1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Известия РАН. Серия биологическая
  4. № 6, 2023

Известия РАН. Серия биологическая, 2023, № 6, стр. 687-699

Биодеструкция микроцистина-LR автохтонной микробиотой разнотипных водных объектов Северо-Запада России

Н. Г. Медведева 1, *, Т. Б. Зайцева 1, И. Л. Кузикова 1, Е. Н. Чернова 1

1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки “Санкт-Петербургский Федеральный исследовательский центр Российской академии наук” (СПб ФИЦ РАН), Санкт-Петербургский научно-исследовательский центр экологической безопасности Российской академии наук
197110 Санкт-Петербург, ул. Корпусная, д. 18, Россия

* E-mail: ngmedvedeva@gmail.com

Поступила в редакцию 03.10.2022
После доработки 26.01.2023
Принята к публикации 26.01.2023

Полный текст (PDF)

Аннотация

Впервые показана способность автохтонной микробиоты разнотипных водных объектов Северо-Запада РФ деструктировать высокотоксичный микроцистин-LR (MC-LR). Максимальная скорость деградации MC-LR отмечена в водных образцах, отобранных в Сестрорецком разливе и Нижнем Суздальском озере в период массового развития цианобактерий. В образцах воды Ладожского озера, где ранее не были отмечены токсичные цианобактериальные цветения, биодеструкция MC-LR проходила со значительно меньшей скоростью и более длительной лаг-фазой. Состав продуктов биодеградации MC-LR свидетельствует о наличии в составе автохтонной микробиоты исследуемых объектов микроорганизмов, способных деструктировать микроцистины как по mlr механизму, так и по биохимическому пути с участием глутатиона.

Ключевые слова: водные объекты, цианобактерии, микроцистин, автохтонная микробиота, биодеструкция

Изменение климата и загрязнение водных объектов органическими и минеральными соединениями, в том числе биогенными элементами, способствует массовому развитию микроводорослей, или “цветению” водных объектов во всем мире (Sivarajah et al., 2021). “Цветения” могут вызывать представители различных отделов водорослей – золотистые (Chrysophyta), желто-зеленые (Xanthophyta), диатомовые (Bacillariophyta), криптофитовые (Cryptophyta), зеленые (Chlorophyta), а также цианобактерии (Cyanophyta) (Белякова и др., 2006). Цианобактерии являются одними из основных и наиболее опасных возбудителей “цветения” воды. Это связано со способностью данной группы прокариотов продуцировать токсины, опасные для человека и животных (Chorus et al., 2000; Codd et al., 2005).

Микроцистины (МС) являются одними из широко распространенных цианотоксинов в пресноводных водоемах по всему миру. Их основными продуцентами являются цианобактерии родов Anabaena, Microcystis, Nostoc, Planktothrix и др. (Chorus, Bartram, 1999). В процессе роста цианобактерий микроцистины находятся в клетках и попадают в воду в результате их разрушения.

Микроцистины являются ингибиторами эукариотической серин/треонин фосфатазы 1 и 2А (РР1 и РР2А), что приводит к гиперфосфорилированию белков цитоскелета с последующей их деструкцией и деформацией гепатоцитов человека и животных. В результате возникают обширные кровоизлияния, увеличение размеров печени, а также онкологические заболевания (Zurawell et al., 2005; Carmichael, Boyer, 2016; Massey, Yang, 2020).

Микроцистины относятся к циклическим гептапептидам с основной структурой цикло-(D-Ala-X-D-MeAsp-Z-Adda-D-Glu-Mdha), где D-Ala – D-аланин, D-MeAsp – D-эритро-β-метиласпарагиновая кислота, Adda – 3-амино-9-метокси-2,6,8-триметил-10-фенилдека-4,6-диеновая кислота, D-Glu – D-глутамат, Mdha – N-метилдегидроаланин, X и Z – вариабельные L-аминокислоты (Chorus, Bartram, 1999).

В настоящее время известно 246 изомеров микроцистинов, отличающихся разной токсичностью (Tsuji et al., 1994; Meriluoto et al., 2017; Massey, Yang, 2020). Согласно рекомендациям ВОЗ концентрация наиболее токсичного микроцистина-LR (MC-LR) в питьевой воде не должна превышать 1 мкг/л (Cyanobacterial toxins, 2020).

Благодаря циклической структуре микроцистины устойчивы к воздействию высоких температур, экстремальных рН, солнечному свету, вследствие чего могут сохраняться в водоемах месяцами (Tsuji et al., 1994; Sivonen, Jones, 1999; Rastogi et al., 2014; Li et al., 2017).

Несмотря на свою стабильность микроцистины могут подвергаться биодеградации. Способностью разрушать микроцистины обладают как прокариотические, так и эукариотические микроорганизмы. Большинство бактерий-деструкторов относятся к Proteobacteria (α, β, γ), Actinobacteria и Bacilli (Li et al., 2017; Massey, Yang, 2020). Многие из них имеют кластер генов mlr, ответственных за деградацию этих токсинов (Redouane et al., 2019). Однако у ряда бактерий-деструкторов микроцистинов mlr-гены не обнаружены, что предполагает участие других генов в деструкции этих токсинов. Обсуждается участие в процессах микробной деструкции микроцистинов щелочных протеаз и глутатион-S-трансферазы (GST) (Esterhuizen-Londt et al., 2017; Krishnan et al., 2018; Krausfeldt et al., 2019). Весьма вероятно, что список ферментов, участвующих в процессах биотрансформации микроцистинов, со временем будет расширяться. Знание о биодеградации МС в окружающей среде на молекулярном уровне могло бы быть использовано для прогнозирования способности автохтонной микробиоты к удалению микроцистинов из среды. Однако отсутствие информации о молекулярных механизмах, отличных от биохимических путей, кодируемых mlr кластером, не позволяет в настоящее время использовать молекулярные методы для адекватной оценки способности природных сообществ микроорганизмов к деструкции МС.

Именно процесс биодеградации лежит в основе механизма разрушения микроцистинов в природных условиях (Christoffersen et al., 2002; Bukowska et al., 2018). Многочисленные публикации посвящены разложению микроцистинов автохтонной микробиотой озер (Christoffersen et al., 2002; Dziga et al., 2017; Krishnan et al., 2018; Lezcano et al., 2018), водохранилищ (Ho et al., 2012; Medvedeva, Kuzikova, 2021), морей (Toruńska-Sitarz et al., 2018), донных осадков (Rapala et al., 1994; Li et al., 2016; Zhu et al., 2019), почв (Cao et al., 2018; Redouane et al., 2019). В большинстве этих исследований получены данные о способности природных микробных сообществ разрушать микроцистины, в том числе наиболее токсичный микроцистин-LR. Однако в ряде водоемов деструкция микроцистинов природной микробиотой не наблюдалась (Kiviranta et al., 1991; Dziga et al., 2017).

В России, несмотря на актуальность проблемы токсичных “цветений” водоемов исследования по оценке способности автохтонной микробиоты водных объектов разрушать альготоксины, в том числе микроцистины, до настоящего времени практически не проводились (Medvedeva, Kuzikova, 2021).

В настоящей работе была исследована биодеструкция микроцистина-LR природными микробоценозами разнотипных водных объектов Северо-Запада России. В задачи исследования входило документирование наличия/отсутствия процессов деградации МС-LR, определение кинетических характеристик и продуктов деструкции микроцистина.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Водные объекты и отбор проб. Пробы воды отбирали в водоемах, отличающихся как по природным характеристикам, так и по уровню антропогенной нагрузки – оз. Сестрорецкий Разлив, Нижнее Суздальское озеро, а также в Монастырской бухте и заливе Крестовый Ладожского озера (рис. 1, табл. 1).

Рис. 1.

Места отбора проб: 1 – Ладожское озеро, Валаамский архипелаг; 2 – озеро Сестрорецкий Разлив; 3 – Нижнее Суздальское озеро.

Таблица 1.

Характеристика водных объектов

Водный объект Использование Площадь,
га 		Минимальная (средняя) глубина, м Трофический статус рН Станция отбора
Оз. Сестрорецкий Разлив РК 1100 5.5 (1.6) Г
(Chernova et al., 2016) 		8.0 60.08827 с.ш.
29.972918 в.д.
Нижнее Суздальское озеро РК 97 4.5 (3.0) Э
(Chernova et al., 2016) 		7.7 60.05118 с.ш.
30.297482 в.д.
Ладожское озеро ИВ, РК, Р 1 787 000 230 (46.9) О–М
(Степанова и др., 2020) 		8.1 Залив Крестовый
61.362136 с.ш.
30.881358 в.д.
8.5 Монастырская бухта
61.383565 с.ш.
30.947269 в.д.

Примечание. ИВ – источник водоснабжения; Р – рыболовство; РК – рекреационные цели; Г – гипертрофное; О – олиготрофное; М – мезотрофное; Э – эвтрофное.

Отбор проб в озерах Нижнее Суздальское и Сестрорецкий Разлив проводили дважды – в отсутствие массового развития водорослей (24.05.2018 г.) и во время “цветения” водоемов (28.06.2018 г. и 08.08.2018 г. соответственно). В Ладожском озере (Валаамский архипелаг – залив Крестовый, Монастырская бухта) пробы отбирали 16.06.2018 г. в отсутствие “цветения” воды.

Образцы поверхностных вод (2 л) отбирали в стерильную посуду, фильтровали через 5 мкм мембранные фильтры (Whatman) и использовали для определения профиля цианобактериальных токсинов в природных образцах и в экспериментах по деструкции микроцистина-LR.

Определение профиля цианобактериальных токсинов и продуктов их деструкции в образцах природных вод. При определении профиля цианобактериальных токсинов и продуктов их деструкции для подготовки проб воды использовали метод твердофазной экстракции (Oasis HLB, Waters), а для проб отфильтрованной биомассы – экстракцию 75% водным метанолом под воздействием ультразвука. Анализ выполняли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии–масс-спектрометрии высокого разрешения (ВЭЖХ-МС-ВР) с использованием системы ВЭЖХ Prominence LC-20 (Shimadzu, Япония) в сочетании с масс-спектрометром LTQ Orbitrap XL (Thermo Fisher Scientific, США). Разделение анализируемых соединений проводили на колонке ThermoHypersil Gold RP C18 (100 × 3 мм, 3 мкм, Thermo Fisher Scientific) в режиме градиентного элюирования (0.2 мл/мин) смесью воды и ацетонитрила, содержащих 0.05% муравьиной кислоты. Масс-спектрометрический анализ проводили в условиях электрораспылительной ионизации в режиме детектирования положительных ионов. Целевые соединения идентифицировали на основании точного измерения массы ионов [М + Н]+ или [М + 2Н]2+ (разрешение 30000, точность в пределах 5 ppm) (Chernova et al., 2016), данных из спектров фрагментации (Чернова и др., 2016) и хроматографических времен удерживания. Количественное определение проводили методом внутреннего и внешнего стандартов.

Были использовали следующие реактивы: ацетонитрил (Криохром, сорт “0”), метанол (LiChrosolvhypergrade для LC-MS, Merck, Германия), муравьиная кислота (98–100%, FlukaChemika, Buchs, Швейцария); стандартные соединения микроцистинов MC-LR, MC-RR, MC-YR (SigmaAldrich), а также MC-LY, MC-LA, MC-LW, MC-LF, [D-Asp3] MC-LR и [D-Asp3] MC-RR (EnzoLifeSciences, Inc., США). Вода, очищенная с помощью системы Direct-Q (Millipore, электропроводность 0.056 μS/см при 25°C) (Массачусетс, США).

Деструкция микроцистина-LR. Микроцистин-LR (Sigma-Aldrich) вносили в 250 мл колбы Эрленмейера со 100 мл природной воды из расчета 100 мкг/л. Образцы инкубировали при температуре 21 ± 2°C, освещении 1000 лк в режиме свет : темнота = 12 : 12 ч до 60 сут. Образцы природных вод, стерилизованные при 1 атм в течение 30 мин и содержащие то же количество МС-LR, использовали в качестве контроля для определения абиотической деструкции токсина и испарения воды в процессе длительного инкубирования проб.

Для определения содержания МС-LR в воде образцы (5 мл) лиофилизировали и растворяли в 400 мкл 25%-го водного метанола. Надосадочную жидкость отделяли центрифугированием при 10 000 об./мин в течение 5 мин. Концентрацию МС-LR определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе HP1090 (“Hewlett-Packard”, США) с диодно-матричным детектором (длина волны 238 нм, разрешение 1.2 нм) по методике, описанной ранее (Medvedeva et al., 2017). Стандартный раствор МС-LR получен от Alexis Corporation (Швейцария).

Кинетические параметры деградации МС-LR в образцах рассчитывали в соответствии с уравнением реакции первого порядка:

$\frac{C}{{{{C}_{0}}~}} = {{e}^{{ - kt}}},~$
где С – концентрация МС-LR в пробе, мкг/л; С0 – исходная концентрация МС-LR, мкг/л; k – константа скорости реакции; t – время инкубирования, сут.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием Past 4.x software (http:// folk.vio.no/ohammer/past). Статистическую значимость различий между вариантами оценивали с помощью one-way Anova и Tukey’s post hoc теста. Для оценки нормальности данных и равенства дисперсий использовали Shapiro-Wilk и Levene тесты. Различия считались значимыми при р < 0.05. Все данные представлены как среднее значение ± ± стандартное отклонение трех независимых повторов каждого варианта с тремя параллельными повторностями в каждом.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В образцах, отобранных в водоемах, для которых характерно регулярное токсичное “цветение” воды (озера Сестрорецкий Разлив и Нижнее Суздальское), зарегистрированы структурные варианты микроцистинов, в том числе наиболее токсичный МС-LR (табл. 2, 3). Наименьшее разнообразие и количество внутриклеточных (26 нг/л) и отсутствие внеклеточных токсинов отмечено в образцах, отобранных до начала активной вегетации цианобактерий.

Таблица 2.

Содержание внутриклеточных токсинов в биомассе, отделенной при помощи фильтрации из проб воды

Микроцистин [M + H]+ Содержание микроцистинов, нг/л
Оз. Сестрорецкий разлив Нижнее Суздальское озеро
до “цветения” во время “цветения” до “цветения” во время “цветения”
[D-Asp3]MC-LR 981.54095 –   – –
MC-LR 995.55658 – 359 – 6
[D-Glu-OCH36]MC-LR 1009.57227 – 6 – –
[D-Asp3,Dha7]MC-RR 1010.54236 – 9 8 41
[Dha7]MC-FR 1015.52533 – 4 – –
[D-Asp3]MC-RR 1024.55798 25 815 14 133
[D-Asp3]MC-YR 1031.52026 – 198 – –
MC-RR 1038.57373 1 743 2 21
MC-YR 1045.53589 – 264 – –
MC-(H4)-YR 1049.56714 – 104 – –
[D-Asp3]MC-WR 1054.53625 – 51 – –
MC-WR 1068.55188 – 81 – –
Сумма МС   26 3267 26 228
Таблица 3.

Содержание внеклеточных токсинов в пробах воды

Микроцистин [M + H]+ Содержание микроцистинов, нг/л
Оз. Сестрорецкий Разлив Нижнее Суздальское озеро
до “цветения” во время “цветения” до “цветения” во время “цветения”
MC-LR 995.55658 – 1 – –
[D-Asp3]MC-RR 1024.55798 – 1 – –
MC-RR 1038.57373 – 1 – –
MC-YR 1045.53589 – 1 – –
Сумма МС   0 4 0 0

В образцах, отобранных в Сестрорецком Разливе во время “цветения” содержание внутриклеточных токсинов (11 структурных вариантов) достигало 3267 нг/л, внеклеточных – 4 нг/л. В пробах из Нижнего Суздальского озера во время “цветения” воды зарегистрировано наличие 5 структурных вариантов МС, их суммарное содержание в пробах биомассы составляло 228 нг/л, при этом внеклеточных токсинов детектировано не было. Следует отметить, что в озерах Сестрорецкий Разлив и Нижнем Суздальском, начиная с 2008 г., ежегодно детектируются микроцистины в период активной вегетации цианобактерий с доминированием потенциально токсичных видов Aphanizomenon flos-aquae (L.) Ralf et Born et Flah., Planktothrix agardhii (Gom.) Anagn. et Kom. и различных видов р. Microcystis (Chernova et al., 2016; Воякина и др., 2020).

В отличие от озер Сестрорецкий Разлив и Нижнее Суздальское информация о цианобактериальных цветениях и содержании цианотоксинов в прибрежной зоне Ладожского озера в районе Валаамского архипелага (Монастырская бухта и залив Крестовый) отсутствует. Это связано, прежде всего, с невысоким уровнем вегетации цианобактерий, несмотря на доминирование в планктоне потенциально токсичных видов Dolichospermum spiroides (Kleb.) Wacklinetal. (2009), Aphanizomenon flos-aquae, Planktothrix agardhii (Gom.) Anag. and Kom. (1988) и видов рода Woronichinia (Степанова и др., 2020).

В пробах, отобранных в Ладожском озере 16.06.2018 г., микроцистины также не были детектированы.

При инкубировании всех образцов природных вод с внесенным микроцистином-LR (100 мкг/л) наблюдается убыль токсина вне зависимости от уровня трофности и параметров водоема, времени отбора (в отсутствии или во время “цветения”), наличия или отсутствия токсичных “цветений” в предыдущие годы (рис. 2).

Рис. 2.

Деструкция МС-LR в образцах воды: а – Сестрорецкий разлив, б – Нижнее Суздальское озеро, в – Ладожское озеро, Монастырская бухта, г – Ладожское озеро, залив Крестовый; 1 – стерильные образцы; 2 – образцы, отобранные в отсутствие “цветения” воды; 3 – образцы, отобранные во время “цветения” воды.

Следует отметить, что в стерильных образцах (абиотический контроль) статистически значимых изменений концентрации МС-LR не выявлено (р ≥ 0.05), что свидетельствует о его микробной деградации в опытных вариантах.

Наиболее активно и без лаг-фазы деструкция МС-LR проходила в образцах воды, отобранных во время “цветения” в Сестрорецком Разливе и Нижнем Суздальском озере (рис. 2а, 2б, табл. 4).

Таблица 4.

Параметры кинетики деструкции МС-LR автохтонной микробиотой водных объектов

Место отбора Время отбора проб k, сут–1 Т50, сутки R2 Лаг-фаза, сутки
Оз. Сестрорецкий Разлив Во время цветения 0.24 ± 0.03а 3.1 ± 0.2 а 0.97 0
До цветения 0.16 ± 0.01б 9.6 ± 0.8 б 0.982 5
Нижнее Суздальское озеро Во время цветения 0.27 ± 0.02а 3.1 ± 0.2 а 0.962 0
До цветения 0.15 ± 0.02б 10 ± 2 б 0.941 5
Ладожское озеро, Монастырская бухта Отсутствие цветения 0.013 ± 0.001в ˃ 60 0.985 14
Ладожское озеро, залив Крестовый Отсутствие цветения 0.015 ± 0.001в 57.3 ± 1.1в 0.986 14

Примечание. Разные буквы (а, б, в) указывают на статистически значимые различия между местами отбора проб (р < 0.05).

Полная деструкция МС-LR в этих образцах отмечена на 11–12 сут инкубирования. Статистически значимых различий констант скорости и времени полураспада МС-LR в образцах, отобранных из “цветущих” Сестрорецкого Разлива и Нижнего Суздальского озера, не выявлено (р ≥ 0.05).

Разложение микроцистина автохтонной микробиотой этих водных объектов, отобранных в образцах воды до начала массового развития водорослей, характеризовалась меньшей скоростью деструкции (более чем в 1.5 раза) и увеличенным более чем в 3 раза временем полураспада МС-LR, по сравнению с аналогичными показателями “цветущих” объектов, а также наличием 5-ти суточной лаг-фазы.

В образцах воды, отобранных в Монастырской бухте и заливе Крестовом Ладожского озера, в которых ранее не были задокументированы токсичные цветения цианобактерий, и не были определены альготоксины, в том числе микроцистины, деструкция МС-LR также происходит, но со значительно меньшей скоростью по сравнению с ежегодно “цветущими” Сестрорецким Разливом и Нижним Суздальским озерами. В обоих образцах, отобранных в Ладожском озере, наблюдается длительная лаг-фаза (14–15 сут), и через 60 сут убыль МС-LR не превышала 29.6 и 50% для Монастырской бухты и залива Крестового соответственно. Скорость деструкции МС-LR в образцах воды Ладожского озера была в 11 раз ниже по сравнению с образцами воды, отобранными в Сестрорецком Разливе и Нижнем Суздальском озерах до начала активной вегетации цианобактерий.

Различия в скоростях деградации микроцистинов в окружающей среде может быть результатом различных факторов – температуры, рН, содержания органического вещества, присутствия ионов металлов (Fe3+, Al3+), состава и активности автохтонной микробиоты (Kumar et al., 2019). Хорошо известно, что скорость разложения МС природными сообществами микроорганизмов значительно выше, если в этом водном объекте уже наблюдались “цветения” и наличие МС в воде (Christoffersen et al., 2002; Dziga et al., 2017). Присутствие в водной среде микроцистинов приводит к изменению структуры бактериального сообщества и повышению в нем количества МС-деградирующих бактерий, а также к индукции ферментов, участвующих в процессах трансформации этих токсинов (Giaramida et al., 2013; Hu et al., 2021). В ряде исследований показано, что микроцистины индуцируют экспрессию генов mlr кластера, отвечающего за деструкцию этих токсинов у некоторых микроорганизмов (Shimizu et al., 2011; Maghsoudi et al., 2016). Для образцов воды, отобранных из водоемов, где ранее не фиксировались “цветения” и микроцистины, характерно наличие лаг-фазы, в течение которой происходит адаптация микробиоты к МС, индукция необходимых для их деструкции ферментов (Edwards et al., 2008; Dziga et al., 2017). В лабораторных условиях после лаг-фазы обычно следует быстрая стадия убыли микроцистинов (Edwards et al., 2008; Giaramida et al., 2013).

Полученные нами результаты частично согласуются с этими выводами. Самая длительная лаг-фаза – 15 сут, отмечена для образцов воды, отобранных в Монастырской бухте и заливе Крестовый, в которых ранее не было зафиксировано токсичных цианобактериальных цветений (рис. 2в, 2г, табл. 4).

Однако в отличие от данных зарубежных исследователей (Edwards et al., 2008) мы наблюдали лаг-фазу до 5 сут и для проб воды, отобранных из регулярно “цветущих” Сестрорецкого Разлива и Нижнего Суздальского озер, в которых ежегодно фиксируются микроцистины. Следует отметить, что лаг-фаза зафиксирована только в пробах, отобранных в этих водоемах до начала массового развития цианобактерий. В образцах воды во время “цветения” водоемов биодеструкция МС происходила значительно быстрее и без лаг-фазы.

Методом ВЭЖХ-МС-ВР в инкубированных с микроцистином образцах воды из Сестрорецкого Разлива, Нижнего Суздальского озер и Ладожского озера (залив Крестовый и Монастырская бухта) идентифицированы продукты деструкции МС-LR (рис. 3).

Рис. 3.

Масс-хроматограммы продуктов трансформации микроцистина-LR: а – Сестрорецкий Разлив, б – Нижнее Суздальское озеро, в – Ладожское озеро, залив Крестовый, г – Ладожское озеро, Монастырская бухта. RT – время удерживания.

Соединение с m/z 615.33785, фрагментный спектр которого соответствует описанному ранее продукту деструкции МС-LR тетрапептиду Adda-Glu-Mdha-Ala-OH (Bourne et al., 1996), детектирован во всех анализируемых образцах (рис. 4). Фрагментные спектры содержали характеристичные дочерние ионы с m/z 598; 566; 509; 477; 464; 375, приведенные в (Bourne et al., 1996).

Рис. 4.

Фрагментный спектр тетрапептида (m/z 615).

Наряду с тетрапептидом (m/z 615) в образцах, отобранных в Ладожском озере, детектировано соединение с m/z 1013, 56497 (рис. 3в).

Соединение с m/z 1013.56497, фрагментный спектр которого представлен на рис. 5, идентифицировано как линеализированная форма МС-LR – Adda-Glu-Mdha-Ala-Leu-Masp-Arg-OH. Фрагментные спектры содержали характеристичные дочерние ионы с m/z 995; 862; 571; 488, приведенные в (Bourne et al., 1996), и кроме того, дочерние ионы, присутствующие в фрагментном спектре MC-LR с m/z 995; 977; 844; 728; 710; 682; 599; 571; 553; 470 (Чернова и др., 2016).

Рис. 5.

Фрагментный спектр линеализированного МС-LR (m/z 1013).

Наличие в продуктах деструкции МС-LR тетрапептида с m/z 615 и линеализированной формы МС-LR с m/z 1013 свидетельствует о биохимическом пути деградации микроцистина бактериальными штаммами, имеющими кластер генов mlr (Bourne et al., 1996; Dziga et al., 2017). Биохимические пути деградации микроцистинов бактериями, имеющими ген mlr, хорошо изучены для бактерий рр. Sphingopyxis, Sphingomonas, Stenotrophomonas, а также Bacillus, Novosphingomonas и некоторых других (Li et al., 2017; Massey, Yang, 2020). Тем не менее, mlr деградация микроцистинов не является единственным путем их трансформации. Кластер генов mlr не детектирован у некоторых МС-деградирующих бактерий, в т.ч. Arthrobacter sp., Brevibacterium sp., Rhodococcus sp., Aeromonas sp., Paucibacter sp. (Li et al., 2017). Обсуждается наличие альтернативных путей биохимической трансформации микроцистинов автохтонной микробиотой озера Эри (Северная Америка), ряда озер Польши, в которых не были детектированы mlr гены деструкции (Krishnan et al., 2018; Krausfeldt et al., 2019; Salter et al., 2021).

Продукты трансформации МС-LR, отличные от промежуточных продуктов mlr-деструкции, – коньюгаты микроцистина с глутатионом МС-LR-Glu (m/z 651.82356) и с цистеином МС-LR-Cys (m/z 1116.56628) детектированы нами в процессе биодеструкции МС-LR автохтонной микробиотой Ладожского озера (залив Крестовый и Монастырская бухта) (рис. 6). Идентификация данных конъюгатов осуществлялась по точной массе протонированного молекулярного иона, а также согласно данным фрагментных спектров. В фрагментом спектре соединения с m/z 651, соответствующего МС-LR-Glu, отмечали присутствие характеристического дочернего иона c m/z 587, а в фрагментом спектре соединения c m/z 1116, соответствующего MC-LR-Cys, дочерних ионов с m/z 1029 и 599 (Esterhuizen-Londt et al., 2017). Кроме того, в фрагментном спектре последнего присутствовали дочерние ионы, принадлежащие MC-LR: 553; 571; 599; 682; 710; 728 (Чернова и др., 2016).

Рис. 6.

Фрагментные спектры коньюгатов МС-LR с глутатионом (m/z 651) (а) и цистеином (m/z 1116) (б).

Несмотря на то, что роль глутатиона в бактериальной деградации микроцистинов еще не подтверждена, известно, что первой стадией биодеградации МС-LR высшими растениями Ceratophyllum demersum, беспозвоночными Daphnia magma, моллюсками Dreissena polymorfa, крысами является коньюгация МС с GSH с последующим образованием цистеинового коньюгата MC-LR-CYS (Schmidt et al., 2014; Krausfeldt et al., 2019). Учитывая роль GSH в бактериальной деградации многих ксенобиотиков (Allocati et al., 2009), предполагается участие глутатиона и в микробном метаболизме микроцистина (Mou et al., 2013; Krausfeldt et al., 2019). Полученные нами результаты подтверждают ранее высказанную гипотезу о широком распространении в природных объектах микроорганизмов, способных разлагать микроцистины как по mlr механизму, так и по другим биохимическим путям, в том числе с образованием коньюгатов микроцистина с глутатионом и цистеином (Krausfeldt et al., 2019; Salter et al., 2021).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Микробная деградация микроцистинов играет важнейшую роль в снижении их концентрации в природных объектах. В настоящей работе установлено, что деструкция наиболее токсичного МС-LR автохтонной микробиотой происходит в образцах воды разнотипных водных объектов Северо-Запада РФ с площадью от 97 до 1 787 000 га, глубиной от 4.5 до 230 м, уровнем трофности от мезо- до гипертрофного. Структурные изомеры микроцистинов, в т.ч. МС-LR определены только в образцах воды, отобранных в Сестрорецком Разливе и Нижнем Суздальском озерах, в которых ежегодно отмечается массовое развитие цианобактерий. При этом максимальное содержание микроцистинов 3271 нг/л (Сестрорецкий Разлив) и 228 нг/л (Нижнее Суздальское озеро) отмечено в пробах, отобранных в период “цветения” этих водоемов.

Автохтонная микробиота изучаемых объектов деградировала МС-LR независимо от истории “цветения” водоемов и их предварительной экспозиции с микроцистинами. Однако максимальная скорость деструкции МС-LR отмечена в водных образцах, отобранных в Сестрорецком Разливе и Нижнем Суздальском озерах в период массового развития цианобактерий. Скорость деструкции МС-LR в образцах воды в отсутствие “цветения” была ниже в 1.5 раза (Сестрорецкий Разлив и Нижнее Суздальское озера) и 18 раз (Ладожское озеро) по сравнению с “цветущими” водоемами. В этих же образцах наблюдалась лаг-фаза от 5 до 15 сут соответственно. Обычно лаг-фаза требуется для адаптации автохтонной микробиоты к МС-LR, увеличению количества МС-деградирующих микроорганизмов в популяции.

Состав детектируемых продуктов биодеструкции МС-LR позволяет предположить разные пути деградации МС в изучаемых водных объектах. Идентификация в продуктах деструкции линеализированного МС-LR (m/z 1013) и тетрапептида (m/z 615) свидетельствует о наличии в составе автохтонной микробиоты всех изучаемых водных объектов микроорганизмов, обладающих кластером генов mlr, отвечающих за деструкцию микроцистинов у целого ряда бактериальных культур рр. Sphingopyxis, Sphingomonas, Stenotrophomonas, Bacillus, Novosphingomonas.

Наличие в продуктах деструкции МС-LR микробиотой Ладожского озера (залив Крестовый, Монастырская бухта) коньюгатов МС-LR с глутатионом (m/z 651) и цистеином (m/z 1116) свидетельствует о присутствии в этих образцах микроорганизмов, способных деструктировать МС-LR не только по mlr механизму, но и по другому биохимическому пути с участием глутатиона.

Полученные нами результаты подтверждают ранее выдвинутую гипотезу о широком распространении способности автохтонной микробиоты различных водных объектов к деструкции микроцистинов, которая может осуществляться как по mlr механизму, так и другими биохимическими путями. Представленные в данном исследовании данные важны для понимания процессов детоксикации автохтонной микробиотой водных объектов, загрязненных микроцистинами, а также могут быть использованы для выделения новых МС-деградирующих микроорганизмов.

Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (тема № 122041100086-5).

Список литературы

  1. Белякова З.Н., Волошко Л.Н., Гаврилова О.В., Гогорев З.М., Макарова Ю.Б., Рундина Л.А. Водоросли, вызывающие “цветение” водоемов Северо-Запада России. М.: Товарищество научных изданий КМК, 2006. 367 с.

  2. Воякина Е.Ю., Русских Я.В., Чернова Е.Н., Жаковская З.А. Токсичные цианобактерии и их метаболиты в водоемах Северо-Запада России // Теорeтическая и прикладная экология. 2020. № 1. С. 124–129. https://doi.org/10.25750/1995-4301-2020-1-124-129

  3. Степанова А.Б., Воякина Е.Ю., Бабин А.В., Зуева Н.В., Зуев Ю.А. Результаты исследований прибрежной зоны Ладожского озера в районе Валаамского архипелага (1998–2019 гг.) в РГГМУ // Гидрометеорология и экология. 2020. № 60. С. 325–350. (Stepanova A.B., Voyakina E.Yu., Babin A.V., Zueva N.V., Zuev Yu.A. Results of studies of the coastal zone of Lake Ladoga in the area of the Valaam archipelago (1998–2019) at RSHU // Gidrometeorologiya i Ekologiya. Hydrometeorology and Ecology (Proceedings of the Russian State Hydrometeorological University). 2020. № 60. P. 325–350) https://doi.org/10.33933/2074-2762-2020-60-325-350

  4. Чернова Е.Н., Русских Я.В., Подольская Е.П., Жаковская З.А. Определение микроцистинов и анатоксина-а методом жидкостной хромато-масс-спектрометрии низкого разрешения // Научное приборостроение. 2016. Т. 26. № 1. С. 11–25.

  5. Allocati N., Federici L., Masulli M., Di Ilio C. Glutathione transferases in bacteria // FEBS J. 2009. V. 276. P. 58–75. https://doi.org/10.1111/j.1742-4658.2008.06743.x

  6. Bourne D.G., Jones G.J., Blakeley R.L., Jones A., Negri A.P., Riddles P. Enzymatic pathway for the bacterial degradation of the cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin LR // Appl. Environ. Microbiol. 1996. V. 62. № 11. P. 4086–4094. https://doi.org/10.1128/AEM.62.11.4086-4094.1996

  7. Bukowska A., Kaliński T., Chróst R.J. Degradation of microcystins by water and bottom sediment bacterial communities from a eutrophic freshwater lake // Aquat. Microb. Ecol. 2018. V. 82. № 523. P. 129–144. https://doi.org/10.3354/ame01887

  8. Cao Q., Steinman A.D., Yao L., Xie L. Effects of light, microorganisms, farming chemicals and water content on the degradation of microcystin-LR in agricultural soils // Ecotoxicol Environ Saf. 2018. V. 156. P. 141–147. https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2018.03.030

  9. Carmichael W.W., Boyer G.L. Health impacts from cyanobacteria harmful algae blooms: Implications for the North American Great Lakes // Harmful Algae. 2016. V. 54. P. 194–212. https://doi.org/10.1016/j.hal.2016.02.002

  10. Chernova E., Russkikh I., Voyakina E., Zhakovskaya Z. Occurrence of microcystins and anatoxin-a in eutrophic lakes of Saint Petersburg, Northwestern Russia // Oceanol Hydrobiol Stud. 2016. V. 45. № 4. P. 466–476. https://doi.org/10.1515/ohs-2016-0040

  11. Chorus I., Bartram J. Toxic Cyanobacteria in Water: a Guide to Public Health Significance, Monitoring and Management // World Health Organization. London: Für WHO durch E & FN Spon / Chapman & Hall, 1999. 416 p.

  12. Chorus I., Falconer I.R., Salas H.J., Bartram J. Health risks caused by freshwater cyanobacteria in recreational waters // J. Toxicol. Environ. Health. Part B. 2000. V. 3. № 4. P. 323–347. https://doi.org/10.1080/109374000436364

  13. Christoffersen K., Lyck S., Winding A. Microbial activity and bacterial community structure during degradation of microcystins // Aquat. Microb. Ecol. 2002. V. 27. № 2. P. 125–136. https://doi.org/10.3354/ame027125

  14. Codd G.A., Lindsay J., Young F.M., Morrison L., Metcalf J.S. Harmful cyanobacteria: From mass mortalities to management measures // Harmful cyanobacteria / Eds Huisman J., Matthijs H.C.P., Visser P.M.; Netherlands: Springer, 2005. P. 1–23.

  15. Cyanobacterial toxins: microcystins. Background document for development of WHO Guidelines for drinking-water quality and Guidelines for safe recreational water environments. Geneva: World Health Organization 2020 (WHO/HEP/ECH/WSH/2020.6). Licence: CC BY-NCSA 3.0 IGO.

  16. Dziga D., Maksylewicz A., Maroszek M., Budzyńska A., Napiorkowska-Krzebietke A., Toporowska M., Grabowska M., Kozak A., Rosińska J., Meriluoto J. The biodegradation of microcystins in temperate freshwater bodies with previous cyanobacterial history // Ecotoxicol Environ Saf. 2017. V. 145. P. 420–430. https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2017.07.046

  17. Edwards C., Graham D., Fowler N., Lawton L.A. Biodegradation of microcystins and nodularin in freshwaters // Chemosphere. 2008. V. 73. № 8. P. 1315–1321. https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2008.07

  18. Esterhuizen-Londt M., Hertel S., Pflugmacher S. Uptake and biotransformation of pure commercial microcystin-LR versus microcystin-LR from a natural cyanobacterial bloom extract in the aquatic fungus Mucor hiemalis // Biotechnology letters / Eds Esterhuizen-Londt M., Hertel S., Pflugmacher S. 2017. V. 39. № 10. P. 1537–1545. https://doi.org/10.1007/s10529-017-2378-2

  19. Giaramida L., Manage P.M., Edwards C., Singh B.K., Lawton L.A. Bacterial communities’ response to microcystins exposure and nutrient availability: Linking degradation capacity to community structure // Int. Biodeterior. Biodegradation. 2013. V. 84. P. 111–117. https://doi.org/10.1016/j.ibiod.2012.05.036

  20. Ho L., Dreyfus J., Boyer J., Lowe T., Bustamante H., Duker P., Meli T., Newcombe G. Fate of cyanobacteria and their metabolites during water treatment sludge management processes // Sci. Total Environ. 2012. V. 424. P. 232–238. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2012.02.025

  21. Hu C., Zuo Y., Peng L., Gan N., Song L. Widespread Distribution and Adaptive Degradation of Microcystin Degrader (mlr-Genotype) in Lake Taihu, China // Toxins. 2021. V. 13. Article 864. https://doi.org/10.3390/toxins13120864

  22. Kiviranta J., Sivonen K., Lahti K., Luukkainen R., Niemelä S.I. Production and biodegradation of cyanobacterial toxins – a laboratory study // Arch. Hydrobiol. 1991. V. 121. № 3. P. 281–294. https://doi.org/10.1127/archiv-hydrobiol/121/1991/281

  23. Krausfeldt L.E., Steffen M.M., Mckay R.M., Bullerjahn G.S., Boyer G.L., Wilhelm S.W. Insight into the molecular mechanisms for microcystin biodegradation in Lake Erie and Lake Taihu // Front. Microbiol. 2019. V. 10. Article 2741. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.02741

  24. Krishnan A., Zhang Y.-Q., Mou X. Isolation and Characterization of Microcystin-Degrading Bacteria from Lake Erie // Bull Environ Contam and Toxicol. 2018. https://doi.org/10.1007/s00128-018-2468-4

  25. Kumar P., Hegde K., Brar S.K., Cledon M., Kermanshahi-Pour A. Potential of biological approaches for cyanotoxin removal from drinking water: A review // Ecotoxicol Environ Saf. 2019. V. 172. P. 488–503. https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2019.01.066

  26. Lezcano M.Á., Quesada A., El-Shehawy R. Seasonal dynamics of microcystin-degrading bacteria and toxic cyanobacterial blooms: Interaction and influence of abiotic factors // Harmful Algae. 2018. V. 71. P. 19–28. https://doi.org/10.1016/j.hal.2017.11.002

  27. Li J., Li R., Li J. Current research scenario for microcystins biodegradation – A review on fundamental knowledge, application prospects and challenges // Sci Total Environ. 2017. V. 595. P. 615–632. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2017.03.285

  28. Li J., Li J., Shi G., Mei Z., Wang R., Li D. Discerning biodegradation and adsorption of microcystin-LR in a shallow semi-enclosed bay and bacterial community shifts in response to associated process // Ecotoxicol Environ Saf. 2016. V. 132. P. 123–131. https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2016.05.033

  29. Maghsoudi E., Fortin N., Greer C., Maynard C., Pagé A., Duy S.V., Sauvé S., Prévost M., Dorner S. Cyanotoxin degradation activity and mlr gene expression profiles of a Sphingopyxis sp. isolated from Lake Champlain, Canada // Environ Sci Process Impacts. 2016. V. 18. № 11. P. 1417–1426. https://doi.org/10.1039/c6em00001k

  30. Massey I.Y., Yang F.A. Mini Review on Microcystins and Bacterial Degradation // Toxins. 2020. V. 12. № 4. 268. https://doi.org/10.3390/toxins12040268

  31. Medvedeva N.G., Kuzikova I.L. Mycrocystin-LR degradation by indigenous bacterial community of Rybinsk reservoir // IOP Conference Series “Earth and Environmental Science”. 2021. V. 834. № 1. Article 012066. https://doi.org/10.1088/1755-1315/834/1/012066

  32. Medvedeva N., Zaytseva T., Kuzikova I. Cellular responses and bioremoval of nonylphenol by the bloom-forming cyanobacterium Planktothrix agardhii 1113 // J. Mar. Syst. 2017. V. 171. P. 120–128. https://doi.org/10.1016/j.jmarsys.2017.01.009

  33. Meriluoto J., Spoof L., Codd G.A. Handbook of Cyanobacterial Monitoring and Cyanotoxin Analysis. John Wiley and Sons, Ltd, Chichester, UK. 2017.

  34. Mou X., Lu X., Jacob J., Sun S., Heath R. Metagenomic identification of bacterioplankton taxa and pathways involved in microcystin degradation in Lake Erie // PloS one. 2013. V. 8. № 4. Article e61890. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0061890

  35. Rapala J., Lahti K., Sivonen K., Niemelä S. Biodegradability and adsorption on lake sediments of cyanobacterial hepatotoxins and anatoxin-a // Lett. Appl Microbiol. 1994. V. 19. P. 423–428. https://doi.org/10.1111/j.1472-765x.1994.tb00972.x

  36. Rastogi R.P., Sinha R.P., Incharoensakdi A. The cyanotoxin-microcystins: current overview // Rev. Environ. Sci. Biotechnol. 2014. V. 13. P. 215–249. https://doi.org/10.1007/s11157-014-9334-6

  37. Redouane E.M., El Amrani Zerrifi S., El Khalloufi F., Oufdou K., Oudra B., Lahrouni M., Campos A., Vasconcelos V. Mode of action and fate of microcystins in the complex soil-plant ecosystems // Chemosphere. 2019. V. 225. P. 270–281. https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2019.03

  38. Salter C., VanMensel D., Reid T., Birbeck J., Westrick J., Mundle S.O.C., Weisener C.G. Investigating the microbial dynamics of microcystin-LR degradation in Lake Erie sand // Chemosphere. 2021. V. 272. Article 129873. https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2021.12

  39. Schmidt J., Wilhelm S., Boyer G. The Fate of Microcystins in the Environment and Challenges for Monitoring // Toxins. 2014. V. 6. № 12. P. 3354–3387. https://doi.org/10.3390/toxins6123354

  40. Shimizu K., Maseda H., Okano K., Itayama T., Kawauchi Y., Chen R., Zhang Z., Sugiura N. How microcystin-degrading bacteria express microcystin degradation activity // Lakes & Reservoirs: Research & Management. 2011. V. 16. № 3. P. 169–178. https://doi.org/10.1111/j.1440-1770.2011.00480.x

  41. Sivarajah B., Simmatis B., Favot E.J., Palmer M.J., Smol J.P. Eutrophication and climatic changes lead to unprecedented cyanobacterial blooms in a Canadian sub-Arctic landscape // Harmful Algae. 2021. V. 105. Article 102036. https://doi.org/10.1016/j.hal.2021.102036

  42. Sivonen K., Jones G. Chapter 3: Cyanobacterial toxins. In: Chorus I., Bartram J. (Eds.), Toxic Cyanobacterial in Water: A Guide to Their Public Health Consequences, Monitoring and Management. WHO, 1999. P. 55–124.

  43. Toruńska-Sitarz A., Kotlarska E., Mazur-Marzec H. Biodegradation of nodularin and other nonribosomal peptides by the Baltic bacteria // Int Biodeterior Biodegradation. 2018. V. 134. P. 48–57. https://doi.org/10.1016/j.ibiod.2018.08.004

  44. Tsuji K., Naito S., Kondo F., Ishikawa N., Watanabe M.F., Suzuki M., Harada K. Stability of microcystins from cyanobacteria: effect of light on decomposition and isomerization // Environ. Sci. Technol. 1994. V. 28. P. 173–177. https://doi.org/10.1021/es00050a024

  45. Zurawell R.W., Chen H., Burke J.M., Prepas E.E. Hepatotoxic cyanobacteria: a review of the biological importance of microcystins in freshwater environments // J. Toxicol. Environ. Health, Part B: Critical Reviews. 2005. V. 8. P. 1–37. https://doi.org/10.1080/10937400590889412

  46. Zhu F.-P., Han Z.L., Duan J.L., Shi X.S., Wang T.T., Sheng G.P., Wang S.-G., Yuan X.-Z. A novel pathway for the anaerobic biotransformation of microcystin-LR using enrichment cultures // Environ Polut. 2019. V. 247. P. 1064–1070. https://doi.org/10.1016/j.envpol.2019.02.013

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Известия РАН. Серия биологическая

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал