Известия РАН. Серия биологическая, 2023, № 5, стр. 499-506

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выращивание салата (Lactica sativa L.) сорта Афицион проводили в климатических камерах (Urbangrower 150, China) при различных режимах освещения. Растения освещались светодиодными лампами, излучающими свет четырех диапазонов: коротковолновый красный (623–641 нм), длинноволновый красный (646–667 нм) дальний красный (727–751 нм) и синий (452–477). Контроль включает использование всех четырех режимов освещения одновременно (“белый” свет).

Суточный отбор проб растительной биомассы проводили с интервалом в 6 ч. Высушенный материал измельчали до порошка и отбирали в количествах, достаточных для 4-х повторностей. Измерения изотопного состава проводили на изотопном масс-спектрометре (Delta V, Thermo). Пробоподготовка сводилась к следующему. Порошок биомассы сжигался до СО₂, который очищался от сопутствующих примесей и подавался в аналитическую часть прибора.

Для калибровки прибора и контроля за точностью результатов использовали стандарты IAEA глутаминовой кислоты (USGS40 и USGS41). Величины изотопного состава углерода приводятся в единицах (VPDB):

Погрешность определения, включая инструментальные и видовые ошибки, не превышала 0.1‰.

Детальнее методика и масс-спектрометрическое определение изотопного состава углерода образцов описаны в работе (Tarakanov et al., 2021).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты измерения изотопного состава углерода (δ¹³C) биомассы листа салата при разных режимах освещения представлены в табл. 1.

Поскольку различия, превышающие 0.1‰, считались значимыми, результаты, приведенные в табл. 1, позволяют утверждать, что длины волн оказывают вполне отчетливое влияние на изотопный состав углерода биомассы листа растения. Эксперименты с различным набором длин волн падающего света показали их различное влияние на изотопный состав углерода биомассы листьев. Наблюдались отклонения по сравнению с изотопным составом углерода в контрольном опыте с комбинированным набором длин волн (при освещении “белым” светом). Примечательно, что наиболее сильное влияние противоположного знака оказывали монохроматические синий и красный свет. Обработка растения синим светом при 6-часовом освещении приводила к изотопному сдвигу в сторону обогащения биомассы “легким” изотопом ¹²C относительно контрольного опыта на ‒2.56‰, тогда как обработка растения красным светом при 6-часовом освещении приводила к изотопному сдвигу в сторону обогащения биомассы “тяжелым” изотопом ¹³C относительно контрольного опыта на +2.34‰. Увеличение длительности светового периода на величину изотопных смещений не влияла. Также очевидно, что влияние волн синего и красного диапазонов существенно выше влияния волн других диапазонов.

Особый интерес вызывают результаты, представленные в двух последних столбцах табл. 1. В них приведены изотопные различия углерода биомассы листа при различных диапазонах длин волн падающего света и при режимах освещения, имитирующих “световой” и “темновой” периоды. Это неудивительно, поскольку в этом случае можно ожидать заметную перестройку метаболических потоков.

Действительно, как мы видим из табл. 2, во время светового периода углерод биомассы листа обогащается изотопом ¹²С относительно углерода биомассы в конце темнового периода. Этот факт может означать, что в темновой период биомасса теряет “легкий” изотоп, который уносится вместе с СО₂ при темновом дыхании. Как видно из табл. 2, этот процесс не зависит от режима освещения. Обогащение биомассы изотопом ¹²C происходит при всех режимах освещения.

Согласно существующим моделям фракционирования изотопов углерода при фотосинтезе, обогащение биомассы изотопом ¹³C происходит в том случае, если другой изотоп ¹²C покидает биомассу с каким-либо продуктом метаболизма. Действительно, как мы видим из табл. 1 и 2, во время темнового периода углерод биомассы листа обогащается изотопом ¹³С незначительно. Логично предположить, что этим продуктом является СО₂, обогащенный ¹²C.

Полученные нами данные согласуются с более ранними результатами Гесслера и коллег (Gessler et al., 2008). Они исследовали суточные изотопные сдвиги у клещевины (Ricinus communis L.). Из приведенных ими данных видно (рис. 1), что суточные сдвиги изотопного состава углерода, аналогичные зафиксированным нами, наблюдаются не только у углерода биомассы листа клещевины, но и у углерода водорастворимой и водонерастворимой фракций листа, а также для углерода сока флоэмы.

Рис. 1.

Суточные колебания изотопного состава углерода биомассы листа листа клещевины (Ricinus communis L.), углерода водорастворимой и водонерастворимой фракций биомассы и углерода органического вещества сока флоэмы (Gessler et al., 2008).

Такая согласованность результатов, полученных независимыми исследователями для произвольно выбранных растений, приводит к выводу, что, скорее всего, это связано с перестройкой углеродных потоков при переходе от темнового периода и обратно. Причем данная перестройка сопровождается одинаковыми изотопными сдвигами, не зависящими от режима освещения. Это указывает на то, что наблюдаемые изотопные сдвиги являются результатом некоего общего механизма изотопного фракционирования углерода, проявляющегося при любых режимах освещения.

Изотопные различия водорастворимой и водонерастворимой фракций биомассы листа салата (Lactica sativa L.), представленные в табл. 3, согласуются с данными обнаруженными ранее Гесслером и коллегами (Gessler et al., 2008) у клещевины. Эти различия также не зависели от режима освещения, т.е., как и суточные изотопные сдвиги, они обусловлены клеточным механизмом изотопного фракционирования. Это подтверждается и данными табл. 4, которые показывают одинаковый характер изотопных смещений углерода биомассы водорастворимой и водонерастворимой фракций для трех произвольно выбранных растений при освещении их “белым” светом.

Однако констатация факта существования изотопных различий еще не означает понимания природы их возникновения. Поэтому в настоящей работе мы попытались понять природу изотопных различий в растениях, привлекая для этого клеточную осцилляционную модель фотосинтеза (Ivlev, 2012), которую ранее мы пробовали применить при рассмотрении изотопных данных по клещевине (Ивлев, Тараканов, 2013). При этом мы понимаем ограниченность клеточной модели при описании изотопных сдвигах в растениях, особенно в смысле учета динамики углеродных потоков.

Из анализа модели фракционирования изотопов углерода в фотосинтезирующей клетке (Ivlev, 2012) известно, что в клетке существуют углеродные потоки как обогащенные, так и обедненные изотопом ¹³С относительно общего углерода биомассы. Эти потоки связаны с тремя метаболическими узлами. Первый, рибулозобисфосфаткарбоксилазный узел, связан с реакцией карбоксилирования рибулозобисфосфата на входе СО₂ в цикл Кальвина–Бенсона. Этот узел ответственен за обогащение ассимилируемого клеткой углерода изотопом ¹²С относительно углерода СО₂ среды. Второй, глициндегидрогеназный узел, связан с реакцией декарбоксилирования глицина, которая протекает в гликолатном цикле. Этот цикл ответственен за частичное окисление ассимилированного углерода и обеспечивает процесс фотодыхания. Фракционирование изотопов углерода при фотодыханиии приводит к обогащению выдыхаемого клеткой СО₂ изотопом ¹³С, другими словами, к снижению обогащения ассимилированного углерода (биомассы) изотопом ¹²С, т.е. изотопный эффект ассимиляции и фотодыхания имеют противоположные знаки. Третий, пируватдегидрогеназный узел, связан с реакцией декарбоксилирования пирувата и находится на пересечении центральных метаболических путей. Фракционирование изотопов в нем отвечает за перераспределение изотопов внутри биомассы, т.е. за изотопные различия фракций, метаболитов, за внутримолеулярные распределения. На изотопный состав общего углерода биомассы фракционирование изотопов в третьем узле влияет значительно меньше. Поэтому мы уделили внимание двум первым узлам.

Главным регулятором соотношения потоков ассимиляции и фотодыхания и, соответственно, их вклада в биомассу, от которого зависит ее изотопный состав, является ключевой фермент фотосинтеза – Рубиско (рибулозобисфосфат карбоксилаза/оксигеназа), обладающий двойственной функцией, т.е. способностью функционировать как карбоксилаза, так и как оксигеназа. Фермент работает по механизму “пинг – понга”

Переключения Рубиско с карбоксилазной функции на оксигназную, и обратно, происходят благодаря постоянно меняющемуся у мест карбоксилирования соотношения концентраций СО₂/О₂. На рис. 2 изображена схема предполагаемого механизма переключения фермента с отрицательными обратными связями (Roussel et al., 2007). Она предполагает, что при вхождении в клетку порции воздуха концентрация СО₂ в нем такова, что обеспечивает карбоксилирование РиБФ, но ингибирует работу фермента как оксигеназы. Благодаря такой временной организации гдюкозо-6-фосфат (Г6Ф), являющийся продуктом цикла Кальвина-Бенсона, в тот момент, когда происходит карбоксилирование, в гликолатный цикл, где происходит глициндегидрогеназная реакция, не поступает. В процессе ассимиляции концентрация СО₂ в вошедшей порции падает, а относительная концентрация кислорода в ней возрастает. Кислород ингибирует карбоксилазную функцию Рубиско и инициирует оксигеназную, при этом Г6Ф поступает в гликолатный цикл.

Рис. 2.

Схема механизма с отрицательными обратными связями, переключающего рубиско с карбоксилазной функции на оксигеназную и обратно (Roussel et al., 2007).

Анализ системы дифференциальных кинетических уравнений, описывающих совокупность реакций, составляющих карбоксилазную и оксигеназную цепь, при подстановке в них реальных клеточных параметров, имеющихся в литературе (Dubinsky, Ivlev, 2011), допускает появление осцилляций. Была показана возможность существования области незатухающих колебаний, для которых период составляет величину порядка секунд. Наличие таких осцилляций подразумевает, что ассимиляция СО₂ и выброс из клетки СО₂ при фотодыхании происходят в виде отдельных дискретных порций, что было предсказано ранее (Ивлев, 1989).

С дискретностью связана еще одна возможность появления изотопных эффектов в фотосинтезирующих клетках. Она обусловлена способностью клетки изменять размер порций СО₂, поступающих в клетку при ассимиляции, или удалять из клетки порции СО₂ при фотодыхании с помощью механизма газообмена. При попадании растений в среду с неблагоприятными условиями (например, при низкой влагодоступности, при высокой температуре, высокой интенсивности света и т.д.), эти условия, используя специальный устьичный аппарат, могут регулировать концентрацию СО₂ у мест карбоксилирования. Регуляция размера порций с помощью устьичного аппарата сопровождается исчерпыванием субстрата, что, в свою очередь, приводит к возникновению изотопного эффекта исчерпывания Релея. В первую очередь, порцию покидают легкоизотопные молекулы, т.е. содержащие изотоп ¹²С. Поэтому в остатке (т.е. в ассимилированном углероде) накапливается тяжелый изотоп ¹³С.

Поскольку биомасса листа состоит из фотосинтезирующих клеток, представления об осцилляционном механизме фотосинтеза и о ассимиляционном и фотодыхательном фондах вполне применимы для объяснения изотопных различий водорастворимой и водонерастворимой фракций биомассы. Действительно, рассмотрение изотопного фракционирования при осцилляционном фотосинтезе приводит к выводу, что в фотосинтезирующих клетках растений образуются два изотопноразличающихся углеродных фонда – ассимиляционный, обогащенный изотопом ¹²С, и фотодыхательный, обогащенный изотопом ¹³С. Благодаря строгой временной и пространственной организации метаболизма клетки заметного перемешивания потоков в клетке не происходит, и поэтому метаболиты, связанные с этими фондами, сохраняют унаследованные изотопные различия.

Таким образом, мы можем обосновать вывод относительно наблюдаемой разницы в изотопном составе углерода водорастворимой и водонерастворимой фракций биомассы листа ряда растений (табл. 2), которая не зависит от режима освещения.

Действительно, из биохимии растений известно, что водорастворимая фракция биомассы, в основном, состоит из водорастворимых углеводов. Основной структурной единицей синтеза практически всех углеводов в клетке является Г6Ф (Бернфельд, 1965). Глюкозо-6-фосфат образуется как в цикле Кальвина–Бенсона, так и в гликолатном цикле. В первом случае углеродный поток образует ассимиляционный фонд, обогащенный ¹²С. Во втором случае углеродный поток образует фотодыхательный фонд, углерод которого обогащен ¹³С.

Водонерастворимая фракция включает такие компоненты, как лигнины, дипиды, белки, синтез которых связан с ассимиляционным фондом (Бернфельд, 1965)). Они используются на синтез волокна, стенок сосудов, эпидермиса, хлорофилла. Хотя не исключено, что углерод фотодыхательного фонда также может принимать участие в образовании водонерастворимой части, но доля углерода, из ассимиляционного фонда в ней будет гораздо выше. Таким образом, даже простой анализ показывает, что причиной изотопной утяжеленности водорастворимой фракции биомассы, по сравнению с водонерастворимой, является их связь с ассимиляционным и фотодыхательным фондами, возникающими при фотосинтезе.

В результате проведенного анализа можно сделать и другой важный вывод. Поскольку водорастворимые углеводы и, в первую очередь, сахароза, являются основными транспортными агентами в растениях (Курсанов, 1976), то обогащенность сахарозы ¹³С должна проявиться и при донорно-акцепторных отношениях в растениях при движении ассимилятов от листа к цветку (плоду).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Эксперименты с различным набором длин волн падающего света показали их различное влияние на изотопный состав углерода биомассы листьев: наблюдаются отклонения по сравнению с изотопным составом углерода в контрольном опыте с комбинированным набором длин волн (при освещении “белым” светом). Наиболее сильное влияние противоположного знака оказывают монохроматические синий и красный свет. Обработка растения синим светом при 6-часовом освещении привела к изотопному сдвигу в сторону обогащения биомассы “легким” изотопом ¹²C относительно контрольного опыта на –2.56‰, тогда как обработка растения красным светом при 6-часовом освещении привела к изотопному сдвигу в сторону обогащения биомассы “тяжелым” изотопом ¹³C относительно контрольного опыта на +2.34‰. Примечательно, что указанные длины волн испытывают наибольшее поглощение при фотосинтезе.

Анализ изотопных смещений общего углерода в темновой и световой периоды позволяет заключить, что обогащенность углерода биомассы листа в темновой период изотопом ¹²С является следствием потери изотопа ¹³С при темновом дыхании в результате преимущественного выброса ¹³СО₂.

Показано, что в рамках предложенного ранее осцилляционного механизма фотосинтеза в процессе ассимиляции СО₂ возникают два углеродных фонда – ассимиляционный, обогащенный изотопом ¹²С, и фотодыхательный, обогащенный изотопом ¹³С. В рамках этих представлений наблюдаемая обогащенность углерода водорастворимой фракции биомассы листа изотопом ¹³С относительно углерода водонерастворимой фракции объясняется тем, что синтез большинства компонентов водорастворимой фракции листа связан с фотодыхательным фондом клетки, тогда как синтез большинства компонентов водорастворимой фракции связан с ассимиляционным фондом клетки. Сделанное утверждение основывается на известной биохимии растительной клетки.

Реальный метаболизм отличается от модельного динамикой процесса, которая соответствует меняющемуся во времени функциональному состоянию организма. То же справедливо и для рассмотрения изменения изотопных сдвигов углерода биомассы. В подтверждение сказанного в следующей работе мы рассмотрим изотопные сдвиги углерода биомассы на стадии цветения и бутонизации.

Работа выполнена при поддержке Минобрнауки России в рамках соглашения № 075-15-2022 от 16 ноября 2020 г. о предоставлении гранта в форме субсидий из федерального бюджета на осуществление государственной поддержки создания и развития научного центра мирового уровня “Агротехнологии будущего”.