Известия РАН. Серия биологическая, 2023, № 4, стр. 426-443

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Отбор проб и методы анализа факторов среды. Пробы воды объемом 0.5 л были отобраны в стерильные пластиковые бутыли на шести станциях 30.06.–05.07.2021 г. (табл. 1). На каждой станции пробы отбирали с шагом в один метр по глубине и объединяли в равных объемах в интегральную пробу. Поскольку глубины станций в основной части залива и на речном участке не превышали 10 м, то на более глубоких станциях в устье залива и в водохранилище пробы отбирали только до 10 м включительно. Одновременно портативными приборами были определены основные физико-химические показатели – температура, концентрация растворенного кислорода (оксиметр HI9143, Hanna Instruments, ЕС), pH, Eh (pH-Eh-метр Эксперт-001-4, Россия), электропроводность (кондуктометр CD-4302, Lutron, КНР). Сестон из интегральных проб был осажден последовательным фильтрованием – вначале без давления на нитроцеллюлозные фильтры с номинальным порогом пропускания 3–4 мкм, а затем под давлением 0.5–0.7 атм. – на фильтры с диаметром пор 0.2 мкм. Фильтры с осадками, полученными из одной пробы, были перенесены в одну общую стерильную пробирку, фиксированы 3 мл 80% (v/v) этанола и хранились при –20°С. Таким образом каждая проба сестона содержала все эукариоты, размер которых превышал 0.2 мкм.

Выделение ДНК и высокопроизводительное секвенирование было выполнено в компании Синтол (Москва, Россия). Пробы с консервантом центрифугировали; ДНК из полученных осадков выделяли с помощью набора реагентов “Сорб-ГМО-Б” (Синтол, Россия), в соответствии с инструкцией производителя. Качество и концентрации выделенной ДНК определяли по флуоресценции набором для определения малых количеств двухцепочечной ДНК в растворе ds DNA на приборе Quantus, Promega (США). Для амплификации вариабельного участка V4 гена 18S рРНК эукариот использовали праймеры Ek-NSF573 (5'-CGCGGTAATTCCAGCTCCA-3') и Ek-NSR951 (5'-TTGGYRAATGCTTTCGC-3') (Mangot et al., 2013) со стандартными адаптерами Illumina.

Индексирование ампликонов проводили с помощью набора реагентов Nextera XT Index Kit (Illumina), последующую очистку продуктов – на магнитных частицах AMPure XP Beads в соответствии с протоколом производителя. Концентрацию полученной ДНК определяли, как указано выше для общей выделенной ДНК, образцы объединяли в эквимолярных количествах. Парноконцевое секвенирование полученных библиотек ДНК проводили на секвенаторе MiSeq (Illumina) с использованием набора реагентов MiSeq Reagent Kit v2, 500 циклов. Полученные последовательности депонировали в NCBI Sequence Read Archive (биопроект PRJNA825541).

Биоинформатический анализ. Контроль качества полученных последовательностей Illumina был проведен с помощью программы FastQC (v. 0.11.7) (Wingett, Andrews, 2018). Для обработки полученных сырых данных использовали программу Usearch 11.0.67 (Edgar, 2013). Объединение парных последовательностей проводили, используя команду -ufastq_mergepairs с параметрами –fastq_minovlen 20 и -fastq_minmergelen 300, т.е. ограничивали длину области перекрытия – не менее 20 нуклеотидов (нк) и длину объединенной последовательности – не менее 300 нк, поскольку при номинальной длине целевого фрагмента около 380 нк некоторые эукариоты (например, инфузории класса Litostomatea) имеют в данной области крупные делеции. Таким образом, выделялись объединенные последовательности длиной 300–480 нк. Из полученной объединенной библиотеки командой -fastq_filter с опцией -maxee 1.0 были исключены последовательности с ожидаемым числом ошибок >1, после чего командой -fasx_unique была проведена дерепликация. Полученные уникальные последовательности были кластеризованы на уровне 97% с помощью команды -cluster_otus со стандартными параметрами. В процессе кластеризации были удалены “denovo” химерные последовательности. Дополнительную фильтрацию химерных последовательностей с помощью “бесхимерных баз” не проводили.

Таксономическую принадлежность полученных операционных таксономических единиц (ОТЕ) определяли с помощью элайнера SINA v. 1.2.11 (Pruesse et al., 2012) с использованием базы данных SILVA SSU v. 138.1 (Quast et al., 2013) с порогом сходства 0.8 и базы данных PR2 v. 4.14.0. Последняя классификация, после коррекции систематики в соответствии с последней сводкой Международного общества протистологов (Adl et al., 2019) была принята за основу. Для уточнения таксономического положения ОТЕ в случае разночтений дополнительно использовали алгоритм BLAST на платформе NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Поскольку целью работы являлся анализ сообщества протистов, последовательности, принадлежащие Metazoa (составлявшие около половины всех полученных последовательностей) и небольшое число последовательностей высших растений были исключены из дальнейшего рассмотрения. Чтобы исключить дублирование, были отброшены также последовательности нуклеоморфных 18S рРНК криптофитов.

В качестве доминирующих ОТЕ были выделены те, которые хотя бы в одной пробе составляли не менее 3% последовательностей, принадлежащих протистам.

Статистический анализ. Другие вычисления, включая статистический анализ результатов и их графическое представление, были выполнены в программах MS Office 2019, Past (v.3.04) и в программной среде R с использованием библиотек Vegan, Сaroline и др.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Район исследования и экологические условия в период отбора проб (табл. 1). Река Уса – правый приток р. Волги, впадает в Куйбышевское водохранилище, образуя Усинский залив, представляющий собой пресноводный эстуарий. В период исследования наибольший прогрев воды был зарегистрирован в устье залива и в Приплотинном плесе Куйбышевского водохранилища ниже впадения р. Усы, а минимальный – на речной станции (табл. 1). Прозрачность воды по диску Секки изменялась в широких пределах, ее наименьшая величина была зарегистрирована в средней части Усинского залива, а наибольшая – в Приплотинном плесе, выше впадения р. Усы (табл. 1). Вода на всех станциях была хорошо аэрирована (табл. 1), до глубины трех прозрачностей насыщение воды растворенным кислородом составляло 101 ± 14%, а глубже оно несколько снижалось (87 ± 12%). Содержание Хл а в интегральных пробах изменялось от 2.9 мкг/л (ст. 3) до 146.5 мкг/л (ст. 5). По данным микроскопического анализа, цианобактерии вносили основной вклад в численность (88–99.8%) и биомассу (36–98%) фитопланктона (Уманская и др., 2021), что позволяет рассматривать их в качестве экологического фактора для планктонных протистов.

Общая характеристика выделенных ОТЕ, альфа-разнообразие планктонных протистов. Полученная объединенная библиотека “сырых” последовательностей содержала 778 889 парных чтений. В результате биоинформатического анализа из них было выделено 1261 OTЕ, объединяющих 628372 последовательностей (табл. 2). После исключения ОТЕ, относящихся к Metazoa и высшим растениям, осталось 307 000 последовательностей и 1150 ОТЕ, принадлежащих протистам, включая истинные грибы (Fungi). Количество последовательностей и число ОТЕ протистов заметно варьировало от станции к станции (табл. 2). Наибольшее количество ОТЕ, максимально возможное видовое богатство и наименее выраженное доминирование (табл. 2) зарегистрировано на речной станции, а наименьшее разнообразие и максимально выраженное доминирование – на станции в водохранилище выше устья залива. В целом таксономическое разнообразие снижалось, а степень доминирования – возрастала в направлении от речного участка к водохранилищу (табл. 2).

Среди выделенных ОТЕ протистов только 93 ОТЕ (8.1%) были общими для всех шести проб, еще 305 ОТЕ (26.5%) были встречены не менее, чем в половине образцов (3–5 проб), а 752 ОТЕ были уникальными, т.е. встречались только в одной (586 ОТЕ; 51%) или двух пробах (166 ОТЕ; 14.4%). Наименьшее количество общих ОТЕ было обнаружено между рекой и водохранилищем. Интересно отметить, что среди уникальных ОТЕ 490 были обнаружены в пробе из речной станции, на остальных станциях их число было существенно меньше и составляло 13–37 ОТЕ.

Судя по индексу Chao1, октавному анализу (оценке ожидаемого полного числа ОТЕ в предположении о логнормальном распределении их численностей) и кривым разрежения (табл. 2, рис. 1), число ОТЕ, обнаруженных в объединенной библиотеке, близко к реально существующему, а в каждой из индивидуальных проб недоучтено от 1 до 15% их общего количества (от 10 до 43 ОТЕ). Однако, поскольку использованный алгоритм выделения операционных таксономических единиц по умолчанию предполагает отбрасывание синглтонов, нельзя исключать, что реальное разнообразие планктонных протистов может быть еще выше.

Рис. 1.

Кривые разрежения последовательностей 18S рРНК, обнаруженных в исследованных пробах. Числами у кривых обозначены номера проб.

Таксономический анализ сообщества простейших затрудняется тем, что их современная система (Adl et al., 2019) является безранговой, поэтому трудно избежать смешения таксонов, находящихся на разных уровнях иерархии. В полученной нами библиотеке как по количеству последовательностей, так и по числу ОТЕ, преобладают Biconta (Diaphoretickes), преимущественно представители супергруппы SAR (рис. 2). Среди последних по числу ОТЕ преобладают Stramenopiles (в основном, Chrysophyceae (8.5%), Opalozoa (8.2%), Diatomea (4.7%) и Oomycetes (Peronosporomycetes) (3.7%)), но по количеству последовательностей – Alveolata (Ciliata (56.9%)) (рис. 2). Выраженное преобладание Ciliata по числу последовательностей вполне ожидаемо, поскольку инфузории имеют макронуклеусы с высокой степенью полиплоидизации и содержат в своих клетках как минимум на порядок больше копий гена 18S рРНК, чем любые другие простейшие, за исключением, возможно, многоядерных фораминифер (Gong et al., 2013; Weber, Pawlowski, 2013). Rhizaria формируют 11.6% ОТЕ и 3.2% последовательностей и представлены в основном Cercozoa, около четверти ОТЕ принадлежит к неклассифицируемым. Поскольку амебофлагелляты в составе Rhizaria представляют собой один из основных таксонов пресноводных “гетеротрофных нанофлагеллят”, этот факт, безусловно, является поводом для дальнейшего исследования. Остальные представители Diaphoretickes (Archaeplastida, Criptista и Haptista) составляют небольшую долю как по числу ОТЕ, так и по числу последовательностей (рис. 2).

Рис. 2.

Распределение числа последовательностей и ОТЕ протистов по таксономическим группам в объединенной библиотеке. Площадь сектора пропорциональна числу последовательностей, а угол отражает вклад в суммарное число ОТЕ в объединенной библиотеке. Обозначения таксонов: 1, Fungi; 2, Choanoflagellida; 3, прочие Amorphea; 4, Chlorophyta; 5, прочие Archaeplastida; 6, Cryptista; 7, Haptista (Centroplasthelida); 8, Chrysophyceae; 9, Diatomea; 10, Opalozoa; 11, Oomycetes; 12, прочие Stramenopiles; 13, Ciliophora; 14, Dinoflagellata; 15, прочие Alveolata; 16, Cercozoa; 17, прочие Rhizaria; 18, прочие и неопределенные.

Представители Amorphea составляют около трети обнаруженных ОТЕ, но довольно небольшую часть обнаруженных последовательностей (рис. 2), причем основной вклад среди них вносят Fungi.

Обнаружены лишь единичные последовательности, относящиеся к Discoba (3 ОТЕ и 13 последовательностей), хотя по данным микроскопического анализа (Уманская и др., 2021) в планктоне присутствовали, во всяком случае, фототрофные Euglenida (Euglenophyceae). Известно, что большинство праймеров к V4-участку 18S рРНК малоэффективны в отношении Excavata, в т. ч. Discoba, из-за большой длины этого участка (Geisen et al., 2019). Мы обнаружили также, что использованный праймер Ek-NSR951 имеет низкое покрытие последовательностей 18S рРНК большинства Discoba. Таким образом, обилие Discoba действительно недоучитывается в полученной нами библиотеке.

Только 4.3% ОТЕ не удалось классифицировать до типа, причем все они были минорными, составляя суммарно менее 0.4% всех последовательностей в библиотеке, и, таким образом, не оказывали значительного влияния на структуру планктонных протистов в экосистеме эстуарной зоны р. Уса.

В целом, подобный характер соотношения крупных таксонов довольно часто наблюдается в пресноводных речных и озерных экосистемах (Debroas et al., 2017; Boenigk et al., 2018; Cruaud et al., 2019; David et al., 2021; Singer et al., 2021), а также в некоторых солоноватоводных эстуариях (Li et al., 2018; Xu et al., 2020; Zhao et al., 2020).

Трофическая специализация. В литературе выделяются многочисленные трофические стратегии, присущие протистам; так, гетеротрофные формы можно разделить на сапротрофов (типичный пример – истинные грибы), собирателей (амебы, большинство мелких жгутиконосцев); фильтраторов (хоанофлагелляты и др. сидячие формы, многие инфузории) и активно преследующих добычу рапторов (многие инфузории кл. Litostomatea и Prostomatea). Подавляющее большинство фототрофов способно питаться сапротрофно, а многие, кроме того, и фаготрофно (Saad et al., 2013; Andersen et al., 2015; Chakraborty et al., 2017; Singer et al., 2021). Реально многие виды протистов используют несколько трофических стратегий либо одновременно, либо на разных стадиях жизненного цикла.

Поэтому мы ограничились самой общей классификацией полученных ОТЕ по их преимущественной трофической стратегии, разделив их на фототрофные, гетеротрофные, в том числе паразитические, и “неопределенные”. Поскольку у Chrysophyceae и Dinoflagellata известна неоднократная потеря фототрофии в части эволюционных ветвей и у отдельных видов, трофические стратегии OTЕ, принадлежащих к этим группам, были определены по результатам построения филогенетических деревьев, причем ОТЕ, имеющие низкое сходство с известными последовательностями и не принадлежащие к эволюционным ветвям с определенной стратегией, были отнесены к “неопределенным”. К последним были отнесены также все ОТЕ, относящиеся к неклассифицированным эукариотам, неклассифицированным Stramenopiles и Alveolata.

Фототрофы, которые способны к фаготрофии, были выделены в группу миксотрофов, к которой отнесли всех фототрофных представителей Dinoflagellata, Cryptophyta, Dictyochophyceae и Chrysophyceae, исключая Synurales (табл. 3). Поскольку далеко не во всех случаях есть консенсус относительно отнесения ряда известных видов к миксотрофным или облигатно фототрофным (Charvet et al., 2012, Stockner et al., 2017; Dorrell et al., 2019; Bock et al., 2022; Suzuki et al., 2022), то в настоящей работе доля миксотрофных протистов в планктонном сообществе исследованного района оценена как потенциальная, без учета интенсивности фаготрофии конкретных видов в реальных условиях.

Приобретенная миксотрофия за счет фототрофных симбионтов или клептопластии известна у многих видов инфузорий; однако в полученной нами библиотеке ОТЕ, близкие к известным видам, содержащим зоохлореллы или клептопласты, отсутствовали.

В объединенной библиотеке среди планктонных протистов преобладали гетеротрофы (77.9% последовательностей), в том числе паразитические протисты – 3.0%. Фототрофы составляли 18.2% от общего числа последовательностей, включая 8,7% миксотрофных, а “неопределенные” – 3.9%. Доли фото-, миксо- и гетеротрофов, а также их таксономический состав, менялись от станции к станции (табл. 3). Интересно отметить, что среди миксотрофов на речной станции больший вклад вносили представители Chrysophyceae, тогда как в заливе и в водохранилищных станциях – Cryptophyta (табл. 3).

Трансформация сообщества протистов в эстуарной системе р. Уса. Даже на уровне количества выделенных ОТЕ как оценки “видового богатства” очевидна линейная трансформация сообществ простейших вдоль длинной оси залива (табл. 2). Анализ изменения сообщества протистов с помощью качественного индекса Жаккара позволил объединить станции в несколько взаимосвязанных групп (рис. 3а). Станции 4–7 по своему составу образуют достаточно единую группу, однако различия по индексу Жаккара (1-J) между ними все же составляют не менее 37%. Особенно выделяется “речная” ст. 3, которая на этой диаграмме должна находиться не в плоскости всех остальных, а над нею, поскольку не показанные на схеме (рис. 3а) расстояния между ней и ст. 6–8 также составляют 81–85%. Наиболее близки по индексу Жаккара ст. 4 и 5 (41%), и, что довольно неожиданно, ст. 6 в устье залива и ст. 7 водохранилища ниже устья (37%). Мы предполагаем, что последнее связано с процессом водообмена между ними, обусловленным недельными и суточными колебаниями уровня водохранилища из-за работы Жигулевской ГЭС (Жариков, 2000), однако это предположение требует дополнительных подтверждений. При этом, траектория наименьших различий соответствует порядку станций вдоль оси залива (рис. 3а). Таким образом, было выявлено четыре группы проб: речной участок (ст. 3), собственно залив (ст. 4 и 5), устьевой участок (ст. 6 и 7) и водохранилище вне влияния залива (ст. 8).

Рис. 3.

(а) – граф различий между станциями по коэффициенту Жаккара. Жирными линиями показаны связи с расстоянием Жаккара менее 0.5. (б) – число общих и различных ОТЕ, обнаруженных на выделяемых с помощью кластерного анализа участках исследуемой акватории (диаграмма Венна).

Выводы о закономерном изменении сообщества протистов вдоль длинной оси залива подтверждаются анализом уникальных и общих ОТЕ в этих четырех группах проб (диаграмма Венна, рис. 3б). Как видно из диаграммы, речной участок чрезвычайно сильно отличается от всех остальных. Более половины зарегистрированных в нем ОТЕ не встречены на остальных станциях, в то время как на остальных участках количество уникальных ОТЕ почти на порядок меньше.

Для количественной оценки β-разнообразия были рассчитаны коэффициенты различия Брея–Кёртиса и взвешенные UniFrac-расстояния (Lozupone, Knight, 2005) между исследованными пробами. Оба метода дали практически одинаковые результаты, выявив те же самые 4 группы сообществ (рис. 4а), которые выделяются и при кластерном анализе по качественному индексу Жаккара. Необходимо отметить, что концентрация Хл а и биомасса цианобактерий были максимальны на станциях собственно залива, а доля последовательностей Metazoa – на станциях устья залива и водохранилища (рис. 4б). В целом эти показатели, влияющие на сообщество протистов, закономерно меняются вдоль эстуарной системы, а их величины заметно различаются в разных кластерах (рис. 4а, 4б).

Рис. 4.

Трансформация сообщества протистов в системе река–залив–водохранилище: (а) дендрограмма различия исследованных сообществ по индексу Брея-Кертиса методом невзвешенного среднего (UPGMA); (б) изменение экологических факторов, влияющих на сообщества протистов, в эстуарный системе; изменение таксономической (в) и функциональной (г) структуры сообществ протистов на разных станциях. По оси Х здесь и на рис. 4 – номера станций (см. табл. 1). Номера кластеров указаны римскими цифрами.

Сообщество протистов речного участка (I кластер) отличалось наибольшим числом ОТЕ и наибольшим разнообразием по индексу Шеннона, выровненности (индексу Пиелоу) и индексу разнообразия Симпсона, хотя индекс Бергера-Паркера (доля первого по рангу ОТЕ) и не был минимальным (табл. 2). Основной вклад, в порядке убывания числа последовательностей в этом кластере вносили Stramenopiles, Alveolata и Amorphea (рис. 4в). Среди Stramenopiles преобладали хризофиты (31% общего числа последовательностей) и диатомеи (18.6%). Среди хризофитов наибольший вклад вносили ОТЕ с неясной трофической стратегией (11.9%), причем в их число входят и два доминирующих ОТЕ (ОТЕ-21 и ОТЕ-47), поскольку они принадлежат к группе, содержащей как миксотрофные, так и гетеротрофные виды, но одинаково далеки и от тех, и от других (табл. 3, 4, 5, рис. 5). К гетеротрофным принадлежали 10.6% ОТЕ Chrysophyceae, доля фототрофов (в подавляющем большинстве способных к мисотрофии) была еще ниже (8.5%). Почти треть последовательностей диатомей (5.8%) составляла единственная ОТЕ-22, идентичная по нуклеотидной последовательности Melosira varians (табл. 4, 5). Alveolata были представлены почти исключительно инфузориями, среди которых доминировали Oligohymenophorea (18.4%). Около 3/4 всех последовательностей Amorphea составляли истинные грибы (Fungi), причем наряду с Chytridiomycota в заметных количествах присутствовали преимущественно наземные Dicarya. Воротничковые жгутиконосцы, Choanoflagellata, были немногочисленны в сравнении с другими станциями (табл. 3, рис. 5).

Рис. 5.

Доли таксонов (от общего числа последовательностей), принадлежащих к доминирующим группам протистов на разных станциях исследованного района.

В отличие от речного участка (I кластер), в остальных кластерах основной вклад в количество последовательностей вносили Alveolata (табл. 3, рис. 4, 5).

Сообщества станций собственно залива (кластер II) характеризовались наиболее сильным доминированием Alveolata, среди которых преобладали инфузории (рис. 4в, 5). В отличие от I кластера, доминирование в составе инфузорий перешло от Olygohymenophorea, среди которых доминировали сидячие эпифитные формы, к эупланктонным Spirotrichea. В составе фототрофных протистов преобладали криптофитовые, динофитовые и, в меньшей степени, зеленые водоросли, а диатомовые были очень немногочисленны (табл. 3, рис. 5). Stramenopiles в целом были представлены небольшим числом последовательностей, но довольно разнообразны (рис. 5). В их составе преобладали гетеротрофы, причем наряду с хризофитовыми, заметную долю составляли жгутиконосцы Bicosoecida (Opalozoa) и оомицеты. Однако доминирующей группой среди гетеротрофных жгутиконосцев являлись Choanoflagellata (Amorphea: Opisthokonta). Относительно высоким также был вклад Katablepharida (Cryptista); на ст. 4 они были второй по числу последовательностей группой гетеротрофных жгутиконосцев (табл. 3, рис. 5).

В сообществах кластера III основной вклад, в порядке убывания числа последовательностей вносили Alveolata, Stramenopiles, Rhizaria и Archaeplastida (рис. 4в). Устьевой участок залива (ст. 6) заметно отличался от станций собственно залива (ст. 4 и 5) и был близок по составу протистов к ст. 7, расположенной в водохранилище ниже устья залива (рис. 4, 5). В этом кластере среди инфузорий так же, как в заливе преобладали Olygohymenophorea и Spirotrichea, однако их соотношение несколько изменилось. Для этих двух станций характерна большая, по сравнению с заливом, доля Rhizaria и Stramenopiles. Кроме того, здесь увеличены доли Chlorophyta, Colpodellidea и Chrysista, а среди Rhizaria преобладали Cercomonadidae и Thecofilosea (рис. 4в, 5, табл. 3).

Надо отметить, что в кластере II, с наибольшим развитием цианобактерий, доля миксотрофов примерно в 3 раза превышала долю “чистых” фототрофов, тогда как в кластере III их вклады были сопоставимы (табл. 3, рис. 4б, 4г).

Течения в прилегающей к заливу части водохранилища направлены в сторону гидроузла, от ст. 8 к ст. 7, а преобладающие ветра способствуют ветровому транспорту из залива в водохранилище, поэтому ст. 8 оказывается наиболее изолированной от залива. Состав протистов этой станции (IV кластер) вполне ожидаемо сильно отличался от остальных кластеров (табл. 3, рис. 4, 5). Среди супергруппы SAR здесь преобладали инфузории (преимущественно Olygohymenophorea). Как и в кластере I, доля фототрофных протистов была повышена (рис. 4г), и среди них преобладали диатомеи; однако состав доминирующих ОТЕ существенно отличался от речного участка (табл. 3, 4 и 5). В целом, в кластере IV состав Stramenopiles был значительно более, а Rhizaria – менее разнообразен, чем на речной станции (рис. 5). В то же время, по обилию последовательностей Plantae (рис. 4б) и наземных Dicarya (рис. 4в, 5), она сравнима с речной станцией, что, видимо, свидетельствует о существенном влиянии на нее наземной части водосбора, вероятно, из-за вышележащего строительства автомобильного моста через Климовскую узость водохранилища. Возможно, именно это антропогенное воздействие приводит к определенному сближению состава протистов станций кластеров I и IV на уровне высших таксонов, однако на уровне видов (ОТЕ) это сближение отсутствует (табл. 4).

Исследованная нами эстуарная система несет отдельные черты как экоклина, так и экотона (Attrill, Rundle, 2002). Безусловно, наиболее выраженные, и при этом разнонаправленные, для разных групп протистов изменения происходят при переходе от речного, лотического, участка к лентическим. На лентических станциях доли таких групп, как Rhizaria, инфузории кл. Oligohymenophorea и Litostomatea, a также Protalveolata относительно монотонно изменялись вдоль длинной оси залива по направлению к водохранилищу (рис. 4в, 5). Так, например, вклад Rhizaria закономерно увеличивался от ст. 4 к ст. 8.

Однако другие группы достигают выраженных локальных максимумов или минимумов в серединной части залива: Stramenopiles и ряд принадлежащих к ним таксонов – минимума, а Choanoflagellata и инфузории кл. Spirotrichea, наоборот, максимума (рис. 4в, 5), что более характерно для экотона. Очень отличается от монотонного и изменение отдельных таксонов Rhizaria (рис. 5).

Все наши данные свидетельствуют о том, что залив в целом и станция водохранилища ниже устья залива образуют относительно связную систему, причем конечные точки – река (ст. 3) и участок водохранилища выше устья (ст. 8) – наиболее контрастны по составу протистов. Станции кластеров II и III довольно близки между собой, что указывает на существенную связь устьевой части залива с водохранилищем. Причиной этого, вероятно, является гидрологическая взаимосвязь между заливом и водохранилищем из-за циркуляционных течений, ветровых нагонов и течений, вызванных работой ГЭС.

Влияние экологических факторов на планктонных протистов эстуарной зоны р. Уса. Судя по результатам канонического корреляционного анализа, развитие Archaeplastida, Rhizaria и минорных групп протистов положительно коррелировало с долей Metazoa в общем составе эукариот, которое может рассматриваться как грубый показатель интенсивности выедания (рис. 6). Развитие Stramenopiles и Amorphaea было положительно связано с долей последовательностей высших растений, вероятно, служащей индикатором влияния водосборной территории, поскольку, судя по отсутствию хлоропластных последовательностей в полученной параллельно библиотеке 16S РНК (не показ.), они были представлены в наших пробах только морт-массой и пыльцой. Остальные крупные группы, Haptista, Cryptista и Alveolata, были отрицательно связаны как с выеданием, так и с влиянием водосбора, и слабо положительно связаны с интенсивностью цветения цианобактерий (рис. 6). Основное влияние на развитие фототрофного компонента эукариотического планктона оказывают конкурентные взимооотношения с цианобактериями; развитие последних приводит не только к подавлению развития эукариотических водорослей, но и к изменению их структуры, в том числе к увеличению доли миксотрофных видов. “Цветение” цианобактерий оказывает влияние и на структуру гетеротрофной части сообщества, хотя это влияние выражено менее ярко.

Рис. 6.

Результаты канонического корреляционного анализа основных биотических и абиотических факторов и таксономических клад сообщества протистов на исследованных станциях Усинского залива и прилегающего участка Куйбышевского водохранилища. Факторы: Met – Metazoa, S – прозрачность, Т – температура, О₂ – концентрация растворенного кислорода, Chl a – концентрация хлорофилла а, Cya – биомасса цианобактерий, Het – биомасса гетеротрофных бактерий, Dtr-B – масса детритных частиц, Dtr-N – количество детритных частиц, Cond – электропроводность. Трофическая специализация протистов: Hetero – гетеротрофные, Photo – фототрофные, Unknown – “неопределенные”. Макротаксоны: Amo – Amorphea, Arc – Archaeplastida, Str – Stramenopiles, Alv – Alveolata, Rhi – Rhizaria, Cry – Cryptista, Hap – Haptista, Oth – прочие. Станции: 3–8.

Доминирующие ОТЕ, интересные и неожиданные находки. Всего было выделено 23 доминирующих ОТЕ (табл. 4, 5). Из них более половины, 12 ОТЕ, принадлежали Ciliata; остальные относились к Chrysophyta (3 ОТЕ), Diatomea, Rhizaria и Protalveolata (по 2 ОТЕ), Chlorophyta и Cryptophyceae (по 1 ОТЕ). За исключением OTE-18 и OTE-24, представители Ciliata, Chlorophyta и Cryptophyceae уверенно классифицируются по крайней мере до рода (сходство с изолятами валидных видов >95–96%). Проблему составляет скорее низкое разрешение для баркодинга выбранного участка 18S рРНК. Так, в случае ОТЕ-9, ОТЕ-10 и ОТЕ-37 идентичные последовательности, совпадающие или очень близкие к обнаруженным в наших пробах имели изоляты сразу нескольких разных видов (табл. 5). В то же время, доминирующие ОТЕ Chrysophyta, Rhizaria и Protalveolata имели низкое сходство с последовательностями валидно описанных видов, и, следовательно, относились к новым и неописанным таксонам.

Наряду с доминирующими видами, большой интерес представляют и малочисленные, в т.ч. единичные, находки.

Две из обнаруженных в библиотеке ОТЕ (ОТЕ-754 и ОТЕ-1077) принадлежат к классу Bolidophyceae (=Parmales). Эта группа, сестринская по отношению к диатомовым, до последнего времени считалась исключительно морской (Kuwata et al., 2018), хотя с начала 21 века ее представители были зарегистрированы в нескольких пресных озерах (Richards et al., 2005). После недавнего обнаружения Bolidophyceae в оз. Байкал было выдвинуто предположении об их медленном проникновении из морских местообитаний в длительно существующие “реликтовые” водоемы (Annenkova et al., 2020). Однако наше обнаружение представителей Bolidophyceae в Куйбышевском водохранилище показывает, что распространение этой группы в пресных водоемах вовсе не требует длительного стабильного существования водных экосистем, а вероятно, вообще несколько более широко, чем представлялось.

В качестве других интересных находок можно отметить обнаружение в составе Archaeplastida ОТЕ-626, принадлежащей к недавно обнаруженной гетеротрофной группе Rhodelphida (Gawryluk et al., 2019). Ее сходство с Rhodelphis limneticus Colp-38 (MK966713) составляет 94.2%. В составе Rhizaria присутствует ОТЕ-642, вероятно принадлежащая к р. Paulinella (сходство с последовательностью KX927958 Paulinella micropora KR04 – 94.4%). Возможно, этот организм содержит цианеллы и является фототрофом, поскольку последовательности, сходные с цианеллами близкого вида, Paulinella chromatophora, присутствуют в библиотеке прокариотических последовательностей исследованных станций, анализ которой будет опубликован позднее. Обе ОТЕ представлены небольшим количеством последовательностей и встречены только на речной станции; они, вероятно, относятся к новым видам.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По данным метабаркодинга 18S рРНК, в составе сообщества протистов эстуарного участка р. Усы и близлежащего участка Куйбышевского водохранилища обнаружено 1150 ОТЕ, среди которых преобладают представители SAR-супергруппы, Sramenopiles на речном участке и Alveolata – на остальных станциях. Все доминирующие по числу последовательностей ОТЕ принадлежат к группе Diaphoretikes, причем более половины их них составляют инфузории. Среди полученных последовательностей обнаружены принадлежащие к редким для пресных вод таксонам, в частности, Bolidophyceae (фототрофные страменопилы, родственные диатомовым) и Rhodelphida (гетеротрофная группа, сестринская по отношению к Rhodophyta). Эти интересные находки расширяют биогеографию этих групп, которые в пресных водах обнаружены в очень небольшой части водоемов, и в основном молекулярно-генетическими методами.

Наблюдается очевидная трансформация сообществ простейших вдоль длинной оси исследованного района от речного участка до собственно водохранилища. Наиболее выражена она при переходе от речных к озерным условиям; однако прослеживается и в пределах лентического участка. Всего можно выделить 4 взаимосвязанных сообщества протистов: речного участка, собственно залива, устьевой зоны и водохранилища вне влияния залива. Наиболее контрастными по составу являются сообщества речного участка и участка водохранилища выше устья. В целом, исследованная нами эстуарная система несет черты как экоклина, так и экотона. Основное влияние на развитие фототрофного компонента эукариотического планктона оказывают конкурентные взаимоотношения с цианобактериями; развитие последних приводит не только к подавлению развития эукариотических водорослей, но и к изменению структуры их сообщества. “Цветение” цианобактерий оказывает влияние и на структуру гетеротрофной части сообщества, хотя это влияние проявляется менее ярко.

Представленные нами данные могут служить отправной точкой для сравнения исследованного района с другими участками водохранилищ Волжско-Камского каскада и в целом с водоемами бассейна Волги.

Работа выполнена в рамках Государственного Задания по теме “Изменение, устойчивость и сохранение биологического разнообразия под воздействием глобальных изменений климата и интенсивной антропогенной нагрузки на экосистемы Волжского бассейна” (тема № 122032500063-0) и при частичной финансовой поддержке Губернского гранта в области науки и техники, утвержденного распоряжением Губернатора Самарской области от 30.06.2021 № 202-р. (грант № 38).