Известия РАН. Серия биологическая, 2023, № 6, стр. 716-720

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Скребень Acantocephalus tenuirostris – широко распространенный паразит хариусов и многих других пресноводных рыб Дальнего Востока и Северо-Востока России, промежуточным хозяином которого является водяной ослик Asellus hilgendorphi (Атрашкевич и др., 2005). Осенью 2019 г. были проведены два эксперимента по моделированию жизненного цикла этого скребня. В каждом эксперименте подопытными были 40 водяных осликов, отловленных в р. Амутты (бассейн р. Буюнда правый приток р. Колыма). Самки скребня были извлечены из хариуса, отловленного в р. Эльген (левом притоке р. Колыма). Заражение происходило путем бесконтрольного скармливания водяным осликам фрагментов самок скребня (по одной в каждом эксперименте) со зрелыми яйцами в течение суток. Через сутки водяные ослики были помещены в небольшие емкости с пресной водой и мхом рода Calliergon, которые содержались в термокамерах.

Первый эксперимент проходил при температуре 14–15°C. На 60-й день эксперимента при вскрытии четырех водяных осликов было получено 2 цистаканта и 18 акантелл разных размеров. Второй эксперимент проводился при температуре 20–22°C. На 60-й день эксперимента при вскрытии пяти водяных осликов было найдено 3 цистаканта и 15 акантелл разных размеров. На 65-й день было вскрыто 3 водяных ослика и найдены 1 цистакант и 9 акантелл разных размеров.

Полученные скребни были зафиксированы в 2% растворе глутарового альдегида на 0.1 М фосфатном буфере, постфиксированы в 2% растворе тетраоксида осмия на 0.2 М фосфатном буфере, обезвожены в спиртах возрастающей концентрации (в процессе обезвоживания образцы контрастировали в 1% растворе уранилацетата на 70% спирте в течение 12 ч) и заключены в смесь Эпона и Аралдита.

Полутонкие и ультратонкие срезы были получены с помощью микротомов LKB-V (Швеция) и PT-PC (США), соответственно. Полутонкие срезы окрашивали смесью метиленового синего и кристаллического фиолетового в соотношении 1 : 1 на 2.5% растворе бикарбоната натрия и исследовали с помощью светового микроскопа Olympus CX41 с использованием фотокамеры Olympus E-420. Ультратонкие срезы дополнительно контрастировали в 1% растворе уранилацетата на 70% спирте в течение 2 ч и исследовали с использованием трансмиссионного электронного микроскопа JEM1400PLUS и фотокамеры SIS Veleta. Полученные фотографии обрабатывали с помощью пакета программ CorelDRAW 18. Всего были исследованы 5 поздних акантелл и 6 цистакантов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Поздние акантеллы окружены двуслойной цистой, толщиной 0.7 мкм (рис. 1а). Наружный слой цисты, толщиной 0.57 мкм, образован рыхло организованным материалом умеренной электронной плотности. В составе этого материала определяются аморфные скопления, везикулы, диаметром 33 нм, неясные структуры, напоминающие фрагменты микроворсинок, длиной 0.2 мкм и диаметром до 22 нм, и электронно-плотные гранулы. Внутренний слой цисты, толщиной 0.12 мкм, образован аморфным материалом высокой электронной плотности, визуально организованным более плотно, чем наружный слой.

Рис. 1.

Поверхность тегумента. (а) – поздняя акантелла, (б–г) – цистаканты. ввс – выраженный везикулярный слой тегумента, п – светлые полости, тег – тегумент. Фигурной скобкой показана циста. Стрелкой с одинарным наконечником показан разрыв цисты, с двойным – толстый слой гликокаликса. Масштаб: а, г – 2 мкм; б – 1 мкм; в – 20 мкм.

Поверхностная часть тегумента акантелл образована покровным комплексом без заметного слоя гликокаликса на его поверхности (рис. 1а). Покровный комплекс пронизан многочисленными инвагинатами наружной плазматической мембраны, открывающимися на его поверхности порами, диаметром 0.12 мкм. Инвагинаты расширены и их терминальные участки образуют везикулярный слой тегумента. Некоторые инвагинаты содержат небольшие скопления аморфного материала, сходного с материалом, образующим внутренний слой цисты, а также везикулы, по морфологии сходные с везикулами, обнаруженными в наружном слое цисты.

В толще тегумента наблюдаются светлые полости, достигающие в диаметре 2.2 мкм, с электронно-плотным содержимым неясной природы (рис. 1а). Похожие полости, но без плотного содержимого отмечаются вблизи слоя инвагинатов; в некоторых случаях полости и терминальные участки инвагинатов сливаются.

Поверхность трех исследованных цистакантов покрыта слоем гликокаликса, толщиной 0.3 мкм, образованным аморфным материалом умеренной электронной плотности, в котором наблюдаются мелкие светлые участки (рис. 1б). Вплотную к наружной поверхности гликокаликса примыкает двуслойная циста. В отличие от цисты, окружающей поздних акантелл, толщина цисты цистакантов не превышает 0.5 мкм, и составляющий ее материал организован заметно плотнее.

Инвагинаты наружной мембраны цистакантов приобретают форму ампул: на большем своем протяжении они сужены и придают радиальную исчерченность поперечно-полосатому слою тегумента, тогда как расширения их терминальных участков, образующих везикулярный слой тегумента, не превышают 0.32 мкм. Крупные светлые полости, содержащие электронно-плотный материал, описанные в тегументе поздних акантелл, в тегументе цистакантов не обнаружены.

У трех цистакантов целостность цисты была механически нарушена при препарировании гельминтов (рис. 1в, 1г). В этих случаях гликокаликс был отдален от тегумента на некоторое расстояние, но сохранял непрерывный контакт с цистой (рис. 1г). Другие изменения в строении тегумента этих цистакантов не обнаружены.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Согласно существующим представлениям, циста, окружающая цистаканта, и толстый слой гликокаликса на его поверхности в числе прочих функций обеспечивают защиту паразита от негативного ответа промежуточного хозяина на инвазию (Lumsden, 1968; Никишин, 2004 и др.). При этом формирование цисты происходит в течение почти всего периода развития паразита в промежуточном хозяине вплоть до стадии цистаканта (Nikishin, 1992), тогда как образование гликокаликса представляет собой кратковременный процесс, который может рассматриваться как завершающий этап этого развития (Никишин, 2004). Такая очередность, вероятно, обусловлена тем, что обе структуры (и циста, и гликокаликс) формируются в результате секреторной деятельности тегумента, точнее, инвагинатов наружной цитоплазматической мембраны, образующих поперечно-полосатый слой тегумента (Никишин, 2004). Полученные результаты подтверждают этот вывод, и расширение инвагинатов у поздних акантелл может быть связано с их секреторной функцией. У цистакантов, уже сформировавших цисту и толстый слой гликокаликса, инвагинаты сужены, и поперечно-полосатый слой принимает “обычный” вид, характерный для взрослых скребней, инвазирующих окончательных хозяев.

Интерпретация крупных светлых полостей с содержимым высокой электронной плотности, обнаруженных в тегументе поздних акантелл, затруднительна. В имеющейся литературе аналогов этой находки не обнаружено. Создается впечатление, что эти полости мигрируют из глубины тегумента к поперечно-полосатому слою, в процессе миграции утрачивают содержимое и сливаются с расширенными инвагинатами наружной цитоплазматической мембраны. Косвенным аргументом в пользу этой версии является отсутствие подобных полостей в тегументе цистакантов, у которых циста и гликокаликс сформированы полностью и секреторная активность тегумента снижена.

Необычной оказалась тесная связь толстого слоя гликокаликса и цисты у цистакантов. Предположение, что эта связь возникает вследствие значительного роста паразита, происходящего после формирования цисты, может быть поддержано только фактом “малого жизненного пространства” в полости тела водяного ослика в случаях высокой интенсивности инвазии; именно такие случаи наблюдались в эксперименте. Не исключая “механического” фактора, более привлекательной выглядит гипотеза о химическом сходстве материала гликокаликса и цисты, впервые высказанная на основании гистохимического изучения этих структур у метацеркарий трематод (Lumsden, 1968; Lumsden, 1975). В пользу этой гипотезы косвенно свидетельствует факт сохранения тесного контакта цисты и гликокаликса даже в случае отделения гликокаликса от тегумента.

Явление отделения гликокаликса от тегумента наблюдалось у ряда организмов, ведущих паразитический образ жизни. Биохимия этого процесса была описана у простейших (Zambrano-Vila et al., 2002), шистосомул Schistosoma mansoni (Samuelson, Caulfield, 1982), в культуре эксцистированных церкарий Fasciola hepatica (Lammas, Duffus, 1983), церкарий Trichobilharzia regenti (Řimnáčová et al., 2017) и в ряде других случаев. Биологический смысл этого явления заключается в уклонении от иммунного ответа хозяина (Zambrano-Vila et al., 2002; Řimnáčová et al., 2017 и др.) путем сбрасывания гликокаликса, подвергшегося или воздействию комплемента и антител (Samuelson, Caulfield, 1982; Da’dara, Krauts-Peterson, 2014 и др.) или инкубации при температуре 37°C (Lammas, Duffus, 1983). При этом в случаях трансформации церкарий в шистосомулы сбрасывание гликокаликса происходит вместе с наружной мембраной тегумента (Samuelson, Caulfield, 1982; Řimnáčová et al., 2017). Однако морфология процесса утраты гликокаликса до недавнего времени не документировалась.

Электронно-микроскопически это явление впервые наблюдалось у скребня Corynosoma strumosum, инвазирующего обычных паратенических хозяев этого паразита: в экспериментальной инвазии толстощека Миддендорфа Hadropareia middendorffii на третьи сутки эксперимента и в естественной инвазии тихоокеанского белокорого палтуса Hippoglossus stenolepis (Скоробрехова, Никишин, 2023). В толстощеках на четырнадцатые сутки эксперимента все коринозомы были покрыты толстым слоем гликокаликса, что дало основания предположить его вторичное образование взамен утраченного, обогащенного результатами иммунного ответа хозяина. У коринозом в палтусе тегумент вместе с толстым слоем гликокаликса утрачивал и наружную мембрану, а на ее месте формировалась новая мембрана (Скоробрехова, Никишин, 2023); подобный феномен ранее был продемонстрирован иммунологическими исследованиями трематод (Horak et al., 1998).

В отличие от упомянутых случаев, касающихся скребней, паразитирующих в паратенических хозяевах, в настоящей работе впервые описаны случаи отделения гликокаликса от тегумента у цистакантов, паразитирующих в промежуточном хозяине. Второе отличие заключается в том, что у скребней в паратенических хозяевах отделение гликокаликса было вызвано, по всей видимости, естественными причинами, а в случаях с исследованными здесь цистакантами это явление могло быть спровоцировано нарушением целостности цисты.

Ранее мы предположили, что стратегия уклонения тканевых паразитов от иммунного ответа хозяина путем смены/обновления поверхностной части их организма носит общий характер (Скоробрехова, Никишин, 2023). Полученные здесь результаты не противоречат этому предположению, однако необходимы дальнейшие исследования распространения этого феномена среди других групп паразитических червей, например, цистицеркоидов цестод.

Исследования проведены в ходе выполнения государственного задания по теме: “Гельминты в биоценозах северо-восточной Азии: биоразнообразие, морфология и молекулярная филогенетика” (№ 1021060307693-0).