1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Известия РАН. Серия физическая
  4. T. 84, № 11, 2020

Известия РАН. Серия физическая, 2020, T. 84, № 11, стр. 1580-1586

Исследование гидродинамических параметров коллоидов наночастиц методом динамического светорассеяния

А. В. Иванова 1, *, А. А. Никитин 1, М. А. Абакумов 1, 2

1 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования “Национальный исследовательский технологический университет “МИСиС”
Москва, Россия

2 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования “Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова” Министерства здравоохранения Российской Федерации
Москва, Россия

* E-mail: super.fosforit@yandex.ru

Поступила в редакцию 18.06.2020
После доработки 10.07.2020
Принята к публикации 27.07.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Разработана методика многоступенчатого синтеза однодоменных монодисперсных наночастиц (НЧ) магнетита (Fe3O4), модифицированных органическими лигандами. Методом динамического светорассеяния измерены гидродинамические параметры коллоидов синтезированных наночастиц, Показано, что способ функционализации наночастиц лигандами влияет на гидродинамические параметры получаемых коллоидов, несмотря на идентичность конечных продуктов.

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время одним из интенсивно развивающихся перспективных направлений в области биомедицины является исследование малоразмерных объектов: наночастиц (НЧ) и наноматериалов [1]. Одними из наиболее широко применяемых нанообъектов являются магнитные наночастицы, которые используются для целевой доставки лекарственных препаратов, в качестве контрастных агентов в МРТ-диагностике, механических манипуляциях в низкочастотном магнитном поле и магнитной гипертермии [2, 3]. Наиболее простым способом получения магнитных НЧ является метод термического разложения железосодержащих прекурсоров в высококипящих органических растворителях (например, 1-октадецен, дибензиловый, дифениловый эфир) с добавлением различных гидрофобных поверхностно-активных веществ, таких как олеиновая кислота и ее производные, для контролирования процесса формирования и роста магнитного ядра. Полученные таким способом магнитные НЧ обладают стабильностью (агрегативной устойчивостью) только в неполярных органических растворителях, таких как гексан или дихлорметан. В связи с этим требуется дальнейшая функционализация поверхности НЧ для их стабилизации в водных растворах и дальнейшего использования в биомедицинских приложениях. Современные подходы предполагают использование стабилизаторов на основе органических мономеров (лактобионовая кислота, лауриновая кислота) [4], а также природных (бычий или человеческий сывороточный альбумин [5] и синтетических полимеров (полиэтиленимид (ПЭИ), полливинилпирролидон (ПВП), поливинилацетат (ПВА), полиэтиленгликоль (ПЭГ)) [6]. Использование ПЭГ предпочтительно благодаря его биосовместимости [7], что препятствует снижению агрегации НЧ, позволяя значительно увеличить среднее время их циркуляции по кровотоку, а также распознаванию НЧ макрофагами ретикулоэндотелиальной системы. Однако одной из наиболее сложных задач, которые предстоит решить, является достижение длительной стабильности раствора коллоидов магнитных НЧ. Для этого необходимо тщательно подбирать стабилизирующие молекулы. В работах, посвященных функционализации поверхности НЧ, сообщается о вариативных подходах с применением ПЭГ с различными концевыми группами (амино- или карбоксильными группами) [8]. Неправильно подобранные стабилизирующие молекулы или неправильная последовательность модификации поверхности НЧ могут привести к образованию агломератов НЧ.

Одним из перспективных методов для решения указанных задач является метод динамического светорассеяния (ДСР), который широко используется в исследованиях, связанных с синтезом, функционализацией и биомедицинскими применениями НЧ различного типа [9]. Данный метод позволяет получать информацию по распределению гидродинамического (ГД) размера коллоидов НЧ и их распределения по размерам в полидисперсных растворах [10]. Метод ДСР способен регистрировать образование макромолекулярных комплексов или агломератов НЧ, не прибегая к каким-либо другим процедурам, а также, в сочетании с возможностью оценивать их реальные размеры, позволяет регистрировать и идентифицировать образование макромолекулярных комплексов, даже когда их количество невелико.

В данной работе на примере НЧ магнетита Fe3O4, модифицированных органическими лигандами на основе производных ПЭГ, экспериментально обоснована важность правильного подбора лигандов для стабилизации НЧ в водных растворах, чтобы избежать образования агломератов НЧ. Кроме того, показано, что использование производного бикарбокси-ПЭГ для функционализации поверхности НЧ, приводит объединению таких НЧ друг с другом с образованием стабильных агрегатов, что сильно влияет на ГД параметры получаемых коллоидов, несмотря на сходство конечных продуктов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Синтез НЧ Fe3O4

Гидрофобные НЧ Fe3O4 были синтезированы методом высокотемпературного разложения олеата железа(III) по методике, описанной ранее [11]. Для этого на первом этапе был осуществлен синтез железосодержащего прекурсора (олеата железа(III), Fe(OL)3). 4.56 г (1.5 ммоль) олеата натрия (NaOL, 97%, abcr® GmbH)) растворяли в смеси 10 мл деионизированной воды (Millipore Milli-Q Academic System), 10 мл этанола (95%, Sigma-Aldrich) и 20 мл гексана (98.0%, Sigma-Aldrich). Затем к полученному раствору была добавлена навеска 0.81 г (0.5 ммоль) хлорида железа(III) (FeCl3, 97%, Sigma-Aldrich). Полученный раствор был нагрет до температуры кипения при постоянном магнитном перемешивании и кипятился в течение 4 ч. По истечении указанного времени реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, темно-коричневый слой был отделен с использованием делительной воронки, промыт деионизированной водой (3 раза по 50 мл), и растворитель был удален на роторном испарителе.

Для синтеза гидрофобных НЧ Fe3O4 4 ммоль Fe(OL)3 смешивали с 0.44 ммоль NaOL (97%, abcr GmbH), 1.3 ммоль олеиновой кислоты (90%, Sigma-Aldrich) и полученную смесь растворяли в 33 мл 1-октадецена (90%, Sigma-Aldrich). Далее реакционную смесь нагревали до 140°С и выдерживали в течение 1 ч при непрерывном перемешивании со скоростью 1000 об · мин–1 в аргоновой атмосфере. После этого реакционную смесь нагревали до температуры кипения (312°С) со скоростью 4°С · мин–1 и кипятили в течение 30 мин в аргоновой атмосфере. По окончании реакции полученный раствор охлаждали до комнатной температуры, добавляли 30 мл изопропанола (99.8%, Sigma-Aldrich) и центрифугировали на скорости 6000 об · мин–1 в течение 1 ч для осаждения наночастиц. Полученный осадок, представляющий собой наночастицы магнетита, был ресуспендирован в гексане и хранился при температуре 4°С.

Методика функционализации гидрофобных НЧ Fe3O4 № 1

Раствор 20 мг α,ω-бис{2-[(3-карбокси-1-оксопропил)амино]этил} полиэтилен гликоля (бикарбокси-ПЭГ, COOH-PEG-COOH) с молекулярной массой Мw = 2000 г · моль–1 (Sigma-Aldrich), 3 мг 1-этил-3-(3 диметиламинопропил) карбодиимида (EDC, Sigma-Aldrich), 2 мг N-гидроксисукцинимида (NHS, Sigma-Aldrich), 10 мг K2CO3 (Sigma-Aldrich) и 1.5 мг 6-нитродофамина (Toronto Research Chemicals) в 2 мл CH2Cl2 (99.8%, Sigma-Aldrich) и 1 мл N,N-диметилформамида (99.9%, Sigma-Aldrich) барботировали аргоном и перемешивали механически в течение 2 ч, после чего к нему добавляли 1 мл раствора гидрофобных НЧ Fe3O4 в CH2Cl2 (1 мг · мл–1) и полученный коллоидный раствор дополнительно перемешивали в течение 24 ч. По окончании реакции функционализированные НЧ были отделены от раствора магнитной декантацией после добавления 5 мл н-гексана, высушены в аргоновой атмосфере и редиспергированы в 2 мл дистиллированной воды. Полученный водный коллоид НЧ подвергали водному диализу в диализных мешках с размером пор 30 кДа в течение 24 ч и затем последовательно пропускали через шприцевые фильтры Millipore с размером пор 0.45 и 0.22 мкм для очистки от возможных агрегатов.

Методика функционализации гидрофобных НЧ Fe3O4 № 2

24 мг NaOH (Sigma-Aldrich) растворяли в 10 мл безводного метанола (99.9%, Sigma-Aldrich99.9%, Sigma-Aldrich) и добавляли к полученному раствору 51 мг 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты (ДФУ, Sigma-Aldrich) и 10 мл раствора гидрофобных НЧ Fe3O4 в н-гексане (1 мг · мл–1). Полученную реакционную смесь инкубировали в течение 5 ч на водяной бане при температуре 50°С и непрерывном перемешивании. По окончании реакции НЧ, модифицированные ДФУ, отделяли от раствора при помощи центрифугирования на скорости 6000 об · мин–1 в течение 20 мин, надосадочную жидкость сливали, а полученный осадок высушивали в аргоновой атмосфере для удаления остатков н-гексана и метанола и ресуспендировали в 5 мл деионизированной воды, после чего последовательно пропускали через шприцевые фильтры Millipore с размером пор 0.45 и 0.22 мкм для очистки от возможных агрегатов. Далее к 1 мл водного раствора функционализированных НЧ (с концентрацией 1 мг · мл–1) последовательно добавляли 8.27 мкл водного раствора NHS (10 мг · мл–1) и 13.78 мкл водного раствора EDC (10 мг · мл–1). Полученный коллоидный раствор перемешивали механически в течение 20 мин при комнатной температуре, после чего к нему добавляли 100 мкл водного раствора (100 мг · мл–1) поли(этиленгликоль)2-аминоэтилового эфира уксусной кислоты (аминокарбокси-ПЭГ, NH2-PEG-COOH) с молекулярной массой Мw = 1100 или 3500 г · моль–1 (Sigma-Aldrich) и перемешивали еще в течение 24 ч. Полученный водный коллоид функционализированных НЧ подвергали диализу против воды в диализных мешках с размером пор 30 кДа в течение 24 ч и затем последовательно пропускали через шприцевые фильтры Millipore с размером пор 0.45 и 0.22 мкм соответственно для очистки от возможных агрегатов.

Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)

Форму НЧ анализировали методом ПЭМ на электронном микроскопе JEM JEOL-1400 при ускоряющем напряжении 120 кВ. Образцы готовили путем нанесения 5 мкл коллоидного раствора НЧ (0.1 мг · мл–1) на медную сетку (d = 3.05 мм), покрытую формваром, и высушивали на воздухе в течение 1 ч при комнатной температуре. Размер магнитного ядра НЧ анализировали с использованием программного обеспечения ImageJ.

Динамическое светорассеяние (ДСР)

Анализ ГД параметров коллоидов НЧ осуществляли на приборе Zetasizer Nano ZS. Для этого 1 мл раствора НЧ (0.5 мг · мл–1) помещали в кварцевую кювету (1 × 1 см) и проводили соответствующие измерения при Т = 300 К и при угле рассеяния 173°. Для каждого образца было проведено 3 серии измерений.

Вибратомагнитометрия

Измерение статических магнитных свойств проводили при Т = 300 К с помощью установки Quantum Design PPPMS-9 (Quantum Design, США). Амплитуда колебаний составляла 2 мм, частота – 40 Гц. Чувствительность прибора – 10–6 э. м. е.

Рентгенофазовый анализ (РФА)

Рентегонофазовый анализ (РФА) порошка гидрофобных НЧ проводили на дифрактометре Rigaku Ultima IV (Rigaku, Япония) с Co Kα-излучением при дифракционных углах Θ от 15° до 100° при скорости сканирования 0.1° и времени экспозиции на точку съемки 2 с. Качественный фазовый анализ осуществляли путем сопоставления спектров с использованием базы данных по рентгеновским спектрам фаз (программа PHAN, около 200 000 фаз).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Методом ПЭМ было установлено, что синтезированные гидрофобные НЧ являются монодисперсными, имеют ярко выраженную кристаллическую структуру, средний размер ядра составляет 11 ± 2 нм, а сами они имеют кубическую форму (рис. 1a). Такая форма обусловлена влиянием молекул ПАВ (олеиновой кислоты), которые специфически адсорбируются на определенных гранях растущего кристалла в процессе синтеза НЧ и препятствуют их дальнейшему росту, приводя к образованию куба. Более того, сорбированные на поверхности НЧ молекулы олеиновой кислоты препятствуют их слипанию друг с другом. Для исследования фазового состава полученных НЧ был проведен рентгеноструктурный анализ (рис. 1б), который показал, что положение и относительные интенсивности всех пиков на дифрактограмме соответствуют фазе чистого магнетита (период решетки a = 8.396 Å, JCPDS № 19-0629). Намагниченность НЧ измеряли при комнатной температуре и нормировали на содержание магнетита в образце. Полученная кривая намагничивания указывает на то, что НЧ обладают удельной намагниченностью насыщения МS = = 58 A ⋅ м2 ⋅ кг–1 и характеризуются суперпарамагнитным поведением при комнатной температуре (рис. 1в).

Рис. 1.

Основные физические характеристики синтезированных НЧ Fe3O4. ПЭМ-микрофотография НЧ (шкала 50 нм) и гистограмма распределения НЧ по размерам (а). Дифрактограмма порошка НЧ при Т = 300 К с обозначением брэгговских пиков (б). Кривая намагничивания НЧ при Т = 300 К, где М – удельная намагниченность, В – напряженность поля (в).

Синтезированные гидрофобные магнитные НЧ были функционализированы лигандами на основе ПЭГ, после чего методом ДСР были измерены гидродинамические характеристики полученных коллоидов. Были использованы сходные по строению производные ПЭГ, незначительно отличающиеся по молекулярной массе (1100 и 2000 г ⋅ моль–1), но отличающиеся терминальными функциональными группами (аминокарбокси- и бикарбокси-производные), обусловливающими возможность образования наноструктур различного типа (рис. 2а). Условия реакций и реагенты были подобраны таким образом, чтобы конечные функционализированные НЧ практически не отличались друг от друга по строению лигандов. На основании результатов, полученных методом ДСР, было установлено, что средний ГД исходных гидрофобных НЧ по интенсивности и объему совпадает и составляет 21 ± 2 нм (рис. 2б). Полученное значение ГД немного завышено по сравнению со средним размером магнитного ядра, установленным с помощью ПЭМ (11 ± 2 нм), что объясняется дополнительным вкладом молекул олеиновой кислоты, сорбированных на поверхности гидрофобных НЧ, в общий ГД размер [12]. После функционализации были получены несколько типов НЧ (рис. 2). Во многих исследованиях средний ГД размер НЧ выражается через интенсивность рассеянного света [13]. Из полученных нами экспериментальных данных можно видеть, что кривые распределения ГД размеров образцов 1 и 2 по интенсивности рассеяния имеют одномодальный характер с максимумами при 87 и 122 нм, соответственно (табл. 1, рис. 3а). Полученные данные хорошо согласуются с размерами функционализированных НЧ, установленных с помощью ПЭМ (рис. 3б). Однако переходя от распределения размеров НЧ по интенсивности рассеяния к распределению по объему, можно видеть совершенно иную картину (рис. 3а). Для образца 1 форма распределения осталась одномодальной, тогда как максимум такого распределения сместился в область меньших размеров и составил 24 нм. В случае образца 2 распределение размеров приобрело бимодальный характер с максимумами при 28 и 79 нм (соотношение 1.4 : 1), соответственно (рис. 3а).

Рис. 2.

Схематическое изображение методики модификации гидрофобных НЧ органическими лигандами. Функционализация поверхности НЧ Fe3O4 аминокарбокси-производным ПЭГ с Мw = 1100 г ⋅ моль–1 (а). Функционализация поверхности НЧ Fe3O4 бикарбокси-производным ПЭГ c Мw = 2000 г ⋅ моль–1 (б).

Таблица 1.  

Размер НЧ Fe3O4 до и после модификации лигандами на основе производных ПЭГ

Образец Размер магнитного ядра по ПЭМ, нм Гидродинамический размер, нм Индекс полидисперсности
по интенсивности по объему
Гидрофобные НЧ 11 ± 2 28 16 0.215
Образец 1 11 ± 2 87 24 0.210
Образец 2 11 ± 2 122 28 (79) 0.179
Образец 3 11 ± 2 99 83 0.159
Рис. 3.

Гидродинамические кривые распределения фукционализированных НЧ Fe3O4 по интенсивности и объему (а). Микрофотографии функционализированных НЧ Fe3O4 (б).

Размеры исследуемых НЧ соответствуют условиям рэлеевского рассеяния, следовательно, интенсивность рассеяния света пропорциональна квадрату объема НЧ. Таким образом, даже небольшое количество агрегатов НЧ в коллоидном растворе может быть легко определено методом ДСР [9]. Распределение НЧ по объему пересчитывается автоматически программой Malvern Zetasizer на основании данных о распределении НЧ по интенсивности с учетом показателя преломления коллоидного раствора [14]. При высокой агрегативной стабильности НЧ и их малом размере (<100 нм) данным показателем можно пренебречь, в связи с чем распределение по объему дает информацию о характерном размере НЧ в коллоидном растворе.

Полученные нами максимумы распределения НЧ по объему при 24 и 28 нм для образцов 1 и 2, соответственно, хорошо согласуются с ранее представленными исследованиями, в которых было отмечено, что толщина слоя ПЭГ линейно зависит от его молекулярной массы и составляет 4 и 6 нм для Мw = 1100 и 2000 г ⋅ моль–1, соответственно [15]. Максимум при 79 нм для образца 2, вероятнее всего объясняется присутствием в образце агрегатов НЧ, образующихся в процессе функционализации гидрофобных НЧ производным ПЭГ, содержащим две функциональные карбоксильные группы. Функционализация происходит за счет активации карбоксильных групп полимера в присутствии активирующих агентов EDC и NHS по карбодиимидному методу, что способствует связыванию бикарбокси-производного ПЭГ не только с поверхностью НЧ, но и между собой, и обусловливает образование олигомеров. Для доказательства данной гипотезы мы провели серию экспериментов, в которых варьировали мольное соотношение 6-нитродофамина к бикарбокси-производному ПЭГ с Мw = 2000 г ⋅ моль–1, что в могло повлиять на строение получаемого лиганда (общее количество терминальных карбоксильных групп в структуре лиганда) и последующую агрегацию НЧ в процессе их функционализации. Представленный на рис. 4а график демонстрирует, что увеличение мольного соотношения 6-нитродофамина к бикарбокси-производному ПЭГ в диапазоне от 0 до 1 никак не влияет на ГД размер функционализированных НЧ. При этом, распределение НЧ по интенсивности остается одномодальным, а по объему – унимодальным, о чем свидетельствуют полученные экспериментальные данные (рис. 4а). Примечательно, что при использовании для функционализации НЧ аминокарбокси-ПЭГ с большей Мw = 3500 г ⋅ моль–1, одномодальное распределение НЧ по интенсивности и объему сохранилось, однако увеличились средние ГД размеры НЧ, что объясняется утолщением органической оболочки (рис. 4б).

Рис. 4.

Гидродинамические характеристики функционализированных НЧ. Зависимость ГД размера НЧ по интенсивности и объему от мольного соотношения 6-нитродофамина к бикарбокси-производному ПЭГ с Мw = 2000 г ⋅ моль–1; n = 3 (а). Гидродинамические кривые распределения размеров по интенсивности и объему для НЧ, функционализированных аминокарбокси-производным ПЭГ с Мw = 3500 г ⋅ моль–1 (б).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исходя из полученных экспериментальных данных, можно сделать вывод, что, несмотря на сходство в строении лигандов, которыми функционализированы НЧ, способ функционализации НЧ сильно влияет на ГД параметры получаемых коллоидов. В то же время, комплексное представление данных о ГД размере НЧ позволяет избежать ошибок в планировании различных экспериментов, где ключевым фактором является размер НЧ.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ (проект № 19-03-00738) и НИТУ “МИСиС” грант № К2А-2019-044.

Список литературы

  1. Loizidou M., Seifalian A.M. // BJS. 2010. V. 97. № 4. P. 463.

  2. Golovin Y.I., Klyachko N.L., Majouga A.G. et al. // J. Nanopart. Res. 2017. V. 19. № 2. P. 59.

  3. Gupta A.K., Gupta M. // Biomater. 2005. V. 26. № 18. P. 3995.

  4. Reddy L.H., Arias J.L., Nicolas J.C.P. et al. // J. Chem. Rev. 2012. V. 112. № 11. P. 5818.

  5. Semkina A., Abakumov M., Grinenko N. et al. // Colloid Surf. B. 2015. V. 136. P. 1073.

  6. Tobi M., Sa A. // Colloid Surf. B. 2000. V. 18. P. 315.

  7. Otsuka H., Nagasaki Y., Kataoka K. // Adv. Drug Deliver. Rev. 2003. V. 55. № 3. P. 403.

  8. Psimadas D., Georgoulias D., Panagiotis V. et al. // IAJPS. 2012. V. 101. № 7. P. 2271.

  9. Khlebtsov B.N., Khlebtsov N.G. // Colloid J. 2011. V. 73. № 1. P. 118.

  10. Jokerst J.V., Lobovkina T.Z., Zare R.N., Gambhir S.S. // Nanomed. 2011. V. 6. P. 715.

  11. Nikitin A., Fedorova M., Naumenko V. et al. // J. Magn. Magn. Mater. 2017. V. 441. P. 6.

  12. Lim J., Yeap S.P., Che H.X., Low S.Ch. // Nanoscale Res. Lett. 2013. V. 8. № 1. P. 1.

  13. Kato H., Nakamura A., Takahashi K., Kinugasa S. // Nanomater. 2012. V. 2. P. 15.

  14. Zheng T., Bott S., Huo Q. // ACS Appl. Mater. Interfaces. 2016. V. 8. Art. № 21585.

  15. Spadaro D., Lati M.A., Donato M.G. et al. // RSC Adv. 2015. V. 5. № 113. Art. № 93139.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Известия РАН. Серия физическая

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал