна экспрессирующая хлоропластная форма гена, расположенного в хромосоме 3 (nadf-me, Gene ID: 542233), который имеет в составе 4925 нуклеотидов и содержит 20 экзонов.

Проведенный анализ уровня транскриптов генов, кодирующих исследуемые энзимы, выявил корреляцию с изменениями их ферментативной активности. Однако в варианте НАД⁺-зависимого малик-энзима наблюдалось, по-видимому, характерное разделение этапов адаптации. Наибольший вклад в общую активность декарбоксилирующих малатдегидрогеназ, вероятно, вносил изофермент малик-энзима 2, который кодируется геном nad-me2. Было установлено, что экспрессия этого гена, кодирующего данную изоформу, к 6 часу экспозиции увеличивается более, чем в 7 раз, в то время как увеличение экспрессии гена nad-me1 было выражено в меньшей степени. При этом возрастание составляло 1.7 раза по сравнению с контролем (рис. 5). Стоит также отметить, что для первой изоформы (МЭ1) было характерно увеличение экспрессии в первый час солевого стресса. Анализ полученных данных позволяет заключить, что изменение функционирования генов является одним из факторов регуляции активности НАД-малик-энзимов. Ранее было показано, что регуляция функционирования ключевых ферментов цикла Кребса в растениях, культивируемых в условиях солевого стресса, осуществлялась с помощью регуляции экспрессии генов исследуемых ферментов (Епринцев и др., 2021). Сообщается, что их активность коррелирует с так называемой индукцией “солевого дыхания”.

Рис. 5.

Экспрессия nad-mе1 в листьях кукурузы в условиях засоления и степень метилирования CpG-островков.

Исследование нуклеотидной последовательности промоторов генов, кодирующих малик-энзимы, показало, что в их составе содержатся CpG-островки. В составе промотора гена nad-me1 и nadf-me обнаружено по 2 островка размером 291 и 134 п.н. для НАД⁺-зависимого фермента и 142 и 430 для НАДФ⁺-зависимого. В промоторах генов nad-me2 обнаружен один островок размером 312 нуклеотидов.

Наличие CpG-островков в промоторной области может говорить о возможном механизме регуляции интенсивности экспрессии исследуемых генов посредством изменения степени метилирования цитозинов в промоторах (Ступак, Вафина, 2021). Анализ полученных данных свидетельствует, что обнаружена обратная корреляция между экспрессией гена nad-me2 и величиной метильного статуса цитозина CpG-островков промотора (рис. 6). Так, при повышении уровня относительных транскриптов с 3 по 12 ч экспозиции кукурузы в условиях солевого стресса степень метилирования промотора снизилась до 25%, что, по-нашему мнению, служило механизмом активации экспрессии гена nad-me2. Такое увеличение активности nad-me2 приводило к интенсификации цикла трикарбоновых кислот, утилизирующего пируват через ацетил КоА (Igamberdiev, Bykova, 2018). Как видно из результатов, приведенных на рис. 5 и 6, для регуляции экспрессии генов nad-me1 и nadf-me (рис. 7) статус метилирования промоторов этих генов не имеет значения. По-видимому, уровень концентрации транскриптов исследуемых генов определяется другими механизмами регуляции.

Рис. 6.

Экспрессия nad-mе2 в листьях кукурузы в условиях засоления и степень метилирования CpG-островков.

Рис. 7.

Экспрессия nadf-mе в листьях кукурузы в условиях засоления и степень метилирования CpG-островков.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Увеличение активности малик-энзима 1 в условиях засоления, по-видимому, необходимо клеточному метаболизму растения для поддержания равновесного уровня рН в митохондриях. Увеличение активности НАДФ⁺-зависимой декарбоксилирующей МДГ в условиях солевого стресса позволяет этому энзиму участвовать в компенсации ингибирования цикла Кальвина и таким образом избегать большого количества восстанавливающих эквивалентов, поставляя их для НАДФ⁺-галактозо-1-дегидрогеназы и рибоза-1-дегидрогеназы. Кроме того, принимать участие в обеспечении снижения интенсивности путей аскорбата-глутатиона и ослаблять повышенный синтез осмолитов, в частности, пролина.

Таким образом, в условиях солевого стресса изоферменты малик-энзимов могут участвовать в осуществлении адаптивных реакций, в основном, за счет продуцирования малата (МЭ2) или окислительно-восстановительных эквивалентов (МЭ1). Интересно отметить, что экспрессия гена nad-me2, сильно возрастающая при засолении, регулируется эпигенетическим механизмом, т.е. наблюдается обратно-пропорциональная зависимость между интенсивностью экспрессии и величиной статуса метилирования CpG-островков промотора гена. Эпигенетический способ регуляции nad-me1 и nadf-me не обнаружен, что позволяет предположить другие молекулярные механизмы увеличения их экспрессии и активности соответствующих ферментов.

Cоблюдение этических стандартов. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов.

Конфликт интересов. Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.