1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Известия РАН. Серия биологическая
  4. № 5, 2023

Известия РАН. Серия биологическая, 2023, № 5, стр. 520-530

Влияние pH на цитоморфологические параметры эритроцитов крови головастиков малоазиатской лягушки

Д. М. Гамидова 1, *, А. И. Рабаданова 1

Дагестанский государственный университет
367000 Махачкала, ул. Магомеда Гаджиева, 43а, Россия

* E-mail: Djamka_90@mail.ru

Поступила в редакцию 23.05.2022
После доработки 27.04.2023
Принята к публикации 28.04.2023

Полный текст (PDF)

Аннотация

В статье представлены результаты исследований влияния кислых (4.0, 5.0) и щелочной (9.0) значений рН на цитоморфологические параметры эритроцитов крови головастиков малоазиатской лягушки. Показано негативное влияние рН 4.0 на цитоморфологические особенности эритроцитов, выражающееся в уменьшении их геометрических параметров (площади, объема), что в итоге приводит к ухудшению выполняемой ими функции. Изменения линейных и геометрических параметров клеток крови головастиков при воздействии рН 5.0 и 9.0 в обеих сериях эксперимента позволяют судить об их направленности на повышение эффективности транспорта кислорода, то есть носят компенсаторный характер.

Ключевые слова: эритроциты, кислотность среды, рН, головастики, малоазиатская лягушка

Кислотность среды, являясь одним из важнейших абиотических факторов, оказывает значительное влияние на распространение и численность земноводных (Pough, Wilson, 1976; Böhmer, Rahmann, 1990; Pierce, Wooten, 1992; Griffiths, Wijer, 1994; Beebee, 1995; Pounds, 2001; Gardner, 2001; Muths et al., 2003; D’Amen et al., 2007). Согласно имеющимся данным колебания рН в кислую сторону часто сопровождается гибелью эмбрионов и сокращением процента вылупившихся личинок (Pough, Wilson 1976; Saber, Dunson 1978; Cooke 1981; Freda, Dunson 1985, Cummins 1986; Böhmer, Rahmann, 1990; Griffiths, Wijer, 1994), тогда как защелачивание среды приводит к снижению темпов роста и развитию аномалий у личинок амфибий (Griffiths, Wijer, 1994). До сих пор не выяснены механизмы подобного влияния. Остается открытым вопрос о том, какие системы организма и на какой стадии развития земноводных более подвержены негативному влиянию колебаний концентрации ионов водорода в среде, оказывает ли данный фактор прямое или опосредованное влияние на процессы жизнедеятельности.

Наиболее удобной и информативной моделью для выяснения этих вопросов являются эритроциты – клетки крови, чутко реагирующие на изменения факторов среды и от которых во многом зависит интенсивность метаболизма (Passantino, 2007; Davis, 2008а, 2008b; Claver Agustin, 2009). Одной из самых важных функций эритроцитов является перенос кислорода и углекислого газа, а их размер и форма являются показателями площади, доступной для газообмена.

В изученной нами литературе отсутствуют данные о влиянии рН на эритроциты крови личинок и взрослых особей амфибий. Большинство имеющихся данных описывают количественный состав (Arıkan 1989, 1990; Arserim, Mermer, 2008; Dönmez et al., 2009) и цитоморфологию (Atatür et al., 1999, Arıkan et al., 2001; Zhelev et al., 2006; Gao et al., 2007; Grenat et al., 2009а, 2009b) красных клеток крови взрослых представителей рода Rana. Несмотря на то, что данные клетки крови амфибий обладают высокой видоспецифичностью размеров (Gregory, 2001), результаты многих исследований показывают их изменчивость, обусловленную как загрязнением среды обитания, так и некоторыми другими факторами (Velcheva et al., 2006; Mueller et al., 2008; Kozlowski et al., 2010). Подобные вариации размеров эритроцитов многие авторы связывают с поверхностью, доступной для газообмена, поскольку в маленьком эритроците скорость газообмена быстрее, чем в крупном (Baraquet et al., 2014).

Исследования по изучению размеров эритроцитов у личинок амфибий единичны (Baraquet et al., 2014), что может быть связано с трудностями взятия у них крови. Тем более отсутствуют данные, учитывающие влияние различных факторов. Поскольку эффективность снабжения клеток кислородом определяет успешность протекания всех стадий онтогенеза, особенно личиночной, изучение изменения морфологии и морфометрии эритроцитов в период личиночного развития приобретает особую актуальность. Кроме того, личинки бесхвостых представляют интерес для изучения, поскольку они широко используются в качестве биоиндикаторов для обнаружения мутагенных агентов в воде (Шварц, 1968; Davis, 2008a; Baraquet, 2013; Замалетдинов и др., 2019).

Особый интерес представляет также изучение изменения размеров тела головастиков, а также связь между этими двумя параметрами у амфибий при действии разных значений рН. Сопоставление данных о действии разных значений рН на изменение размеров и формы эритроцитов головастиков, может дать более развернутую картину об оптимальных и лимитирующих значениях этого фактора для условий развития каждого отдельного вида.

Актуальность подобного рода исследований диктуется еще и тем, что в последние годы наряду с исчезновением многих редких видов земноводных, явно намечается тенденция к сокращению численности даже широко распространенных видов бесхвостых амфибий в некоторых районах Дагестана. Одним из таких видов является малоазиатская лягушка (Rana macrocnemis Boulenger, 1885), которая в Дагестане распространена в широком диапазоне высот от – 27 до 3200 м н.у.м. В основном она населяет горную часть республики, придерживаясь умеренно-увлажненных биотопов. Для нереста она предпочитает слабощелочные водоемы (Mazanaeva, 2000; Аскендеров, 2017). По нашим наблюдениям рН водоемов в предгорных и горных районах, где были обнаружены икринки и головастики, значительно варьирует. Это может быть вызвано действием многих факторов. При этом известна доминирующая роль земноводных в цепях питания. Поэтому изучение вопроса о возможных причинах сокращения данного вида является актуальным для экологической физиологии, аутэкологии и зоологии.

В связи с вышеизложенным целью данного исследования является изучение характера влияния разных значений рН на цитоморфологические особенности эритроцитов крови R. macrocnemis.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Условия содержания и выращивания эмбрионов и личинок Rana macrocnemis

Исследования проводились с конца февраля по июль 2020–2021гг. В работе использовались фрагменты из 6–7 только что отложенных кладок R. macrocnemis (3200 икринок), собранных на территории Предгорного Дагестана (с. Ерси, Табасаранский район, высота 600 м н.у.м.). Эксперимент включал две серии опытов, в которых использовалось по восемь контейнеров, размером 35 × 25 × 35 (42 л). В первой серии изучался весь цикл эмбрионально-личиночного развития малоазиатской лягушки от недавно отложенных икринок до окончания метаморфоза (полная резорбция хвоста). Для этого икринки размещались поштучно в шесть экспериментальных контейнеров с различными значениями пониженной (4.0 и 5.0) и повышенной (9.0) рН, а также в три контрольных контейнера с обычной для природных водоемов рН (7.5–8.2). Во второй серии исследовалось постэмбриональное развитие R. macrocnemis, для чего личинки (выращивались при нормальной рН) сразу после их перехода к активному питанию размещались в контейнеры с различными значениями рН (4.0, 5.0 и 9.0). Плотность посадки составила 200 икринок (в первой серии) и 200 головастиков (во второй серии) на 25 л воды.

Объекты содержались в фильтрованной воде, полностью заменявшейся каждый день, что способствовало сохранению оптимальных значений кислорода в воде. Личинок после перехода на экзогенное питание кормили листьями шпината, предварительно ошпаренными кипятком, и аквариумным кормом для рыб. Измеряли процент насыщения кислородом с помощью микропроцессорного портативного оксиметра Hanna “HI 9145”, температуры с помощью аквариумных термометров “Barbus”, а также кислотность (с использованием карманного рН метра – рН Мeterrange 0.00–14.00). Поскольку известно, что уровень рН постоянно меняется в зависимости от многих факторов, тестовые значения рН создавались и поддерживались путем добавления H2SO4 и NaOH, которые готовились из 0.1Н стандарт/фильтров фиксанала после каждой смены воды. Измерение рН в контейнерах производилось 4 раза в день. При этом его изменения были незначительными.

В ходе эксперимента температура в помещении увеличивалась от 18°С в начале развития до 26°С – в конце. Подобное изменение температурного режима характерно и для природных условий. Концентрация кислорода в чистой фильтрованной воде в контейнерах при температуре около 24°С составляла 7.9 мг/л. Дополнительное снабжение воды кислородом не производилось, поскольку по литературным данным такая процедура не улучшает условий для развития икры и головастиков, так как связана с их сильным стрессом (Сурова, 2010). При измерении содержания кислорода было учтено количество особей на единицу объема (250 мл на 2 головастика). Это соотношение поддерживалось на протяжении всего эксперимента.

Измерение морфометрических параметров. На 28–30 стадиях личиночного развития у 20 случайно выловленных личинок в каждой серии при различных рН производилось измерение линейно-весовых параметров. Для измерения общей длины личинок использовали штангенциркуль Electronic Digitalcaliper “DEKO” (с точностью 0.1 мм). Масса икринок измерялась с помощью торсионных весов “VT-500”, вес личинок определялся с помощью электронных весов “Масса-К” (c погрешностью 0.005 г).

Кровь для мазков брали через прямой прокол в сердце головастика на 28–30 стадиях развития (Gosner, 1960), после предварительного усыпления.

Для определения размеров эритроцитов и их ядер готовили мазки крови общепринятым гематологическим методом и окрашивали по Романовскому–Гимзе. Готовые мазки просматривали с иммерсией, при увеличении 1600. Измерения эритроцитов и ядер проводили через видеокуляр “ToupCam 14.0 MP”, который встраивали в стереоскопический микроскоп МСП-1 “ЛОМО”. Полученные изображения обрабатывались с помощью программного обеспечения TopView.

Для расчета объема эритроцитов была использована следующая формула: $V = \frac{4}{3}\pi a{{b}^{2}},$ где $V$ – объем, $a$ – длинная полуось, b – короткая полуось эллипса. Толщину эритроцитов вычисляли по формуле: $T = \frac{{\pi b}}{4}.$ При вычислении сферического индекса (E) была использована формула: $E = \sqrt {1 - {{{\left( {\frac{b}{a}} \right)}}^{2}}} .$

Площадь эритроцитов и ядер оценивали, принимая их форму за эллипсоидальную, и рассчитывали соотношение сторон, отражающее форму клетки. На основании полученных данных подсчитали ядерно-цитоплазматическое отношение ЯЦО) по формуле Sя/Sц, Sя – площадь ядра, Sц – площадь клетки.

Статистическая обработка данных. Различия между исследуемыми выборками определяли в результате регрессионного анализа данных в программе Excel 10 и Statistica 10. Достоверность различий оценивалась с использованием критерия Стьюдента (t), для выборок с нормальным распределением (р ≤ 0.05). Рассчитывали среднее арифметическое по каждому морфометрическому параметру (Mean и стандартное отклонение SD). Нормальность распределения оценивали критериями Шапиро–Уилка, асимметрии и эксцесса. Для выборок с ненормальным распределением использовали непараметрический критерий Манна–Уитни. Рассчитывали коэффициент корреляции (r) и коэффициент вариации (CV). Влияние разных значений рН на исследуемые параметры у головастиков определяли на основе однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Эритроциты головастиков малоазиатской лягушки имеют овальную форму с центрально расположенным овальным ядром. Длина эритроцитов в контроле в среднем составляет 18.3 ± 1.7 мкм, ширина – 13.3 ± 1.5 мкм. Длина и ширина ядер колеблется в пределах 8.9 ± 1.4 и 7.2 ± 1.0 мкм соответственно. Соотношение L/W при таких значениях длины и ширины эритроцитов составляет 1.4 ± 0.1, а показатель сферичности (Е) равен 0.7 ± 0.1 (табл. 1).

Таблица 1.  

Цитоморфологические параметры эритроцитов и их ядер Rana macrocnemis при воздействии разных значений рН

рН Эритроциты
L W L/W V S S/V T E
к 7.8 18.3 ± 1.7 13.3 ± 1.5 1.4 ± 0.1 444.5 ± 96.2 194.1 ± 36.9 0.44 ± 0.1 5.2 ± 0.6 0.7 ± 0.1
1 5 17.0 ± 1.2 10.6 ± 0.8 1.6 ± 0.1 250.0 ± 36.2 141.1 ± 13.1 0.56 ± 0.1 4.1 ± 0.3 0.8 ± 0.1
9 19.5 ± 1.5 11.3 ± 1.3 1.8 ± 0.2 335.1 ± 90.4 173.7 ± 28.2 0.52 ± 0.2 4.4 ± 0.5 0.8 ± 0.1
2 4 17.6 ± 1.5 13.3 ± 1.2 1.3 ± 0.5 419.9 ± 96.8 185.8 ± 27.2 0.44 ± 0.1 5.2 ± 0.5 0.6 ± 0.1
5 19.6 ± 2.1 12.3 ± 1.7 1.7 ± 0.3 398.9 ± 97.9 189.3 ± 31.9 0.47 ± 0.1 4.8 ± 0.7 0.7 ± 01
9 19.2 ± 2.0 12.5 ± 1.4 1.6 ± 0.2 410.2 ± 97.1 190.6 ± 35.8 0.47 ± 0.1 4.9 ± 0.5 0.7 ± 0.1
Ядра эритроцитов
к 7.8 8.9 ± 1.4 7.2 ± 1.0 1.2 ± 0.2 65.3 ± 24.9 51.8 ± 13.1 0.80 ± 0.2 2.8 ± 0.4 0.6 ± 0.1
1 5 8.4 ± 1.1 5.7 ± 0.8 1.5 ± 0.4 36.9 ± 10.6 37.7 ± 6.4 1.03 ± 0.1 2.3 ± 0.3 0.7 ± 0.2
9 10.3 ± 1.4 7.1 ± 0.8 1.5 ± 0.3 70.2 ± 19.8 57.7 ± 10.6 0.82 ± 0.1 2.8 ± 0.3 0.7 ± 0.1
2 4 7.9 ± 1.1 6.1 ± 0.8 1.3 ± 0.3 39.8 ± 12.1 38.1 ± 7.6 0.96 ± 0.1 4.8 ± 0.6 0.5 ± 0.3
5 9.9 ± 1.4 7.0 ± 1.3 1.5 ± 0.4 67.7 ± 26.1 54.7 ± 12.8 0.81 ± 0.1 2.8 ± 0.5 0.6 ± 0.1
9 8.8 ± 1.1 7.1 ± 0.9 1.3 ± 0.2 60.9 ± 19.2 49.6 ± 10.5 0.82 ± 0.1 2.8 ± 0.3 0.5 ± 0.2

Примечание. Жирный шрифтом выделены достоверно значимые отличия (р ≤ 0.05) между сериями; _ – достоверно значимые отличия (р ≤ 0.05) от контроля; L – длина, W – ширина, V – объем, S – площадь, S/V – соотношение площади поверхности к объему, T – толщина, E – индекс сферичности.

При содержании головастиков в среде с различными значениями рН в обеих сериях опыта наблюдаются статистически значимые отличия от контроля (р ≤ 0.05). Так, в первой серии при рН 5.0 длина и ширина эритроцитов достоверно снижаются и составляют 17.0 ± 1.2 и 10.6 ± 0.8 мкм соответственно. В щелочной среде (рН 9.0) длина эритроцитов, напротив, увеличивается до 19.5 ± ± 1.5 мкм, а ширина уменьшается до 11.3 ± 1.3 мкм. Несмотря на такое противоположное влияние разных значений рН на линейные размеры эритроцитов, в обоих случаях отмечается их удлинение, на что указывает увеличение соотношения L/W до 1.6 ± 0.1 (рН 5.0) и 1.8 ± 0.2 (рН 9.0), а также индекса сферичности – до 0.8 ± 0.1.

Во второй серии эритроциты головастиков, содержащихся при рН 4.0, имеют длину 17.6 ± 1.5 мкм, что достоверно меньше контрольных значений. Ширина клеток крови при этом не изменяется. Подобная динамика приводит к уменьшению индекса сферичности до 0.6 ± 0.1, не влияя на соотношение L/W. При двух других значениях рН (5.0 и 9.0) наблюдается сходная тенденция: длина эритроцитов достоверно увеличивается, а ширина – снижается, что приводит к повышению соотношения L/W без изменения индекса сферичности.

Различия обнаруживаются также при распределении значений длины и ширины клеток (рис. 1). Так, в первой серии опытов наиболее широкий диапазон длины (14–24 мкм) и ширины (7–16 мкм) клеток крови наблюдается при рН 9.0. При этом наиболее высока встречаемость эритроцитов с длиной 18–20 мкм и шириной 10–11 мкм. У головастиков, выращиваемых в кислой среде (рН 5.0), длина и ширина эритроцитов варьируют в меньшем диапазоне 14–21 и 8.5–12.5 мкм соответственно. Наиболее часто встречающаяся длина красных клеток при этом составляет 16–17 мкм, ширина – 11.0–11.5 мкм. То есть в кислой среде намечается тенденция к уменьшению длины эритроцитов и увеличению их ширины, а также уменьшению диапазона распределения.

Рис. 1.

Частота встречаемости параметров длины и ширины) эритроцитов (мкм) Rana macrocnemis при разных рН в двух сериях: а, б – первая, в, г – вторая и в контроле.

Во второй серии опытов наименьший диапазон распределения по длине эритроцитов отмечен в среде с рН 4.0 (13–22 мкм), по ширине – в среде с рН 5.0 (6–18 мкм). В остальных условиях распределение длины колеблется от 12 до 26 мкм. Диапазон распределения эритроцитов по ширине меньше, чем в контроле и составляет при рН 4.0 – 9–17 мкм, при рН 9.0 – 8–16 мкм. При этом в средах с изменением рН отмечается увеличение средних размеров эритроцитов без явно выраженной зависимости от значений кислотности среды.

Наблюдаемые изменения линейных значений эритроцитов отразились на их геометрических параметрах (объеме, площади, толщине), от которых зависит эффективность транспорта кислорода. В обеих сериях опыта объем эритроцитов снижается относительно контроля при всех значениях рН, особенно при рН 5.0. Так, в 1 серии опытов объем клеток крови ниже контрольных значений в 1.7 раз (р ≤ 0.05), во второй – в 1.1 раза (р ≤ 0.05). Что касается площади, то значения данного параметра ниже контроля в 1 серии опытов, особенно при рН 5.0 (на 27.3%, р ≤ 0.05). Во второй серии изменения площади относительно контроля незначительны (рис. 2). Сходная тенденция характерна и для толщины красных клеток крови.

Рис. 2.

Частота встречаемости параметров объема и площади эритроцитов (мкм) Rana macrocnemis при разных рН в двух сериях: а, б – первая, в, г – вторая и в контроле.

Распределение эритроцитов по объему и площади в контроле составляет 200–1000 мкм3 и 100–350 мкм2 соответственно (наиболее часто встречаются эритроциты объемом 300–400 мкм3 и площадью 150–200 мкм2). Наиболее существенное влияние на диапазон распределения объема и площади рН оказывает в первой серии опытов. При рН 5.0 данный показатель сужается и составляет 150–400 мкм3 и 100–190 мкм2 соответственно (наиболее часто встречаются эритроциты объемом 200–300 мкм3 и площадью 130–140 мкм2). При рН 9.0 распределения по объему составляет 100–600 мкм3 (чаще встречаются эритроциты объемом 200–300 мкм3), по площади – 100–240 мкм2 (наиболее часто встречаются эритроциты площадью140–160 мкм2).

Обращает на себя внимание тот факт, что на фоне уменьшения, как объема, так и площади эритроцитов в первой серии мы наблюдаем повышение соотношения S/V, что указывает на увеличение поверхности эритроцита в единицу объема. Это позволяет эритроцитам легче менять свою форму (увеличивается степень их деформации) и проходить через узкие капилляры, что улучшает транспортные функции крови. Кроме того, при высоком соотношении площади и объема любая молекула гемоглобина ближе располагается к поверхности, что совместно с уменьшением толщины эритроцитов (табл. 1) обеспечивает максимально ускоренный газообмен. Это позволяет рассматривать подобные изменения как компенсаторную реакцию на сдвиги значений рН, как в кислую, так и в щелочную сторону.

Уменьшение геометрических параметров эритроцитов при действии рН 4.0; 5.0 и 9.0 во второй серии, однако, не приводит к изменению соотношения S/V, что также может указывать на компенсаторный характер изменений, приводящих к оптимальному соотношению размеров эритроцитов для эффективного выполнения газотранспортной функции.

Таким образом, геометрические параметры особенно подвержены изменениям в первой серии опытов, что указывает на снижение кислородтранспортной функции крови при действии кислых значений рН 4.0, начиная с эмбрионального периода развития. Это подтверждается данными дисперсионного анализа, который отражается влияние рН на все исследуемые линейные и геометрические параметры (в среднем R ≥ 50%, табл. 2). Изменения же во второй серии опытов носят компенсаторный характер, что подтверждается отсутствием данного влияния на параметры, характеризующие кислородтранспортную функцию – площадь, объем, толщину и ширину эритроцитов.

Таблица 2.  

Влияние разных значений рН на цитоморфологические особенности эритроцитов и параметры длины и веса тела головастиков Rana macrocnemis

Серии Эритроциты Головастики
L W V S S/V T E m l
1 р = 0.000 р = 0.000 р = 0.000 р = 0.000 р = 0.000 р = 0.000 р = 0.000 р = 0.597 р = 0.846
2 р = 0.010 р = 0.201 р = 0.946 р = 0.880 р = 0.040 р = 0.201 р = 0.000 р = 0.000 р = 0.000

Примечание. Влияние фактора рассматривается при р ≤ 0.05; L – длина, W – ширина, V – объем, S – площадь, S/V – соотношение площади поверхности к объему, T – толщина, E – индекс сферичности, m – масса головастиков, l – длина головастиков.

Исследование размеров ядер эритроцитов выявило достоверно значимые отличия не по всем исследуемым параметрам (см. табл. 1). Так, в первой серии опытов при рН 5.0 наблюдается значительное уменьшение ширины ядер (на 20.8%, р ≤ 0.05) что приводит к увеличению соотношения L/W до 1.5 ± 0.4 и индекса сферичности до 0.7 ± 0.2. Это указывает на удлинение ядер. При таких значениях длины и ширины практически уравниваются значения площади и объема ядер (36.9 ± 10.6 и 36.6 ± 6.4 мкм2 соответственно), что сопровождается повышением соотношения S/V до 1.03. При рН 9.0 ядра также приобретают элипсоидную форму, но уже за счет значимого увеличения их длины при незначительном уменьшении ширины, что в итоге приводит к тому же отношению L/W, как и при рН 5.0 (1.5 ± 0.3). Однако при таких линейных размерах отмечается увеличение площади и объема ядер (до 57.7 ± 10.6 и 70.2 ± 19.8 мкм2 соответственно), что сопровождается приближением соотношения S/V к значению контроля (0.82 ± 0.1).

Во второй серии наблюдаемые изменения носят разнонаправленный характер. Наибольшее влияние на размеры ядер эритроцитов оказывает рН 4.0. В данной среде наблюдается достоверно значимое уменьшение длины и ширины ядер, что не приводит, однако, к изменению их соотношения, которое составляет 1.3 ± 0.3 (как и в контроле). Однако, указанное изменение линейных размеров ядер сопровождается уменьшением их площади и объема до примерно одинаковых значений (39.8 ± 2.1 и 38.1 ± 7.6 мкм3) и приближению их соотношения к 1. При влиянии рН 5.0 и 9.0 изменение большинства параметров не являются достоверно значимыми.

Важной морфологической характеристикой эритроцитов, позволяющей оценить уровень метаболизма и выявить проявление компенсаторных реакций, является ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО), который определяется соотношением площади ядра (Sя) и площади клетки (Sц). Результаты расчетов представлены в табл. 3.

Таблица 3.  

Изменение ядерно-цитоплазматического индекса эритроцитов Rana macrocnemis при действии различных значений рН

рН Sц, мкм Sя, мкм ЯЦО
Контроль 7.8 142.3 ± 10.5 51,8 ± 13.1 0.36 ± 0.01
1 серия 5.0 103.4 ± 9.6 37.7 ± 6.4* 0.36 ± 0.01
9.0 116.0 ± 7.7 57.7 ± 10.6 0.39 ± 0.03
2 серия 4.0 147.7 ± 11.2 38.1 ± 7.6* 0.26 ± 0.01
5.0 134.6 ± 10.1 54.7 ± 12.8 0.41 ± 0.02*
9.0 141.0 ± 13.1 49.6 ± 10.5 0.35 ± 0.01

Примечание. Жирным шрифтом выделены статистически значимые отличия от контроля; * – между сериями.

Как видно из представленных данных в контроле ЯЦО составляет 0.36 ± 0.01. Такие же значения обнаружены в первой серии независимо от значения рН. Во второй серии отмечено снижение данного показателя до 0.26 ± 0.01 при рН 4.0 и повышение до 0.41 ± 0.02 – при рН 5.0. Повышение ЯЦО может оказывать влияние на интенсивность газообмена, диффузию кислорода сквозь мембрану эритроцита и как следствие кислородную емкость клетки (Bondarieva et al., 2012; Донкова, Рубай, 2017).

А.К. Дэвис (Davis, 2008b, М. Дас и П.К. Махапатра (Das, Mahapatra 2012) в своих исследованиях указывают на то, что размеры эритроцитов меняются при росте и метаморфозе личинок амфибий. Однако, эта закономерность выявлена без учета воздействия условий среды, в частности, рН. В наших исследованиях масса тела головастиков в обеих сериях опытов увеличивается при рН 9.0 на 22.1–23.7%. Во второй серии при рН 4.0 масса тела, напротив, снижается на 39.5% (р ≤ 0.05), что отражается на данных дисперсионного анализа (см. табл. 2–3). В тоже время изменение рН не оказывает существенного влияния на длину тела личинок малоазиатской лягушки (достоверное снижение на 15.2% отмечено только при рН 4.0 (табл. 2). При этом в первой серии опытов корреляции с размерами эритроцитов не выявлено, тогда как во второй серии отмечена слабая отрицательная связь, (r = 0.5) между массой тела головастиков и шириной при рН 9.0. В остальных случаях средняя корреляционная связь (r = 0.6) обнаружена только при рН 5.0 в первой серии между массой и длиной тела головастиков (рис. 3).

Рис. 3.

Корреляционный анализ между массой (m) и длиной тела головастиков (l) при рН 5.0 (а), массой тела и шириной эритроцита (W) при рН 9.0 (б) у Rana macrocnemis.

Таблица 4.  

Длина (мм) и масса тела, (мг) Rana macrocnemis при воздействии различных значений рН

Параметры Контроль 1 серия 2 серия
рН 5 рН 9 рН 4 рН 5 рН 9
l 26.4 ± 2.0 26.3 ± 1.9 26.5 ± 3.6 22.4 ± 2.6* 27.0 ± 3.9 27.1 ± 4.6
m 189.9 ± 61.1 191.5 ± 56.8 231.7 ± 84.9* 115.3 ± 27.2* 176.3 ± 50.4 235.2 ± 91.7*

Примечание. Жирным шрифтом выделены достоверно значимые отличия (р ≤ 0.05) между сериями; * – достоверно значимые отличия (р ≤ 0.05) от контроля; l – длина тела, m – масса тела.

В ходе корреляционного анализа в двух сериях между длиной и шириной эритроцитов и их ядер связь выявлена только в контроле (r = 0.5). Между остальными исследуемыми параметрами отмечены средние (r ≥ 0.5) и высокие (r ≥ 0.8) положительные корреляционные связи, значения коэффициентов которых приближены к контрольным (рис. 4), за исключением отсутствия связи между длиной и объемом ядер. Однако в первой серии при обоих значениях рН (5.0 и 9.0) выявлена отрицательная корреляция между объемом и сферичностью (r = 0.6), а также толщиной и сферичностью (r = 0.7–0.8) эритроцитов (рис. 4а) и их ядер (рис. 4б). Во второй серии между этими же параметрами такой же характер связи отмечается при рН 5.0. Следует отметить, что в контроле эти параметры между собой не коррелируют (рис. 4).

Рис. 4.

Коэффициенты корреляции между параметрами эритроцитов (а), ядра (б) и эритроцит/ядро (в).

Разнонаправленный характер имеют данные, полученные при корреляционном анализе параметров эритроцитов и их ядер (рис. 4в). Разнонаправленный характер имеют данные корреляционного анализа между параметрами эритроцитов и их ядер (рис. 4в). Так, если в контроле наблюдается средняя корреляционная связь между большинством параметров (r = 0.5), то при кислых значениях рН (4.0 и 5.0) в обеих сериях она полностью отсутствует. Исключение отмечается между сферичностью эритроцитов и их ядер при тех же значениях рН во второй серии. Более близкие значения к контролю отмечаются при рН 9.0 в первой серии. Изменения морфологии эритроцитов при изменении рН среды явно требует дальнейших исследований для выяснения физиологического механизма и последствий этих изменений. Наши результаты могут быть полезны в качестве эталонных значений для будущих исследований, а также могут быть использованы в сочетании с другими гематологическими параметрами для изучения изменений, происходящих в клетках крови во время метаморфозы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Кислотность среды является важным абиотическим фактором, лимитирующим рост и развитие водных организмов. В связи с неуклонным ростом антропогенной нагрузки на водные экосистемы данный показатель подвержен значительным колебаниям, что, несомненно, приводит к сдвигу многих параметров гидробионтов и необходимости включения механизмов адаптации. Перспективным представляется изучение механизмов адаптации на клеточном уровне. Наиболее удобной моделью в этом плане являются эритроциты крови, от которых зависит транспортировка кислорода, а значит и интенсивность метаболических процессов.

В наших исследованиях показано, что влияние кислотности среды сопровождается характерными изменениями цитоморфологии эритроцитов головастиков малоазиатской лягушки. Во многом эти изменения зависят от того с эмбрионального (1 серия) или личиночного (2 серия) периодов началось влияние разных значений рН.

Изменение линейных размеров эритроцитов в первой серии при воздействии как кислых, так щелочных значений рН приводит к увеличению соотношения L/W и индекса сферичности. Это сопровождается уменьшением объема и площади эритроцитов и повышением соотношения S/V. Кроме того, отклоненные от нормы значения рН сужают диапазон изменений длины и ширины эритроцитов.

Во второй серии динамика размеров эритроцитов при рН 4.0 сопровождается уменьшением соотношения L/W и индекса сферичности. При двух других значениях рН (5.0 и 9.0) наблюдается повышение данного соотношения, не сопровождающееся, однако, изменением индекса сферичности. В этой серии также не обнаружено изменение поверхности эритроцита в единицу объема, несмотря на уменьшение объема и площади эритроцитов.

Подобные изменения указывают на негативное влияние рН 4.0 на цитоморфологические особенности эритроцитов, действие которого, по-видимому, связано с более глубокими изменениями, затрагивающими молекулярный, клеточный и организменный уровни. В частности, в наших предыдущих исследованиях показано, что данные значения рН снижают выживаемость головастиков, уменьшают процент вылупления и замедляют метаморфоз.

Влияние же других значений рН (5.0 и 9.0) вызывает адаптивный эффект, выражающийся в итоге в повышении эффективности транспорта кислорода, хоть и достигается это разными модификациями линейных и геометрических параметров эритроцитов.

Список литературы

  1. Аскендеров А.Д. Земноводные Дагестана: распространение, экология, охрана: дис. … канд. биол. наук. Ин-т экологии Волжского бассейна РАН, 2017. 223 с.

  2. Донкова Н.В., Рубай А.А. Цитологические и морфометрические особенности клеток крови тритона до и после тотальной резекции конечностей // Вестник КрасГАУ. 2017. № 6. С. 57–64.

  3. Сурова Г.С. Изменение абиотических условий при содержании головастиков с разной плотностью (на примере личинок травяной лягушки-Rana temporaria и серой жабы-Bufo bufo) // Совр. герпетология. 2010. Т. 10. № 1/2. С. 26–39.

  4. Замалетдинов Р.И., Назаров Н.Г., Свинин А.О., Дробот Г.П., Сальникова Е.Ю. Биохимические особенности периферической крови особей прудовой лягушки Pelophylax lessonae (Camerano, 1882) из популяций, населяющих водоемы города Казани // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. 2019. № 1(25). С. 41–49. https://doi.org/10.21685/2307-9150-2019-1-5

  5. Шварц С.С. Метод морфофизиологических индикаторов в экологии наземных позвоночных. Свердловск, 1968. 386 с.

  6. Arikan H. Anadolu’daki Rana ridibunda (Anura, Ranidae) populasyonlarinin kan hücrelerinin sayisi bakimindan incelenmesi // Turkish J. zoology, Ankara. 1989. V. 13. P. 54–59.

  7. Arikan H. Rana ridibunda (Anura, Ranidae) populasyonlari üzerinde morfolojik ve serolojik aratirmalar // Turkish J. zoology, Ankara. 1990. V. 14. P. 40–83.

  8. Arikan H., Çevik E.E., Kaya U., Mermer A. Anadolu’daki dag kurbagalarinda eritrosit ölçümleri // Anadolu university Journal of science and Technology, Eskiehir. 2001. V. 2. P. 387–391.

  9. Atatür M.K., Arikan H., Çevik E.E. Erythrocyte sizes of some anurans from Turkey // Turkish J. zoology, Ankara. 1999. V. 23. P. 111–114.

  10. Arserim S.K., Mermer A. Hematology of the Uludağ Frog, Rana macrocnemis Boulenger, 1885 in Uludağ National Park (Bursa, Turkey). E.U. Turk. // J. Fish. Aquat. 2008. Sc. 25. 39–46.

  11. Baraquet M. Intraspecific variation in erythrocyte sizes among populations of Hypsiboas cordobae (Anura: Hylidae) // Acta Herpetologica. 2013. № 8(2) P. 93–97. https://doi.org/10.13128/Acta_Herpetol-12954

  12. Baraquet M., Salas N.E., Martino A.L. Variation in the erythrocyte size among larvae, juveniles and adults of Hypsiboas cordobae(Anura, Hylidae) // Basic and Applied Herpetology. 2014. V. 28. P. 137–143. https://doi.org/10.11160/bah.12010

  13. Beebee T.J.C. Amphibian breeding and climate. Nature. 1995. V. 374. P. 219–220.

  14. Bondarieva A., Bibik Y.S., Samilo S.M., Shabanov D.A. Erythrocytes cytogenetic characteristics of green frogs from Siversky Donets centre of Pelophylax esculentus complex diversity // KarazinKharkiv Natl. Univ. Ser. Biol. 2012. V. 15. P. 116–123.

  15. Böhmer J., Rahmann H.Influence of surface water acidification on Amphibia // Fortsch. Zool. 1990. V. 38. P. 287–309.

  16. Claver J.A., Agustin I.E., Comparative Morphology, Development, and Function of Blood Cells in Nonmammalian Vertebrates // J. Ex. Pet Medicine. 2009. V. 18. P. 87–97. https://doi.org/10.1053/j.jepm.2009.04.006

  17. Cooke A.S. Tadpoles as indicators of harmful levels of pollution in the field // Environ. Pollut. 1981. V. 25. P. 23–133.

  18. Cummins C.P. Effects of aluminium and low pH on growth and development in Rana temporaria tadpoles // Qscologiab (Berlin). 1986. V. 69. P. 248–252.

  19. D’Amen M., Vignoli L., Bologna M.A. The effects of temperature and pH on the embryonic development of two species of Triturus (Caudata: Salamandridae) // Amphibia-Reptilia. 2007. V. 28. P. 295–300. https://doi.org/10.1163/156853807780202521

  20. Das M., Mahapatra P.K. Blood cell profiles of the tadpoles of the Dubois’s tree frog, Polypedates teraiensis Dubois, 1986 (Anura: Rhacophoridae) // Scientific World J. 2012. 701746. https://doi.org/10.1100/2012/701746

  21. Davis A.K. The use of leukocyte profiles to measure stress in vertebrates: a review for ecologist // Functional Ecology. 2008a. V. 22. P. 760–772. https://doi.org/10.1111/j.1365-2435.2008.01467.x

  22. Davis A.K. Ontogenetic changes in erythrocyte morphology in larval mole salamanders, Ambystoma talpoideum, measured with image analysis // Comp Clin Pathol. 2008б. V. 17. P. 23–28. https://doi.org/10.1007/s00580-007-0702-2

  23. Dönmez F., Tosunoğlu M., Gül Ç. Hematological values in hermaphrodite, Bufo bufo (Linnaeus, 1758) // NorthWestern J. Zoology. 2009. V. 5. P. 97–103.

  24. Freda J., Dunson W.A. Field and laboratory studies of ion balance and growth rates of Ranid tadpoles chronically exposed to low pH // Copeia 1985. P. 415˗423.

  25. Gao Z., Wang W., Abbas K., Zhou X., Yang Y., Diana J.S., Wang H., Wang H., Li Y., Sun Y. Haematological characterization of loach Misgurnus anguillicaudatus: Comparison among diploid, triploid and tetraploid specimens // Comp. Bio. Phys. A. 2007. V. 147. P. 1001–1008. https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2007.03.006

  26. Gardner T. Declining amphibian population: a global phenomenon in conservation biology // Animal Biodiversity and Conservation. 2001. V. 24.2. P. 25–44.

  27. Gosner K.L. A simplified table for staging anuran embryos and larvae with notes on identification // Herpetologica. 1960. V. 16. P. 183–190.

  28. Gregory T.R. The bigger the value, the larger the cell: genome size and red blood cell size in vertebrates // Blood Cells, Molecules, and Diseases. 2001. V. 27. P. 830˗843. https://doi.org/10.1006/bcmd.2001.0457

  29. Grenat P.R., Bionda C.L., Salas N.E., Martino A.L. Variation in erythrocyte size between juveniles and adults of Odontophrynus americanus // Amphibia-Reptilia. 2009a. V. 30. P. 141–145.

  30. Grenat P.R., Salas N.E., Martino A.L. Erythrocyte size as diagnostic character for the identification of live cryptic Odontophrynus americanus and O. cordobae (Anura: Cycloramphidae) // Zootaxa. 2009b. V. 2049. P. 67–68. https://doi.org/10.11646/zootaxa.2049.1.3

  31. Griffiths R.A., de Wijer P. Differential effect of pH and temperature on embryonic development in the British newts (Triturus) // J. Zool., Lond. 1994. V. 234. P. 613–622.

  32. Kozlowski J., Czarnoleski M., François-Krassowska A., Maciak S., Pis T. Cell size is positively correlated between different tissues in passerine birds and amphibians, but not necessarily in mammals // Biol Lett. 2010. V. 6. P. 792–796. https://doi.org/10.1098/rsbl.2010.0288

  33. Mazanaeva L.F. The distribution of Amphibians in Daghestan // Advances in Amphibian Research in the Former Soviet Union. Sophia. 2000. V. 5. P. 141–156.

  34. Mueller R.L., Gregory T.R., Gregory S.M., Hsieh A., Boore J.L. Genome size, cell size, and the evolution of enucleated erythrocytes in attenuate salamanders // Zoology (Jena). 2008. V. 111(3). P. 218–230. https://doi.org/10.1016/j.zool.2007.07.010

  35. Muths E., Campbell D.H., Corn P.S. Hatching success in salamanders and chorus frog at two sites in Colorado USA: effects of acidic deposition and climate // Amphibia-Reptilia. 2003. V. 24. P. 27–36. https://doi.org/10.1163/156853803763806911

  36. Passantino L., Massaro M.A., Jirillo F., Modugno D. Di., Ribaud M.R., Modugno G.Di., Passantino G.F., Jirillo E. Antigenically activated avian erythrocytes release cytokine-like factors: a conserved phylogenetic function discovered in fish // Immunopharmacol Immunotoxicol. 2007. V. 29. P. 141–152. https://doi.org/10.1080/08923970701284664

  37. Pierce B.A., Wooten D.K. Acid tolerance of Ambystoma texanum from central Texas // J. Herp. 1992. V. 26. P. 230–232.

  38. Pough F.H., Wilson R.E. Acid precipitation and reproductive success of Ambystoma salamanders / Proc. Internat. Symp. Acid Rain and Forest Ecosystem 1. 1976. P. 531–544.

  39. Pounds J.A. Climate and amphibian declines // Nature. 2001. V. 410. P. 639–640. https://doi.org/10.1038/35070683

  40. Saber P.A., Dunson W.A. Toxicity of bog water to embryonic and larval anuran amphibians. J. Exp. Zool 1978. V. 204. P. 33–42.

  41. Zhelev Z.M., Angelov M.V., Mollov I.A. A Study of some metric parameters of the erythrocytes in Rana ridibunda (Amphibia: Anura) derived from an area of highly developed chemical industry // Acta Zool. Bulgar. 2006. V. 58. P. 235–244.

  42. Velcheva I., Arnaudov A., Gecheva G., Mollov I. A study on some physiological parameters of three hydrobiotic species under the influence of copper // Proceedings of 2nd International Symposium of Ecologists of Montenegro, Kotor. 2006. P. 155–161.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Известия РАН. Серия биологическая

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал