Известия РАН. Серия биологическая, 2023, № 4, стр. 346-355

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Все исследования проводили на базе Центра паразитологии Института проблем экологии и эволюции им А.Н. Северцова РАН, Всероссийского научно-исследовательского института фундаментальной и прикладной паразитологии животных и растений – филиала ФГБНУ “Федеральный научный центр – Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко РАН”. В опытах использовали: фенбендазол (ФБЗ) – 5-(фенилтио)-2-бензимидазолкарбамат (99.0%) производства Changzhou Yabang Pharmaceuticals Co. Ltd (Китай); янтарную кислоту (ЯК) производства ООО “Верфарм” (Москва); поливинилпирролидон (ПВП) – 1 этенилпирролидин-2-он марки К-30, производитель – Boai NKY Pharmaceuticals Ltd. (КНР), Batsch number P160828002-0; арабиногалактан (АГ) марки “Левитол-арабиногалактан” ТУ 9325-008-70692152-08, производитель – АО “Аметис” (Россия, Благовещенск); экстракт солодки (ЭС) – с содержанием 24.9% глицирризиновой кислоты производства ООО “Вистерра”, Алтайский край (Декларация соответствия TCN RU Д–RU.AF96.B.00958).

Механохимическое получение твердой дисперсии состава ФБЗ : ПВП (1 : 9) проводили в металлическом барабане валковой мельницы LE-101 (Hungary) путем загрузки 10.0 г субстанции ФБЗ, 90.0 г ПВП и 1600 г металлических шаров (30 шаров с диаметром 25 мм компании ООО “Техно-Центр”, г. Рыбинск) с последующей механообработкой при следующим условиях: объем загрузки – 80%; модуль – 1 : 16; скорость вращения барабана 60–70 об./мин. Механообработку проводили в течение 6 часов с отбором проб через 1 ч для анализа на изменение растворимости. Аналогично были получены ТД следующих составов, соответственно: ФБЗ : АГ (1 : 9), ФБЗ:ЭС (1 : 9). Для получения ТД ФБЗ с ПВП и ЯК в металлический барабан валковой мельницы была загружена предварительно приготовленная физическая смесь из 10.0 г ФБЗ, 10.0 г ЯК и 30.0 г полимера (ПВП или АГ соответственно), которая подвергалась механообработке при следующих условиях: модуль 1 : 16, скорость вращения барабана 60–70 об./мин, время обработки 5 ч.

Получение образцов смешанных кристаллов ФБЗ с ЯК проводили аналогично методики (Мызь и др., 2020) с некоторыми изменениями, а именно, вместо планетарно-центробежной мельницы АГО, нами механообработка компонентов проводилась в агатовой ступке путем перетирания 460 мг ФБЗ и 460 мг ЯК в течение 10 мин. Добавив в содержимое ступки 10 мл диоксана, механообработка была продолжена еще в течение 5 мин. Содержимое ступки переносили в колбу на 50 мл и проводили нагревание при перемешивании на магнитной мешалке. Через 5 мин нагревания белая суспензия превращалась в прозрачный светло розовый раствор, который оставляли в закрытой колбе. В растворе в течение суток выпало 0.78 г мелкодисперсного осадка светло-желтого цвета. Аналогично получали смешанные кристаллы ФБЗ с ЯК с добавлением в качестве растворителей ацетонитрила и изопропанола.

Для определения растворимости полученных ТД фенбендазола с полимерами и ЯК использовали методику С.С. Халикова с соавт. с погрешностью анализа ±3% (Халиков и др., 2015).

Изучение содержания действующего вещества и возможных процессов окисления при получении ТД и смешанных кристаллов ФБЗ проводили с помощью ВЭЖХ-МС анализа по собственной методике с помощью жидкостного хромато-масс-спектрометра Shimadzu LCMS-2020 с ионизацией электрораспылением и одноквадрупольным детектором масс. В качестве стационарной фазы использовали колонку Shim-pack GIST 3 μм С18 3 × 150 мм с предколонкой Shim-pack GIST (G) 5 μм С18 4 × 10 мм. Элюирование проводили в изократическом режиме смесью 60 об. % ацетонитрила (99.9%) и 40 об. % раствора муравьиной кислоты (0.1 об. %) в воде (Milli-Q), скорость потока 0.7 мл/мин. Температуры термостата колонок, нагревательного блока и линии десольватации составляли 40°С, 250°С и 400°С, соответственно. В качестве осушающего и распыляющего газа использовался азот (99.999%), скорость потока 15 и 3 л/ч соответственно. Разность потенциалов между капилляром распыления и капилляром ввода составляла 4.5 кВ. Навеску анализируемой лекарственной субстанции (0.1–0.7 мг) растворяли в 1 мл ацетонитрила с использованием вортекса, перед анализом пробы центрифугировали в течение 2 мин при 5000 об./мин для осаждения нерастворенной части образца. Объем ввода пробы составил 2 μл. Для проведения количественного анализа содержания ФБЗ в лекарственных субстанциях использовали метод внешнего стандарта. Готовили исходный раствор ФБЗ в ацетонитриле с концентрацией 0.66 мг/мл, затем методом разбавления исходного раствора получали растворы с концентрациями 0.33, 0.165, 0.0825 и 0.04125 мг/мл. Полученные растворы анализировали с использованием указанных выше условий анализа и строили зависимость площади под пиком фенбендазола от концентрации для получения калибровочного графика. Для расчетов использовали программу LabSolutions и Microsoft Exсel.

Изучение биологической активности различных форм на основе ФБЗ проводили на лабораторной модели трихинеллеза белых мышей, экспериментально инвазированных Trichinella spiralis в возрасте 1.5–2 мес. в дозе 200 личинок. На третьи сутки после заражения мышам шести опытных групп (по 10 особей в каждой) вводили перорально однократно субстанции ФБЗ, полученные с различными компонентами в дозе по 2.0 мг/кг по действующему веществу (ДВ), т.е. по фенбендазолу. Мыши седьмой группы получали базовый препарат – субстанцию ФБЗ в дозе 2.0 мг/кг. Животные контрольной группы препарат не получали. Животных убивали декапитацией на вторые сутки после введения препаратов. Тонкий кишечник мышей разрезали ножницами по всей длине и помещали в аппарат Бермана в физиологическом растворе. Пробы ставили в термостат на 2 ч при 37–39°С, после чего осадок исследовали под бинокулярной лупой, подсчитывая число обнаруженных T. spiralis и рассчитывая интенсэффективность (ИЭ) (Астафьев и др., 1989; Архипов и др., 2019).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При изучении растворимости твердой дисперсии ФБЗ с полимерами, было установлено повышение растворимости до 24 раз для композиции ФБЗ : ПВП (1 : 9); для ТД состава ФБЗ : АГ (1 : 9) – увеличение растворимости в 12 раз; ТД состава ФБЗ : ЭС (1 : 9) – увеличение растворимости в 37 раз, что подтверждено результатами наших предыдущих исследований. Полученные ТД многокомпонентных составов ФБЗ : ЯК : ПВП (1 : 1 :3 ) и ФБЗ : ЯК : АГ (1 : 1 : 3) обладали повышенной растворимостью – в 19 и 11 раз соответственно. Данные по растворимости смешанных кристаллов ФБЗ и ЯК, полученных в различных растворителях представлены в табл. 1.

Анализ данных табл. 1 позволил выбрать для проведения биологических испытаний образцы смешанных кристаллов с наибольшей растворимостью, т.е. образцы смешанных кристаллов ФБЗ с ЯК, полученных в ацетонитриле и изопропаноле.

Надо отметить, что ТД с полимерами представляют собой стабильные по ДВ тонкодиспергированные порошки, которые не подвергаются процессам деструкции ни в условиях механообработки, ни в течение 5–6 лет хранения, что подтверждается данными ВЭЖХ-МС исследований (рис. 1).

Рис. 1.

Хроматограмма ТД состава ФБЗ : АГ (1 : 9), 2015 г. производства, спектрофотометрический детектор, 295 нм (а); хроматограмма тока для положительных ионов ТД состава ФБЗ : АГ (1 : 9), 2015 г. производства (б).

Анализ данных рис. 1 показывает, что в масс-спектре время 3.33 мин соответствует чистому ФБЗ, а сульфоксида ФБЗ – это основной метаболит фенбендазола, образующийся в реакции его сульфокисления, в образце обнаружено не было даже при сроках хранения более 7 лет.

Анализ ВЭЖХ-МС образцов ТД фенбендазола с ПВП и с ЭС (табл. 2) также показал отсутствие примесей в целевых продуктах.

Анализ многокомпонентных твердых дисперсий составов ФБЗ : ЯК : ПВП (1 : 1 : 3) и ФБЗ : ЯК: : АГ (1 : 1 : 3) методом ВЭЖХ-МС подтвердил стабильность субстанции ФБЗ при его твердофазной механообработке с ЯК (рис. 2).

Рис. 2.

Хроматограммы тока для положительных ионов ТД составов: а) ФБЗ : ЯК : ПВП (1 : 1 : 3), полученной при твердофазной механообработке компонентов (ФБЗ, ПВП и ЯК) в апреле 2022 г.; б) ФБЗ : ЯК : АГ (1 : 1 : 3), полученной при твердофазной механообработке компонентов (ФБЗ, АГ и ЯК) в апреле 2022 г.

Масс-спектры обоих образцов при 3.33 мин соответствуют чистому ФБЗ, а продукта его окисления – сульфоксида ФБЗ (СО ФБЗ) – в образцах не обнаружено.

При изучении кристаллов ФБЗ с ЯК, полученных с использованием в качестве растворителя диоксана, ВЭЖХ-МС анализ осадка показал, что они представляет собой смесь из 22% ФБЗ, 16% СО ФБЗ, около 7% не идентифицированных примесей, остальное – ЯК (рис. 3). При этом продукта присоединения не обнаружено.

Рис. 3.

Хроматограмма смешанных кристаллов ФБЗ с ЯК (механохимия твердых компонентов с последующих кипячением композиции в диоксане), спектрофотометрический детектор, 295 нм (а); хроматограмма тока для положительных ионов этого же образца (б).

Из данных на рис. 3 видно, что при проведении реакции в кипящем диоксане получается продукт, который представляет собой смесь исходного ФБЗ (в масс-спектре время 3.33 мин) и СО ФБЗ (в масс спектре время 1.57 мин).

Аналогично были изучены смешанные кристаллы ФБЗ с ЯК, полученные при добавлении ацетонитрила. Установлено, что выпавший осадок состоял из 95% ФБЗ, 3% СО ФБЗ, остальное – ЯК. Продукта присоединения не найдено. Смешанные кристаллы, в процессе получения которых добавляли изопропанол, состояли из 75% ФБЗ, 3% СО ФБЗ, остальное – ЯК. Продукта присоединения не найдено.

Стоит отметить, что изучение эффективности и безопасности нового лекарственного препарата, внедряемого в ветеринарную практику, является необходимым важным условием. Стабильность лекарственного вещества и его качество тесно связаны между собой. Основной критерий стабильности – это сохранение качества лекарственного средства. Снижение активности лекарственного вещества говорит о его нестабильности и уменьшении количества активно действующего вещества. Процессы, происходящие при хранении лекарственных веществ, могут привести к изменению их химического состава или физических свойств, что может привести к постепенной потере фармакологической активности и накоплению посторонних примесей. Из физических факторов наибольшее влияние оказывают температура, свет и влажность. Химические процессы, происходящие при хранении лекарственных веществ, тесно связаны с влиянием физических факторов, к ним можно отнести: реакции окисления-восстановления, декарбоксилирования, гидролиз, фотохимическую деструкцию, изомеризацию и др. Так, в работе (Fan et al., 2021) была показана возможность превращения ряда сульфидов, в том числе альбендазола (АБЗ) и ФБЗ в соответствующие сульфоксиды в смеси MeOH и H₂O (об./об. 2/1) под действием света, а именно, синглетный кислород играет важную роль в фотосульфоксидировании сульфидов. Надо отметить, что в наших более ранних работах (Халиков и др., 2015; Chistyachenko et al., 2015) по получению ТД на основе АБЗ и ФБЗ с водорастворимыми полимерами методами механохимии не наблюдалось образования соответствующих сульфонов и сульфоксидов, что было подтверждено методом ВЭЖХ анализа продуктов механообработки. В то же время известно, что высокая антигельминтная активность ФБЗ объяснялась образованием первичных метаболитов, в частности, сульфоксида и сульфона ФБЗ, которые были обнаружены в крови и молоке обработанных животных (Кочетков и др., 2016; Varlamova et al., 2020). Известно, что при поступлении в организм фенбендазол в печени последовательно метаболизируется до сульфоксида и затем до сульфона фенбендазола под действием микросомальных ферментов. Для жвачных при этом характерна энтерогепатическая циркуляция, сульфоксид попадая в рубец, трансформируется микрофлорой в фенбендазол, что приводит к более длительному воздействию на гельминтов и говорит о корреляции между уровнем препарата в плазме, содержимом пищеварительного тракта жвачных и тканях гельминта (Riviere, Papich, 2009).

Образование сульфоксида ФБЗ нами было впервые обнаружено при попытках модифицировать ФБЗ с целью получения смешанных кристаллов ФБЗ и ЯК с использованием условий, описанных в работе (Мызь и др., 2020), в которой сначала проводят механохимическое взаимодействие компонентов бетулина с адипиновой кислотой в присутствии следов растворителя с последующим кипячением полученной массы в соответствующем растворителе. И если в указанной работе с использованием планетарно-центробежной мельницы “АГО-2” наблюдается образование целевого продукта – со-кристалла бетулина с адипиновой кислотой, то в нашем эксперименте при механообработке в агатовой ступке с последующим кипячением в различных растворителях, наблюдалось образование продукта деструкции ФБЗ. Степень деструкции зависит, по-видимому, от природы растворителя, их температур кипения и других физико-химических параметров. В тоже время при твердофазной обработке субстанции ФБЗ с полимерами с последующим хранением в плотно закрытой таре не наблюдается окисления ФБЗ даже в образцах 2015 и 2020 гг.

Из данных табл. 2 видно, что при твердофазной механообработке ФБЗ (основание) с ЯК (кислота) и полимером не наблюдается окисления ФБЗ.

Если при проведении механообработок с получением твердых дисперсий регистрировали стабильность субстанции ФБЗ, отсутствие химических взаимодействий, то при проведении комбинированных механообработок с использованием растворителей и получением смешанных кристаллов ФБЗ с ЯК, отмечали процессы окисления ФБЗ до его сульфоксида. При этом в зависимости от растворителя изменялся количественный состав полученных продуктов. Максимальное окисление ФБЗ до СО ФБЗ происходило в диоксане, а наибольшее содержание ФБЗ отмечено в ацетонитриле.

Результаты изучения нематодоцидной активности при экспериментальном трихинеллезе различных форм на основе ФБЗ представлены в табл. 3.

Анализ данных табл. 3 позволяет сделать выводы о том, что наиболее активными формами применения ФБЗ являются его ТД с ПВП и с АГ, тогда как с ЭС продукт оказывался менее активным. ТД на основе ФБЗ с ЯК оказалась менее активной, вопреки нашим ожиданиям на том основании, что при совместной механообработке ФБЗ с кислотами должны были образовываться более растворимые солевые формы. Смешанные кристаллы ФБЗ с ЯК обладали слабой активностью, несмотря на высокое содержание ФБЗ (75% и 95% соответственно).

Наибольшую активность ТД ФБЗ с полимерами, что можно объяснить образованием мелкодисперсных порошков, которые при растворении в воде образуют супрамолекулярные комплексы с повышенной растворимостью, что в свою очередь, увеличивает биодоступность и антигельминтную активность препарата (Arkhipov et al., 2019).

По предложенной технологии ранее получены препараты не только на основе ФБЗ и других бензимидазолкарбаматов (альбендазол, триклабендазол) (Чистяченко и др., 2014; Мусаев и др., 2017; Лагерева и др., 2019; Khalikov et al., 2020), но и субстанций антигельминтиков из других классов органических соединений – фенасал, празиквантел, ивермектин и пр. (Arkhipov et al., 2017; Марченко и др., 2019; Avgustinovitch et al., 2019; Meteleva et al., 2019; Мусаев и др., 2020; Marchenko et al., 2020, 2021). В наших работах было показано, что метод механохимической модификации плохо растворимых антигельминтных субстанций из различных классов органических соединений с помощью полимеров и растительных метаболитов позволил существенно изменить растворимость, биодоступность и эффективность препаратов (Khalikov et al., 2015; Мусаев и др., 2017; Arkhipov et al., 2019; Meteleva et al., 2019).

Так, супрамолекулярный комплекс фенбендазола с АГ в уменьшенной дозе 3.0 мг/кг по ДВ показал 100%-ю эффективность при диктиокаулезе, стронгилоидозе и стронгилятозах пищеварительного тракта и 98.3%-ную активность при трихоцефалезе овец (Варламова и др., 2016). Тогда как комплекс ФБЗ с ПВП при нематодозах овец в дозе 2.0 мг/кг по ДВ в форме 10%-ного порошка показал эффективность, равную 98.7% против нематодирусов и 99.2% против других видов стронгилят пищеварительного тракта, а также оказался эффективным в дозе 2.0 мг/кг по ДВ против стронгилят пищеварительного тракта овец, т.е. комплекс обладал в 2.5 раза большей антигельминтной активностью по сравнению с базовым препаратом – субстанцией фенбендазола. По результатам испытаний были сделаны рекомендации по использованию комплекса в ветеринарной практике при нематодозах овец (Arkhipov et al., 2019; Варламова и др., 2020, 2021).

Комплекс ФБЗ с экстрактом солодки обладал повышенной растворимостью, повышенным уровнем абсорбции и поступления в кровь ФБЗ и его метаболитов и увеличением в 2.3–2.5 раза их максимальной концентрации в крови и времени достижения этой концентрации. В результате эффективность комплекса на лабораторной модели T. spiralis составила 96.27% в дозе 2 мг/кг по ДВ по сравнению с 13.70%-й эффективностью самой субстанции ФБЗ в этой же дозе. Высокая эффективность комплекса наблюдалась против нематод при сниженной (в 2.5 раза) дозе по ДВ (Архипов и др., 2020; Varlamova et al., 2020).

Изучение нематодоцидной активности супрамолекулярных комплексов альбендазола с полисахаридами (АГ, ГЭК) и ПВП, проведенные на лабораторной модели трихинеллеза на белых мышах, экспериментально инвазированных T. spiralis, подтвердило их высокую эффективность (97.47–100.0%). Комплекс с АГ проявил 100%-ю эффективность при гименолепидозе мышей, он оказался активен против имагинальных цестод (Чистяченко и др., 2014; Халиков и др., 2015; Chistyachenko et al., 2015).

Эти данные указывают на то, что продукты механомодификации проявляют высокую эффективность в дозе, которая более чем в 3 раза меньше терапевтической дозы исходной субстанции, что мы объясняем увеличением растворимости и биодоступности ФБЗ.

При этом добавление ЯК в состав твердой дисперсии ФБЗ с ПВП не привело к ожидаемому росту биологической активности, не смотря на высокую растворимость (увеличение растворимости в 19 раз). Возможно в данном случае нам не удалось достигнуть повышения биодоступности комплекса ФБЗ : ПВП : ЯК. Хроматографический анализ показал стабильность ФБЗ в ТД состава ФБЗ : ЯК : : ПВП (1 : 1 : 3). В случае использования растворителей и процессов нагревания для получения смешанных кристаллов в хроматограммах были детектированы пики, характерные для метаболита ФБЗ и отмечено уменьшение концентрации ДВ. Значительного повышения антигельминтного действия на лабораторной модели не установлено.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты исследования подтверждают возможность получения новых препаратов фенбендазола с полимерами и низкомолекулярными веществами. При этом наряду с сохранением действующего вещества в одних случаях, наблюдаются также процессы окисления фенбендазола до его метаболита – сульфоксида фенбендазола при получении смешанных кристаллов ФБЗ с ЯК. Этот процесс зависит как от природы растворителя, так и условий проведения реакции взаимодействия ФБЗ с кислотами (в твердой фазе или в растворителе). Было установлено, что в субстанциях ФБЗ с полимерами, полученными по методу твердофазной механохимической модификации, не отмечено процессов окисления исходного действующего вещества, а также химических взаимодействий между лекарственным веществом и полимерами. ТД при растворении в воде образуют супрамолекулярные комплексы с большей биологической активностью, что и было подтверждено нами на лабораторной модели трихинеллеза белых мышей в отношении ТД ФБЗ с ПВП и ФБЗ с АГ.

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант № 22-26-20055), при поддержке Министерства науки и высшего образования РФ с использованием научного оборудования центра исследования строения молекул ИНЭОС РАН.