1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Известия РАН. Серия биологическая
  4. № 5, 2023

Известия РАН. Серия биологическая, 2023, № 5, стр. 531-536

Гистологическая оценка кожных покровов лабораторных крыс после термических повреждений и их коррекции наносекундными микроволновыми импульсами

А. А. Гостюхина 1, 3, 2, *, В. В. Ярцев 2, 4, 3, А. В. Самойлова 1, 4, 3, М. А. Большаков 1, 3, С. С. Евсеева 2, 3, В. М. Мочалова 3, К. В. Зайцев 2, О. П. Кутенков 1, В. В. Ростов 1

1 ФГУН Институт сильноточной электроники СО РАН
634055 Томск, пр. Академический, 2/3, Россия

2 ФГБУ Федеральный научно-клинический центр медицинской реабилитации и курортологии Федерального медико-биологического агентства
141551 д. Голубое, Солнечногорский р-н, Московская обл., Россия

3 ФГАОУВО “Национальный исследовательский Томский государственный университет”
634050 Томск, пр. Ленина, 36, Россия

4 ГБОУВПО “Сибирский государственный медицинский университет” Министерства здравоохранения Российской Федерации
634050 Томск, Московский тракт, 2, Россия

* E-mail: antariks-tomsk2015@yandex.ru

Поступила в редакцию 17.03.2022
После доработки 21.12.2022
Принята к публикации 13.02.2023

Полный текст (PDF)

Аннотация

На модели термического ожога кожных покровов лабораторных крыс показано, что после 4-кратного локального облучения наносекундным импульсно-периодическим микроволновым излучением (ИПМИ, 10 ГГц, длительность импульсов 100 нс, частота повторения импульсов 8 Гц, пиковая плотность потока мощности (пППМ) 140 Вт/см2) увеличивается скорость заживления ран за счет ускоренного образования грануляционной ткани и уменьшения толщины струпа, что обеспечивает безрубцовое заживление.

Ключевые слова: термический ожог, наносекундные импульсы, гистологический анализ, микроволновое излучение, лабораторные крысы

По данным Минздрава в Российской Федерации уровень ожоговых травм среди взрослого населения составляет в среднем 50 случаев на 100 тысяч человек, среди детей – 80 на 100 тысяч. Термические ожоги занимают третье место среди прочих травм и выделены в отдельную рубрику в международной классификации болезней по МКБ-10 (Алексеев и др., 2016). Глубокие и обширные ожоги могут приводить к серьезным осложнениям, таким как сепсис (с развитием бактериальной инфекции), шок (вызванный гиповолемией), а также сокращение рубцовой ткани после неправильного заживления раны (Shpichka et al., 2019).

В зоне ожоговой травмы неизбежно возникают инфицирование и воспаление, имеет место потеря белков, электролитов, воды, плазмы и другие варианты патологического реагирования. В связи с этим быстрое восстановление поврежденного кожного барьера является основным направлением лечения ожоговой патологии (Shpichka et al., 2019). Поскольку стандартная методика аутотрансплантации кожи имеет существенные ограничения и является дорогостоящей процедурой (Wood et al., 2006; Atiyeh, Costagliola, 2007), в последние годы предприняты попытки разработки новых способов регенерации ожоговых травм, к которым может относиться метод коррекции импульсным микроволновым излучением. В научном сообществе использование тех или иных видов электромагнитного излучения (ЭМИ) в коррекции и лечении кожных травм вызывает ряд противоречий. Тем не менее, имеются данные о применении, в частности, электронных пучков для стерилизации аллогенных кожных трансплантатов человека (Labus et al., 2022), о ранозаживляющем действии лазеротерапии (Rodrigo et al., 2009) и регенеративном влиянии импульсных радиочастотных излучений (Гапеев, Чемерис, 2007; Athanasiou et al., 2007; Strauch et al., 2009; Гапеев, 2012). В этом плане перспективным представляется использование наносекундного импульсно-периодического микроволнового излучения (ИПМИ), для которого уже установлена способность стимулировать репаративную регенерацию полнослойной кожной раны у лабораторных мышей (Князева и др., 2011). Кроме того, на предварительном этапе исследования данного фактора нами было показано, что наносекундное ИПМИ (10 ГГц, длительность импульсов 100 нс, частота повторения импульсов 8 Гц, пППМ 140 и 1500 Вт/см2) ускоряет процессы ранозаживления (Samoylova et al., 2020; Гостюхина и др., 2022). Оказалось, что наиболее эффективным с точки зрения скорости заживления ран является облучение с интенсивностью – 140 Вт/см2 (Гостюхина и др., 2022). Это представляет интерес для применения данного фактора в медицинской практике, поскольку указанный режим не превышает гигиенических уровней безопасного воздействия на организм (СанПиН 2.2.4/2.1.8.055-96., 1996). Таким образом, полученные результаты исследования динамики заживления ожоговых ран после термических повреждений и коррекции наносекундным ИПМИ у лабораторных крыс требовали гистологического подтверждения.

Цель настоящей работы – провести гистологическую оценку состояния кожи лабораторных крыс после термических повреждений и их коррекции наносекундными микроволновыми импульсами с пППМ 140 Вт/см2 и частотой повторения импульсов 8 Гц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспериментальное исследование выполнялось на 20 половозрелых самках крыс стока “Wistar” массой 230–250 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария при естественном световом режиме и на стандартном рационе со свободным доступом к воде и пище. Все процедуры с животными выполнялись в одно и то же время (с 9:00 до 11:00). Исследование проводилось в соответствии с этическими нормами работы с лабораторными животными (ETS № 123) и санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (Правила лабораторной практики в Российской Федерации). На проведение исследования получено разрешение Комиссии по биоэтике Биологического института НИ ТГУ (протокол № 15 от 14.06.2019 г.).

Экспериментальные животные случайным образом разделялись на две группы по 10 особей в каждой:

1. Контрольная группа (n = 10) – крысы, которые после моделирования термического ожога содержались в стандартных условиях вивария и не подвергались воздействию ИПМИ;

2. Опытная группа (n = 10) – крысы, которые после моделирования термического ожога подвергались однократно в течение четырех дней локальному воздействию наносекундным ИПМИ с пППМ 140 Вт/см2 с частотой повторения импульсов 8 Гц.

Моделирование термических ожогов. За сутки до моделирования ожога на дорсальной поверхности тела крысы осуществляли депиляцию участка кожи путем выбривания электрической ветеринарной машиной. Бритье и моделирование ожога проводили под СО2 наркозом. Термическую рану создавали прикладыванием без усилия на 30 с, разогретого до 100°С металлического стержня диаметром 2 см к поверхности кожи в межлопаточной области. Площадь повреждения в контрольной и опытной группах составляла в среднем 340 ± 18 мм2, что соответствует 8–9% от площади поверхности тела.

В течение всего эксперимента крысы содержались по две особи в специальных клетках, разделенных между собой прозрачной перегородкой для исключения контакта животных друг с другом и взаимного влияния на процесс заживления ожоговой раны. Наблюдение за процессом заживления ран после 4-кратного облучения осуществляли в динамике у контрольных и опытных крыс вплоть до образования келоидного рубца.

Динамику заживления термических ожогов оценивали с помощью электронного штангенциркуля по уменьшению площади участка поврежденной кожи (Князева и др., 2011; Гостюхина и др., 2022) и фиксировали фотокамерой Sony-DSC-F717 (Япония) с последующим анализом фотографий.

Облучение термических ожогов. Через 5 ч после формирования ожога ежедневно в течение 4 последующих дней ожоговые раны лабораторных крыс подвергали однократному воздействию наносекундным ИПМИ (4000 импульсов за сеанс/день, пППМ 140 Вт/см2, частота повторения импульсов 8 Гц). Для локального воздействия на термическую рану и устранения возможности облучения всего организма остальная часть тела животных укрывалась радиопоглощающим материалом. Продолжительность однократного облучения с указанными параметрами воздействия составляла 8 минут. В качестве источника ЭМИ использовался импульсный лабораторный СВЧ-генератор (несущая частота 10 ГГц, длительность импульсов на полувысоте 100 нс). Во время воздействий животные в специальных пластиковых контейнерах диаметром 10 см и длиной 30 см помещали на расстоянии 20 см от рупора антенны генератора, в зоне сформировавшейся волны ИПМИ. При радиочастотном электромагнитном воздействии возможен нагрев тканей и, соответственно, повышение температуры облучаемой ткани, поэтому во время воздействия с помощью волоконно-оптического термометра МТ-4МО-1 (Россия) осуществляли температурный контроль. При использованной интенсивности ИПМИ температура нагрева тканей в области раны не превышала 0.05°C. Выбор режима воздействия (длительность, пППМ, частота повторения) основан на результатах предыдущих исследований, как наиболее эффективно влияющего на скорость репаративной регенерации полнослойных кожных и термических ран (Князева и др., 2011; Гостюхина и др., 2022).

Гистологический анализ. На 30 день после моделирования термического ожога животных выводили из эксперимента путем передозировки СО2-наркоза. Для проведения гистологического анализа вырезали участок кожи, включающий пораженную и соседнюю интактную области. Гистологическую обработку материала проводили стандартными методиками (Коржевский, 2010; Exbrayat, 2013; Ярцев, 2019). После фиксации в 10% растворе забуференного формалина образцы кожи обезвоживали в растворах этанола возрастающей крепости (70, 95, 98%), просветляли в бутаноле и заливали в парафин. Срезы толщиной 5 мкм изготавливали на ротационном микротоме RMD-3000 (“MTPoint”, Россия) и переносили на предметные стекла с белок-глицериновым покрытием. Окраску полученных срезов осуществляли гематоксилином Майера–эозином и модифицированным азановым методом. Всего было получено 60 микропрепаратов. Микроскопию препаратов, изготовление снимков выбранных показательных образцов, а также измерения осуществляли с помощью микроскопа AxioLab A1, камеры AxioCamERc 5s и программы ZEN 2 (“CarlZeissMicroscop”, Германия).

На микрофотоснимках измеряли общую площадь исследуемого фрагмента (ПФ, мкм2), площадь грануляционной ткани (ПГТ, мкм2), разрывов в исследуемом фрагменте (ПР, мкм2), толщину новообразованного эпидермиса (ТЭ, мкм) или длину раны – расстояние между краями раны (ДР, мкм) – для ран с неполной эпителизацией. На основе первичных измерений рассчитывали относительную площадь грануляционной ткани (ОПГТ):

(1)
${\text{ОПГТ}} = {\text{ПГТ}} \times {{100} \mathord{\left/ {\vphantom {{100} {{\text{ПФ}}}}} \right. \kern-0em} {{\text{ПФ}}}} - {\text{ПР}}\left( \% \right).$

Для сравнения экспериментальных групп использовали показатели ТЭ, ДР, ОПГТ.

Статистическая обработка данных. В ходе статистической обработки результатов гистологического анализа рассчитывали: среднее значение ($\bar {x}$), минимум (min) и максимум (max), стандартное отклонение (σ), стандартную ошибку средней (${{m}_{{\bar {x}}}}$), коэффициент вариации (Cv), уровень значимости (p). Для оценки характера распределения использовали критерий Краскела–Уоллиса. Для сравнения результатов групп применяли точный критерий Фишера и тест Стьюдента. При проверке статистических гипотез достоверным считали уровень значимости менее 5% (p < 0.05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Гистологический анализ показал, что на 30-е сутки эксперимента после моделирования ожогов и 4х-кратного облучения наносекундным ИПМИ с пППМ 140 Вт/см2, с частотой повторения импульсов 8 Гц термические раны у всех исследованных групп животных находились в фазе регенерации (рис. 1).

Рис. 1.

Поперечные срезы центральной области ожоговых ран кожных покровов крыс контрольной (а, в) и опытной (б, г) групп на 30-е сутки заживления. Окраска модифицированным азановым методом НЭ – новообразованный эпидермис, ГТ – грануляционная ткань, ССД – сетчатый слой дермы.

В контрольной группе полная эпителизация ран была выявлена в 33% случаев. Относительная площадь грануляционной ткани (t-test: t = –2.2, p > 0.05) и толщина новообразованного эпидермиса (t-test: t = 1.4, p > 0.05) у крыс данной группы с незавершенной эпителизацией ран (67%) не отличались от таковых с полной эпителизацией.

У облученных животных (опытная группа) в 67% случаев установлена полная эпителизация ожоговых ран. В данной группе крысы с незавершенной эпителизацией ран статистически отличались от таковых с полностью эпителизированными ранами по толщине новообразованного эпидермиса (t-test: t = 1.21, p ≤ 0.05). Этот показатель оказался в 3.88 раза меньше толщины у животных с незавершенной эпителизацией раны (табл. 1).

Таблица 1.

Показатели поврежденного участка кожных покровов крыс на 30-е сутки эксперимента после моделирования ожоговой травмы и 4-кратного воздействия наносекундным ИПМИ

Группа Параметр
относительная площадь грануляционной ткани, мм2 толщина новообразованного эпидермиса, мкм длина раны, мм
$\bar {x} \pm {{m}_{{\bar {x}}}}$ $\bar {x} \pm {{m}_{{\bar {x}}}}$ $\bar {x} \pm {{m}_{{\bar {x}}}}$
Крысы с не полностью эпителизированными ранами после ожоговой травмы
Контрольные 0.50 ± 0.20 49.22 ± 21.15 2.19 ± 0.70
Опытные 2.39 ± 1.86 37.71 ± 53.32 4.85 ± 5.07
Крысы с полностью эпителизированными ранами после ожоговой травмы
Контрольные 0.27 ± 0.03 65.21 ± 10.31
Опытные 1.53 ± 1.05 146.33 ± 116.99

Сравнение показателей опытных и контрольных групп животных с не полностью эпителизированными ранами продемонстрировало статистически значимые различия по величине относительной площади грануляционной ткани (t-test: t = –2.37, p ≤ 0.05), в то время как по толщине эпидермиса различия отсутствовали (t-test: t = –1.87, p > 0.05). После облучения раны имели в 4.22 раза бо́льшую относительную площадь грануляционной ткани по сравнению с таковыми у контрольных животных (табл. 1).

В случае с полной эпителизацией ран животные опытной и контрольной групп отличались только по площади грануляционной ткани (t-test: t = –3.83, p < 0.05), которая была в 5.66 раз больше у животных после облучения (табл. 1).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты работы подтвердили ранее полученные данные о том, что воздействие наносекундным ИПМИ с интенсивностью 140 Вт/см2 с частотой повторения импульсов 8 Гц способствует ускорению процесса регенерации ожоговых ран (Гостюхина и др., 2022). По результатам гистологического анализа было установлено, что животные, термические травмы которых подвергались облучению, имели более выраженную степень эпителизации ран. При этом, вне зависимости от степени эпителизации у крыс после облучения наблюдался бо́льший размер области грануляционной ткани по отношению к контрольной группе.

Из литературных источников следует, что заживление кожных ран представляет собой сложное взаимодействие между разными типами клеток, цитокинами и нейрососудистой системой (Fox et al., 2008). Использование новых технологий регенерации ткани способно заметно улучшать восстановление кожи, в частности, посредством реэпидермизации, ангиогенеза и заселения гипертрофических рубцов и келоидов (Sakallioglu et al., 2006). Известно, что ЭМИ разных диапазонов и интенсивностей также способно стимулировать репаративную регенерацию в поврежденных тканях (Бессонов и др., 2000; Лушников и др., 2003; Rodrigo et al., 2009; Strauch et al., 2009) за счет усиления кальций-кальмодулинового связывания в клетках и активации NO-синтетазы (Pilla, 2008; Strauch et al., 2009). Поэтому, не исключено, что наносекундное ИПМИ обладает аналогичным биологическим эффектом.

Увеличение толщины новообразованного эпидермиса после облучения указывает на то, что возможный эффект воздействия ИПМИ связан с активацией фибробластов. Фибробласты, являясь основными клетками дермы, продуцируют коллаген, эластин и протеогликаны, важные компоненты межклеточного вещества, а также секретируют различные факторы роста (TGF-β) и цитокины (TNF-α) (Bainbridge, 2013; Tracy et al., 2016). Такой потенциальный набор мишеней влияет не только на элементы дермы, но и на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов (Wang et al., 2007). Помимо этого, фибробласты являются важным компонентом процесса ранозаживления, поскольку участвуют в образовании и увеличении размеров грануляционной ткани, что продемонстрировано в ходе гистологического исследования. Не исключено, что участие ИПМИ в активации фибробластов может быть важнейшим вариантом успешного ранозаживления.

Таким образом, полученная гистологическая картина регенерации кожных покровов крыс после моделирования термического повреждения и локального облучения наносекундным ИПМИ позволяет утверждать, что использование данного энергетического воздействия для заживления ран представляет перспективное направление для разработки новых технологий в области косметологии и комбустеологии. Для их успешного продвижения в практическое использование требуются соответствующие доклинические и клинические исследования.

Список литературы

  1. Алексеев А.А., Бобровников А.Э., Малютина Н.Б. Экстренная и неотложная медицинская помощь после ожоговой травмы // Медицинский алфавит. 2016. Т. 2. № 15(278). С. 6–12.

  2. Бессонов А.Е., Чемерис Н.К., Гапеев А.Б. Репаративная регенерация тканей под воздействием электромагнитных волн миллиметрового, инфракрасного и части видимого диапазонов, генерируемых терапевтическим аппаратом “Минитаг” НИР НЦИМ “ЛИДО” // Физ.-хим. основы информ. медицины. ИБК РАН. Пущино. 2000. С. 18.

  3. Гапеев А.Б., Чемерис Н.К. Механизмы биологического действия электромагнитного излучения крайне высоких частот на уровне организма // Биомедицинская радиоэлектроника. 2007. № 8–9. С. 30–46.

  4. Гапеев А.Б. Механизмы противовоспалительного и противоопухолевого действия низкоинтенсивного электромагнитного излучения крайне высоких частот // Миллиметровые волны в биологии и медицине. 2012. № 3. С. 3.

  5. Гостюхина А.А, Самойлова А.В, Большаков М.А., Мочалова В.М., Зайцев К. В., Кутенков О.П., Ростов В.В. Стимуляция заживления ожоговых ран у крыс наносекундным импульсно-периодическим микроволновым излучением // Известия РАН. Серия биологическая. 2022. № 5. С. 530–537. https://doi.org/10.31857/S1026347022050080

  6. Князева И.Р., Медведев М.А., Жаркова Л.П., Гостюхина А.А., Кутенков О.П., Ростов В.В., Большаков М.А. Действие наносекундного импульсно периодического микроволнового излучения на процессы регенерации // Бюллетень сибирской медицины. 2011. № 6. С. 109–113.

  7. Коржевский Д.Э. Основы гистологической техники. Санкт-Петербург: СпецЛит, 2010. 95 с.

  8. URL: http://sun.tsu.ru/limit/2016/000550786/000550786.pdf.

  9. Лушников К.В., Гапеев А.Б., Шумилина Ю.В. Снижение интенсивности клеточного иммунного ответа и неспецифического воспаления при действии электромагнитного излучения крайне высоких частот // Биофизика. 2003. Т. 38. № 5. С. 918–925.

  10. Ярцев В.В. Основы гистологической техники для зоологов: учебно-методическое пособие для биологических специальностей вузов [для студентов, обучающихся по направлению 06.04.01 Биология / авт.-сост.]. М-во науки и высш. образования, Нац. исслед. Том.гос. ун-т. Томск: Издательский Дом Томского государственного университета, 2019. 84 с.

  11. URL: http://vital.lib.tsu.ru/vital/access/manager/Repository/vtls:000660316.

  12. Athanasiou A., Karkambounas S., Batistatou A. The effect of pulsed electromagnetic fields on secondary skin wound healing: an experimental study // Bioelectromagnetics. 2007. V. 28. P. 362–368.

  13. Atiyeh B.S, Costagliola M. Cultured epithelial autograft (CEA) in burn treatment: three decades later // Burns. 2007. V. 33. P. 405–413.

  14. Bainbridge P. Wound healing and the role of fibroblasts // J. Wound Care. 2013. V. 22. № 8. P. 407–412.

  15. Exbrayat J.M. Classical methods of visualization. Histochemical and cytochemical methods of visualization / Boca Raton, London, N.Y.: CRC Press Taylor and Francis Group, 2013. 367 p.

  16. Fox A., Smythe J., Fisher N., Tyler M.P.H., Mcgrouther D.A., Watt S.M., Harris A.L. Mobilization of endothelial progenitor cells into the circulation in burned patients // Br J Surg. 2008. V. 95. P. 244–251.

  17. Labus W., Kitala D., Klama-Baryla A., Szapski M., Kraut M., Smętek W., Glik J., Kucharzewski M., Rojczyk E., Utrata-Wesolek A., Trzebicka B., Szeluga U., Sobota M., Poloczek R., Kamiński A. Influence of electron beam irradiation on extracellular matrix of the human allogeneic skin grafts J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2022. V. 110(3). P. 547–563. https://doi.org/10.1002/jbm.b.34934

  18. Pilla A. Proposed electrochemical mechanism of EMF modulation of tissue repair // Thebioelectromagnetic society 30th annual meeting abstract collection, San Diego, California. 2008. P. 147.

  19. Rodrigo S.M., Cunha A., Pozza D.H., Blaya D.S., Moraes J.F., Blessmann J.B. Weber, Oliveira M.G. Analysis of the systemic effect of red and infrared laser therapy on wound repair // Photomed Laser Surg. 2009. V. 27(6). P. 929–935. https://doi.org/10.1089/pho.2008.2306

  20. Sakallioglu E.A., Basaran O., Ozdemir B.H., Arat Z., Yucel M., Haberal M. Local and systemic interactions related to serum transforming growth factor- b levels in burn wounds of various depths // Burns. 2006. V. 32. P. 980–985.

  21. Samoylova A.V., Gostyukhina A.A., Rostov V.V., Bolshakov M.A., Zaitsev K.V., Kutenkov O.P. Dynamics of Burn Wound Healing in Rats Irradiated by Nanosecond Microwave Pulses // Biomedical J. Scientific and Technical Research. 2020. V. 32. № 2. P. 24791–24792.

  22. Shpichka A., Butnaru D., Bezrukov E.A., Sukhanov R.B., Atal A., Burdukovskii V., Zhang Yu., Timashev P. Skin tissue regeneration for burn injury // Stem Cell Research & Therapy. 2019. V. 10. № 94. https://doi.org/10.1186/s13287-019-1203-3

  23. Strauch B., Herman C., Dabb R., Ignarro L.J., Pilla A.A. Evidence-based use of pulsed electromagnetic field therapy in clinical plastic surgery // Aesthet. Surg. J. 2009. № 29(2). P. 135–143. https://doi.org/10.1016/j.asj.2009.02.001

  24. Tracy L.E., Minasia R.A., Caterson E.J. Extracellular matrix and dermal fibroblast function in the healing wound // Adv Wound Care. 2016. V. 5. P. 119–136.

  25. Wang J.H.C., Thampatty B.P., Lin J.S., Im H.J. Mechanoregulation of gene expression in fibroblasts. Gene. 2007. V. 391. P. 1–15.

  26. Wood F.M., Kolybaba M.L., Allen P. The use of cultured epithelial autograft in the treatment of major burn injuries: a critical review of the literature // Burns. 2006. V. 32. P. 395–401.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Известия РАН. Серия биологическая

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал