Известия РАН. Серия биологическая, 2023, № 5, стр. 507-519

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Гельминтологический материал собирался от млекопитающих семейств Cervidae, Bovidae, Leporidae из Армении, Болгарии, Польши и южных регионов европейской части России и подвергался камеральной обработке общепринятыми в гельминтологии методами.

Для выявления личинок нематод в фекалиях использовали методы Вайда и Бояхчяна. Суть метода Вайда (Vajda, 1922 из Скрябин, Шульц, 1940), общепринятого в гельминтологии, заключалась в следующем: несколько свежих (не более 6 часов) фекальных катышков помещались в чашку Петри или часовое стекло, добавлялась вода, и через 5–10 мин катышки убирались, а оставшаяся жидкость помещалась под бинокуляр для поиска вышедших личинок нематод. Метод, разработанный Бояхчяном (2007), заключался в следующем: брались 3–4 катышка фекалий, помещались в небольшие (20–30 см³) стеклянные или пластиковые флаконы с водой и закрывались. Флаконы с пробами выдерживались так на протяжении 3 часов без встряхивания. За это время личинки нематод выходили из фекалий в воду. Для сохранения личинок жидкость переносилась из флакона в такой же с 5–10 мл 10% формалина, а фекалии выкидывались. Флаконы затем плотно закрывались. В таком виде они могли храниться на протяжении долгого времени. Приготовленные таким образом пробы перевозились в лабораторию для микроскопического исследования.

Для обнаружения мелких, плохо различимых червей в бронхиолах и альвеолах использовался метод, разработанный Панайотовой-Пенчевой (Panayotova-Pencheva, 2011b). Отбирались фрагменты поврежденных легочных тканей в 1–2 см³ и кипятились на водяной бане при 100°С на протяжении 1.4 ч в 40% молочной кислоте. После этого мелкие (2–3 мм) фрагменты раздавливались между покровными стеклами и просматривались под микроскопом при увеличении 60, 160 и 400× для изучения таких структур как спикулы.

Для определения видов моллюсков использовались фундаментальные монографии (Лихарев, Раммельмайер, 1952; Damianov, Likharev, 1975; Акрамовский, 1976; Сысоев, Шилейко, 2009). Для установления инвазированности промежуточных хозяев протостронгилид – наземных моллюсков, они собирались в основном в весенне-осенний период. Отделенные от тела моллюска ноги помещали между двумя предметными стеклами и раздавливали, а затем этот материал просматривали под микроскопом. При этом для диагностирования вида протостронгилид использовали только инвазионные личинки, дифференциация которых более достоверна, чем неинвазионных.

Инвазированность моллюсков в основном была выявлена в природных условиях, в некоторых случаях были поставлены специальные опыты по их искусственному заражению:

В качестве источника заражения использовались отдельные пробы фекалий овец, коз и оленей. Часть пробы обследовалась на присутствие активных личинок первой стадии (L1), определялась интенсивность инвазии по Берману (Baermann, 1917). Идентификация личинок проводилась в соответствии с монографиями Боева (1975) и Контримавичюса и др. (1976). Для заражения использовались только пробы фекалий с высокой интенсивностью инвазии. Наземные моллюски заражались путем прямого контакта с катышками фекалий. Заражаемый моллюск помещался в кристаллизатор, по дну которого была распределена фекальная масса с личинками L1 исследуемого рода нематод. Моллюски держались на фекалиях на протяжении полутора часов. В это время они активировались путем спрыскивания водой, нагретой до +40°С. Зараженные моллюски содержались в стеклянных аквариумах с почвой, в которых поддерживалась высокая влажность за счет впрыскивания воды, при температуре +20…+25°С, кормились травой и двудольными растениями. Заражение пресноводных моллюсков проводилось по методу Урбана (Urban, 1980).

Личинки эхинококков и альвеококков легко обнаружимы при вскрытии зараженных органов (легких) по присутствию пузырьков (цист). Их видовая принадлежность определялись согласно монографии Абуладзе (1964).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Как указано выше, всего на заражение легочными гельминтами обследовались 16 видов млекопитающих. Жвачные из семейств Bovidae и Cervidae в основном несли смешанную инвазию нематодами. Это указывает на широкую восприимчивость жвачных к протостронгилидам. В то же время, режим пастьбы и питания также влияют на зараженность этих животных. Другие обследованные млекопитающие – семейство Leporidae – были заражены только одним видом легочных гельминтов, Protostrongylus tauricus.

По литературным данным (Фертиков и др., 1999; Самойловская, 2010) у диких копытных встречаются следующие виды легочных гельминтов:

у Alces alces – Dictyocaulus filaria, D. viviparus, Muellerius capillaris, Elaphostrongylus cervi, Elaphostrongylus alcis, Varestrongylus capreoli;

у Cervus dama (=Dama dama) – D. filaria, D. viviparus, Varestrongylus saggittatus;

у Cervus nippon – D. filaria, D. viviparus, E. cervi, V. saggittatus, Muellerius capillaris;

у Capreolus capreolus – D. viviparus, M. capillaris, V. capreoli;

у Cervus elaphus – D. viviparus, E. cervi, V. capreoli, V. saggittatus.

Общий список видов хозяев по изученным странам представлен в табл. 1.

Из группы легочных гельминтов, жизненные циклы которых протекают прямым путем, без участия промежуточных хозяев (геогельминтов) в вышеуказанных регионах были выявлены 5 видов: D. filaria (Rudolphi 1809); D. viviparus (Bloh 1782); D. capreolus Gibbons, Hoglund 2002; D. eckerti Skrjabin 1931; D. cervi Pyziel et al., 2017.

В условиях Армении жизненные циклы D. filaria и D. viviparus, по данным Бояхчяна (2010) происходят следующим образом (рис. 1а): самки диктиокаул после оплодотворения откладывают яйца, которые с мокротой попадают в ротовую полость хозяина и проглатываются со слюной. В пищеварительном тракте, в основном, в толстом отделе кишечника, из яиц выходят личинки 1-й стадии, которые с фекалиями животных выделяются во внешнюю среду. Во внешней среде личинки диктиокаул при температуре от +25 до +30°С совершают две линьки и достигают инвазионной стадии. Инвазионные личинки легко переносят высушивание в течение 1 мес. и замораживание в течение 15 сут, но при температуре +60°С они погибают.

Рис. 1.

Схемы жизненных циклов диктиокаул (а) и протостронгилид (б), по (Deplazes et al., 2020).

Рис. 1.

Окончание.

Заражение животных происходит перорально при заглатывании вместе с травой или водой инвазионных личинок. Попав в кишечник дефинитивного хозяина, инвазионные личинки диктиокаул проникают в стенку кишечника, затем в мезентериальные лимфатические сосуды и узлы, где совершают еще две линьки, лимфогенным путем личинки заносятся в правое предсердие и через легочную артерию – в легкие. В легких личинки разрывают стенки капилляров и проникают в просвет бронхов.

Личинки достигают половой зрелости в среднем через 1 месяц после заражения. Продолжительность паразитирования диктиокаул в организме хозяев варьирует от нескольких месяцев до 1.5–3 лет. По данным Галли (Gallie, Nunns, 1976), развитие личинок диктиокаул от L-1 до L-3 в условиях Северовосточной части Англии продолжалось в течение 4–9 дней в конце весны и летом, 1.5–4 нед. осенью и 5.5–7 нед. зимой.

В Польше показано, что свободноживущие личинки D. eckerti линяют дважды и достигают зрелости в течение 20 дней при +5°C и 4 дней при +30°C (Demiaszkiewicz, 2005).

В обследованных нами регионах – было выявлено 20 видов семейства Protostrongylidae Leiper 1926, в том числе в Армении 8 видов, в Болгарии 12, Польше 14 и в Европейской части России 19 видов. Обзор жизненных циклов протостронгилид (рис. 1б) приведен в докторских диссертациях Бояхчяна (2010) и Гадаева (2020). В этих обзорах указываются следующие особенности жизненных циклов этих нематод. Они являются яйцекладущими нематодами, и из яиц, отложенных ими в легких хозяев, выходят личинки 1-й стадии, которые при кашле со слизью попадают в ротовую полость, затем проглатываются и через желудочно-кишечный тракт выделяются с фекалиями во внешнюю среду. Дальнейшее развитие этих личинок 1-й стадии возможно лишь при попадании в организм промежуточного хозяина, каковым являются наземные моллюски.

Личинки 1-й стадии протостронгилид проникают в ногу моллюска, как активно, так и при проглатывании моллюсками. В организме моллюска личинки дважды линяют, линька сопровождается отслоением кутикулы (чехликов). Эти личинки уже инвазионные и способны заражать дефинитивного хозяина. В условиях Армении жизненные циклы протостронгилид были изучены Э.А. Давтяном в 1940–1950, анализ этих исследований был приведен в докторской диссертации Бояхчяна (2010) и в публикациях (Мовсесян и др., 2010; Панайотова-Пенчева и др., 2012).

В целом, в обследованных регионах установлена зараженность протостронгилидами 78 видов моллюсков, включая 50 видов из России, 39 из Армении, 21 из Болгарии и 30 из Польши. Список видов моллюсков-промежуточных хозяев протостронгилид приводится в табл. 2 (по Мовсесяну и др., 2010, с изменениями). Исследования в условиях Армении показывают, что наиболее зараженными являются 9 видов моллюсков (рис. 2), из которых наибольшую роль играют Helicella derbentina, Napaeopsis hohenackeri. Моллюски в условиях нагорий и низменностей Армении были заражены протостронгилидами с экстенсивностью 3.0–13.0% весной и +17.2…+22.2% в летне-осенний период. В Европейской части России (Калининградская, Тверская и Ярославская области) исследования наземных моллюсков И.Н. Трушиным (1972, 1973) показали инвазированность моллюсков Bradybaena fruticum и Deroceras reticulatum личинками M. capillaris, Protostrongylus kochi и других видов Protostrongylidae.

Рис. 2.

Виды моллюсков, несущих основной поток инвазии протостронгилидами, по (Мовсесяну и др., 2010). 1 – Pupilla muscorum; 2 – Chondrula tridens; 3 – Napaeopsis hohenackeri; 4 – Succinea putris; 5 – Helicella derbentina; 6 – Hesseola solidior; 7 – Vitrinoides monticola; 8 – Deroceras caucasicum; 9 – Helix lucorum.

Работа В.П. Кротенкова (2006) была преимущественно посвящена экологическим и эпизоотологическим особенностям данной группы. Он установил, что в условиях различных биотопов в Смоленской области различные виды моллюсков – B. fruticum (=fruticus), Clausila pumilia (=pomila), Cochlicopa lubrica, Brion circumscriptus, Euomphalia strigella, Pseudotrichia rubiginosa, Oxyloma sarsi (=Succinea sarsi), Perforatella bidentata, Succinella (=Succinea) oblonga, Succinea putris, Loritoides nitidus, Helix pomatia, Trochulus (=Trichia) hispida, Macrogastra ventricosa (=Iphigena ventricosa) – принимают участие в жизненном цикле легочной нематоды M. capillaris. Видами моллюсков-хозяев, общими для всех этих биотопов, являются S. putris, B. fruticum и O. sarsi. Также было установлено, что в луговых биотопах в течение сентября максимальной была экстенсивность инвазии B. fruticum – 17.0 ± 1.8%, при интенсивности инвазии 26.0 ± 1.8 личинок на разных стадиях морфогенеза. Экспериментальное заражение моллюсков в лабораторных и полевых условиях показало 100% заражаемость с интенсивностью инвазии от 6.0 ± 0.3 до 48.0 ± 06 личинок на моллюска.

Х.Х. Гадаев в своих работах (2013, 2015, 2020) по Чеченской республике показал, что в результате проведенных исследований и ревизии списка наземных моллюсков на пастбищных биотопах и путях миграции жвачных животных установлено 37 видов наземных моллюсков, относящихся к 23 родам и 14 семействам, где плотность заселения по биотопам на м² составила по всем поясам в среднем 1.0–2.2 экз. Промежуточными хозяевами нематод р. Protostrongylus являются 26 видов моллюсков, регистрирующиеся в равнинном, предгорном поясах с конца марта по октябрь, которые инвазированы личинками нематод р. Protostrongylus в среднем от 1.0 до 34.4%, а по отдельным видам моллюсков доминируют максимальной степенью инвазированности в естественных пастбищах Vertigo antivertigo (ЭИ = 59.6%, ИИ = = 16.1 ± 4.1), Chondrula tridens (ЭИ = 58.1%, ИИ = = 7.3 ± 1/4), Euomphalia strigella (ЭИ = 57.3%, ИИ = 11.4 ± 1.9), Pupilla muscorum (ЭИ = 50.4%, ИИ = 10.2 ± 1.6).

В условиях лаборатории из 26 видов моллюсков, подвергнутых экспериментальному заражению личинками Protostrongylus spp., облигатными промежуточными хозяевами Protostrongylus spp. определены только 6 видов моллюсков (Euomphala strigella, Xerosects crenimargo, P. muscorum, Ch. tridens, V. antivertigo, H. derbentina). ЭИ была 86.0–95.1% при сроках развития до инвазионной стадии 15–30 сут.

Н. А. Самойловская (2010, 2013) указывает наличие 12 видов наземных моллюсков в Национальном парке “Лосиный остров” Московской области РФ, из которых инвазированными личинками протостронгилид оказались Bradybaena fruticus на 0.2% при интенсивности инвазии 13 экз. и S. putris – на 0.4% при ИИ 2–7 экз. Дальнейшие исследования показали зараженность следующих моллюсков Varestrongylus и Muelleria: B. fruticum, S. putris, C. lubrica, Zonitoides nitidus с ЭИ 0.3–0.4%, ИИ – 2–7 экз.

В Болгарии было экспериментально установлено, что моллюски видов B. fruticum, Cepaea vindobonensis, Ch. tridens, Deroceras turcicum, H. pomatia, Monacha cartusiana, Tandonia kusceri являются подходящими хозяевами нематод рода Muelerius, а виды Arion lusitanicus, B. fruticum, C. vindobonensis, H. pomatia, M. cartusiana – нематод рода Elaphostrongylus (Panayotova-Pencheva, 2011a).

М.С. Панайотовой-Пенчевой с соавт. (Panayotova-Pencheva et al., 2015) был поставлен интересный эксперимент по заражению моллюсков с целью установления восприимчивости их к повторному заражению. Так, четыре последовательных заражения моллюсков вида H. pomatia проводились каждые 14–20 дней. Через две недели после каждого заражения моллюски вскрывались для определения экстенсивности и интенсивности инвазии, стадии развития паразита. Результаты показывают, что моллюски остаются подвержены инвазии нематодами после нескольких циклов заражения. Однако количество личинок паразитов в третьем и четвертом циклах заражения были ниже, чем в первом и втором. Это показывает существование в моллюсках в условиях повторяющихся заражений механизмов ограничения экстенсивности инвазии протостронгилидами. Эти эксперименты показывают сложность взаимоотношений внутри системы “паразит-хозяин”, для дальнейшего уточнения которых требуются дополнительные исследования.

В Болгарии естественная зараженность моллюсков изучалась в регионе Велико-Трново. Была обнаружена зараженность 3 видов моллюсков: Helicella obvia, M. cartusiana и B. fruticum. Экстенсивность инвазии была наиболее высокой летом – 30–35%, довольно высокой весной – 24%, и ниже всего осенью – 8.6% (Panayotova-Pencheva, 2005).

Исследования роли моллюсков в жизненных циклах протостронгилид в Польше были начаты еще в 1938 и показали присутствие личинок M. capillaris в наземных моллюсках H. pomatia и S. putris (Sitowski, 1938). Из 365 моллюсков H. obvia, вскрытых в районе Люблин, только в 6 обнаружены личинки P. rufescens. В лабораторных условиях развитие P. rufescens и M. capillaris происходило в H. obvia, S. putris и C. vindobonensis, в то время как M. capillaris также развивалась в H. pomatia и Helicigona arbustorum. Развития в Deroceras agreste и L. stagnalis не происходило несмотря на то, что личинки Muelleria проникали в их ногу. Также не происходило развития в G. truncatula и P. corneus (Sołtys, 1964).

К. Здидоветски (Zdzitowiecki, 1976) экспериментально заражал 14 видов наземных и пресноводных моллюсков личинками M. capillaris. Подверженными заражению оказались: L. stagnalis, Galba corvus, Radix peregra, Physa fontinalis, Planorbis planorbis, Planorbarius corneus, S. putris, D. reticulatum, B. fruticum, H. arbustorum, Cepaea nemoralis, Perforatella bidens, Trichia hispida. Наивысшая интенсивность инвазии обнаружена у C. nemoralis (430 личинок) и H. arbustorum (423 личинок). Автор высказал точку зрения, что легочные моллюски можно также отнести к промежуточным хозяевам M. capillaris.

В условиях Беловежской Пущи изучались моллюски S. putris, B. fruticum, P. bidentata, Arion subfuscus и Z. nitidus. Установлена их естественная зараженность E. cervi с ЭИ 6.6–27.4% (Demiaszkiewicz, 1987; Kuligowska, Demiaszkiewicz, 2010).

Из северных и южных районов Польши изучалась инвазированность следующих видов моллюсков: S. putris, B. fruticum, P. bidentata, A. subfuscus, Z. nitidus и C. nemoralis. У S. putris обнаружено заражение E. cervi с ИИ до 150 личинок, V. saginatus – 41, V. capreoli – до 132, с ЭИ 23.5% для всех этих видов. Наибольшая зараженность выявлена в июне-июле. В одном случае моллюск Z. nitidus нес лишь одну личинку паразита. Другие виды моллюсков не были заражены (Misiewicz, Demiaszkiewicz, 1994).

При обследовании оленеводческой фермы в Косево обнаружена зараженность S. putris личинками E. cervi и Varestrongylus sagittatus (Demiaszkiewicz, Dróżdż, 1997).

При исследовании выживаемости личинок M. capillaris при различных температурах окружающей среды было установлено, что личинки этих нематод сохраняли выживаемость в фекалиях при температуре +18°C в течение 30 дней, в то время как 50% личинок, содержавшихся в воде при +4…+20°C выживали в течение 28 дней. Также важен оказался возраст хозяина. Так, M. capillaris в фекалиях от молодых коз выживали при +18°C в течение 10 дней, а от старых – в течение 75 (Borecka, Gawor, 2001).

B Малопольском воеводстве (Подхале) промежуточными хозяевами протостронгилид в естественных условиях являются 6 видов моллюсков: Deraceres reticulatus, D. agreste, A. subfuscus, Arion circumscriptus, Vallonia pulchella и Pupilla triplicata. В том же районе 27 видов наземных и пресноводных моллюсков оказались восприимчивы к экспериментальному заражению протостронгилидами: S. putris, S. pfeiferi, S. oblonga, C. lubrica, C. edentula, Truncatellina cylindrica, V. antivertigo, Pupilla triplicata, Zenobiella incarnata, Zenobiella umbrosa, Trichia villosula, E. strigella, Helicigona faustina, Arianta arbustorum, Cepaea hortensis, H. pomatia, V. pulchella, Vallonia costata, Oxychillus cellarius, Z. snitidus, A. subfuscus, A. circumscriptus, D. reticulatum, D. agreste, B. fruticum, H. obvia, Radix (=Lymnaea) peregra (Urban, 1980).

Таким образом, в Польше промежуточными хозяевами протостронгилид являются 30 видов наземных моллюсков : C. vindobonensis, C. nemoralis, T. hispida, S. putris, S. pfeiferi, S. oblonga, C. lubrica, C. edentula, T. cylindrica, V. antivertigo, P. triplicata, Z. incarnata, Z. umbrosa, T. villosula, E. strigella, H. faustina, A. arbustorum, C. hortensis, H. pomatia, V. pulchella, V. costata, O. cellarius, Z. nitidus, A. subfuscus, A. circumscriptus, D.s reticulatum, D. agreste, B. fruticum, H. obvia, P. bidentata и 6 видов пресноводных: Lymnaea stagnalis, Galba (=Stagnicola) corvus, Radix (=Lymnaea) peregra, Ph. fontinalis, P. planorbis, P.s corneus.

Из группы биогельминтов, промежуточными хозяевами которых являются позвоночные животные, в обследованных регионах наиболее распространены оказались цестоды Echinococcus granulosus (повсеместно), а также Alveococcus multilocularis (рис. 3). Так, сведения по распространению и жизненным циклам E. granulosus в Армении приведены в монографии С.О. Мовсесян и др. (2006), диссертации А.Ш. Геворгян (2006). В работе Геворгян указано, что крупный рогатый скот на территории Армении был поражен цистными эхинококками на 49%, овцы и козы на 22%, свиньи на 15%.

Рис. 3.

Схемы жизненных циклов эхинококков и альвеококков по (Thompson, McManus, 2001).

Исследования среди населения Армении показали, что зараженность среди всех возрастных групп была выше всего у лиц 30–35 лет. Цисты эхинококков обнаруживались во всех органах, но легкие и печень были наиболее часто заражены, с частотой 42–43%. Альвеолярные эхинококки в Армении остаются не изученными.

Подробные сведения о распространении E. granulosus и A. multilocularis приведены в наших публикациях (Eckert et al., 2001; Movsesyan et al., 2021). В этих работах указаны повсеместное распространение E. granulosus, а для альвеококков – преимущественно в северных регионах РФ, но полноценное изучение альвеококка не проведено, поэтому мы предполагаем, что перспективные исследования пополнят регионы распространения альвеококка. В руководстве ВОЗ имеются данные по Болгарии и Польше (Eckert et al., 2001). Так, в работе (Todorov, Boeva, 1997, 1999) указывалось, что в Болгарии для E. granulosus за 1983–1995 гг. выявлена инвазированность цистным эхинококком у овец на 32%, крупного рогатого скота на 19%, свиней на 1.5%, у человека на 100 000 населения было 3.3 случая.

В Польше цистный эхинококк выявлен у свиней от 0.4 до 1.2% (Gawor, 2016).

В этом же сборнике ВОЗ (Eckert et al., 2001) указано, что исследования, проведенные Мальчевски (Malczewski et al., 1999), за 1993–1998 гг. показали инвазированность лисиц зрелыми альвеококками на 2.6%. В то же время, более поздние исследования, проведенные Гавором с соавт. (Gawor et al., 2008), показали инвазированность лисиц в северо-восточной, центральной и южной Польше от 13.59 до 39.6%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В регионах Армении, Болгарии, Польши и европейской части Российской Федерации заражение легочными гельминтами изучалось у 16 видов млекопитающих из семейств Cervidae (6 видов), Bovidae (9), Leporidae (1), включая 7 видов из Армении, 13 из России, 7 из Болгарии и 10 из Польши, а также у многих потенциальных хозяев-беспозвоночных, преимущественно легочных моллюсков. В них обнаружены 29 видов легочных гельминтов из семейств Dictyocaulidae (5 видов), Protostrongylidae (22), Taeniidae (2).

Общими для изучаемых территорий были следующие виды промежуточных хозяев-моллюсков: Arianta arbustorum, Bradybaena fruticum, Cepaea nemoralis, C. vindobonensis, Georginapaeus (=Napaeopsis) hohenackeri, Pyramidula rupestris, Succinea putris, Vallonia pulchella, Zonitoides nitidus. Продемонстрировано, что некоторые из этих видов играют важную роль для основного потока инвазии протостронгилидами.

Исходя из результатов многолетних исследований авторов настоящей статьи и литературных источников, мы подтверждаем предложенное нами ранее наличие трех типов жизненных циклов легочных гельминтов, на основе которых дана их биологическая классификация:

1. Жизненные циклы протекают без участия промежуточных хозяев, т.е., паразиты являются геогельминтами – моноксенны. Развитие по этому типу происходит у нематод сем. Dictyocaulidae.

2. Жизненные циклы происходят с участием промежуточных хозяев, каковыми являются беспозвоночные, принадлежащие, в основном, к наземным моллюскам. Развитие по этому типу происходит у нематод сем. Protostrongylidae. Диксенны, биогельминты.

3. Жизненные циклы происходят также с участием промежуточных хозяев, но в их качестве выступают позвоночные животные, т.е. диксенны, биогельминты. К этому типу относятся цестоды E. granulosus и A. multilocularis (Echinococcinae).