Известия РАН. Серия физическая, 2022, T. 86, № 4, стр. 510-515

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что водорастворимые производные фуллеренов С₆₀ имеют широкий спектр биологической активности и являются перспективными с точки зрения создания на их основе эффективных лекарственных средств [1, 2]. В работах [3–6] была показана перспективность использования диад фуллерен–краситель в качестве высокоэффективных фотосенсибилизаторов для применения в фотодинамической терапии. Флуоресценция красителей в таких диадах потушена за счет переноса возбуждения или электрона с красителя на фуллерен [3–6]. В связи с этим актуальна разработка высокочувствительных экспериментальных методов, позволяющих эффективно детектировать подобные соединения в водных растворах и в биологических структурах.

В работах [7–9] было продемонстрировано, что метод поверхностно-усиленного рамановского рассеяния (SERS – surface-enhanced Raman scattering) позволяет детектировать водорастворимые производные фуллеренов в водных растворах в диапазоне концентраций до 10^–6 М, а в случае диад фуллерен–краситель – в концентрациях до 10^–8 М. Однако при введении производных фуллеренов и диад фуллерен–краситель в биологические структуры – в модельные биологические мембраны (липосомы) или в структуру белка альбумина чувствительность метода SERS резко снижается [8].

Согласно литературным данным, взаимодействие молекул с металлической поверхностью подложки может приводить к появлению не только сигнала SERS, но и к появлению сигнала поверхностно усиленной флуоресценции (SEF – surface-enhanced fluorescence), которая по своей интенсивности может значительно превосходить интенсивность обычной флуоресценции [10]. Причем коэффициенты усиления сигналов SERS и SEF нелинейно зависят от расстояния между флюорофором и подложкой [11–13]. Ранее было показано, что у используемых в настоящей работе подложек на основе наносеребра EnSpectr SERS коэффициент усиления сигнала SERS и SEF слабо зависит от расстояния между анализируемыми молекулами и подложкой в диапазоне до 30 нм, однако на больших расстояниях усиление падает [12, 13].

Так как интенсивность наблюдаемых сигналов SERS и SEF должна в значительной степени зависеть от природы анализируемых соединений, их концентрации и способа нанесения на подложку, в данной работе исследовалась возможность регистрации спектров SERS и SEF диад PFD–Flu и PFD–Ce6 – ковалентных конъюгатов полианионного производного фуллерена PFD и красителей флуоресцеина (Fl) и хлорина е₆ (Ce6) (рис. 1) в водном растворе, в структуре липосом или белка альбумина.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для исследований использовали полианионное производное фуллерена PFD, красители флуоресцеин (Fl), хлорин е₆ (Ce6) и ковалентные диады PFD–Fl и PFD–Ce6 (рис. 1). Синтез соединений PFD, PFD–Fl и PFD–Ce6 был осуществлен как описано в [3, 4], и их структура была подтверждена методами оптической и ИК-спектроскопии, флуоресценции, ¹H и ¹³C ЯМР-спектроскопии и электроспрей-масс спектрометрии. Для регистрации спектров SERS и SEF образцы соединений растворялись в воде, 1 мкл анализируемого раствора наносился на подожку и высушивался в течение нескольких минут при комнатной температуре, как описано в работе [9].

В работе использовались оригинальные подложки EnSpectr SERS (Enhanced Spectrometry, Inc., San Jose, CA 95110, USA) на основе наночастиц серебра, получаемых термическим испарением в вакуумной камере, как описано в работах [12–15].

Спектры SERS и SEF регистрировались на Рамановском микроскопе Raman Microscope R532 (TeraSense Group, Inc., San Jose, CA 95110, USA) при возбуждении на длине волны λ_ex = 532 нм. Луч лазера мощностью 0.2 мВт фокусировался на поверхности образца с помощью 20-кратного объектива микроскопа. Размер лазерного пятна составлял ~5 мкм, что определяет пространственное разрешение установки. Сканирование поверхности образца выполнялось с помощью трехкоординатного столика Märzhäuser ECO-STEP Motorized stage system (Märzhäuser Wetzlar GmbH & Co. KG, Germany) в течение 1 с.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследования показали, что при нанесении на подложки водного раствора водорастворимого производного фуллерена PFD оно проявляет хорошо регистрируемые спектры SERS, который состоит из 3 интенсивных линий с максимумами при 1445, 1415 и 1556 см^–1, что на 10–20 см^–1 меньше по сравнению с литературными данными по спектроскопии SERS нативного фуллерена С₆₀ [16, 17], а также из двух менее интенсивных линий при 695 и 759 см^–1 (рис. 2). Сдвиг основных линий, а также расщепление мод Hg(3) и Hg(4) (650–750 см^–1) является типичной характеристикой искаженной молекулы фуллерена. Как видно из рис. 2, хотя фуллерены практически не обладают обычной флуоресценцией, регистрация спектров SERS соединений PFD позволяет уверенно регистрировать их в диапазоне концентраций 10^–5–10^–6 М.

Ранее было показано, что при ковалентном присоединении флуоресцирующих красителей флуоресцеина или хлорина е₆ к ядру фуллерена флуоресценция этих красителей в составе диад PFD–Fl и PFD–Ce6 сильно потушена вследствие эффективного переноса возбуждения или электрона с возбужденного красителя на сфероид фуллерена [3, 4]. Это значительно затрудняет использование стандартных флуоресцентных методов для детектирования таких диад в биологических структурах при проведении фармакокинетических исследований.

Исследования показали, что спектр SERS красителя флуоресцеина – Fl (рис. 3а) имеет четко выраженные линии в диапазоне 300–1700 см^–1, в том числе три интенсивные линии (1629, 1540 и 1323 см^–1), которые связаны с валентными колебаниями ароматической связи С–С в ксантеновом скелете красителя, что совпадает с литературными данными [18]. Спектр SERS индивидуального красителя Cе6 также состоит из большого количества линий в диапазоне 600–1600 см^–1 (рис. 3а), что также совпадает с ранее опубликованными данными [19].

При регистрации спектров SERS диад PFD–Fl и PFD–Ce6 оказалось, что хотя флуоресценция красителей в структуре диад сильно потушена [3, 4], данные диады также обладают интенсивным спектром SERS, близким к спектру исходного красителя (рис. 3а и 3б). При этом линии сигнала SERS, характерные для производного фуллерена PFD – 1447 и 1556 см^–1 – в спектрах диад не детектируются. Согласно электромагнитной теории SERS, наибольшее усиление излучательной активности наблюдается для колебаний, изменяющих поляризуемость молекул в направлении, перпендикулярном поверхности металла [20]. В связи с этим, возможно, наибольший эффект SERS в эксперименте наблюдается для плоских молекул флуоресцеина и хлорина, в том числе в структуре диад PFD–Fl и PFD–Ce6, сорбированных на подложках из наносеребра, а менее интенсивные линии для PFD связаны со слабой поляризуемостью сфероида фуллерена.

При анализе данных, приведенных на рис. 3а, следует отметить, что у спектра диады PFD–Fl появляется широкая полоса, возрастающая в диапазоне от 2000 до 400 см^–1, что совпадает по форме с участком спектра стационарной флуоресценции водного раствора красителя Fl (рис. 3а, кривая 3). Этот эффект можно объяснить наложением спектра колебательно-вращательных (рамановских) мод диады PFD–Fl на широкую полосу спектра SEF-флуоресцении красителя Fl в составе данной диады.

Более явно эффект SEF выражен для диады PFD–Ce6. На рис. 3б представлены спектры SERS красителя Ce6 и диады PFD–Ce6. В этом случае в спектре SERS диады PFD–Ce6, наряду со спектром SERS красителя Ce6 в диапазоне 400–2000 см^–1, наблюдается отдельный, отчетливо регистрируемый пик SEF на 3830 см^–1. Для сравнения, на этом же рисунке пунктиром нанесен спектр стационарной флуоресценции водного раствора индивидуального красителя Ce6 (рис. 3б, кривая 3), имеющей максимум при 670 нм (что соответствует 3850 см^–1 при регистрации в режиме SERS при возбуждении на длине волны 532 нм).

Важно отметить, что поверхностно-усиленную флуоресценцию SEF исходных красителей Fl и Ce6 в аналогичных условиях зарегистрировать не удается (рис. 3а и 3б).

Обнаруженные эффекты более выраженной SEF для диад PFD–Fl и PFD–Ce6 по сравнению со свободными красителями Fl и Ce6 можно объяснить тем, что, согласно теоретическим представлениям, степень усиления SEF обратно пропорциональна квантовому выходу свободной флуоресценции исследуемых веществ и зависит от параметров подложки [21, 22].

Характер изменения флуоресценции SEF M_Fluo зависит от нескольких независимых факторов [21]:

где M_Abs – коэффициент усиления поглощения вследствие наличия локального электромагнитного поля вблизи металлической подложки, обычно >1; Q₀ – квантовый выход свободной флуоресценции исследуемого вещества; $\eta _{{Rad}}^{{EM}}$ = = ${{{{M}_{{Rad}}}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{M}_{{Rad}}}} {({{M}_{{Rad}}} + {{M}_{{NR}}})}}} \right. \kern-0em} {({{M}_{{Rad}}} + {{M}_{{NR}}})}}$ – коэффициент эффективности усиления флуоресценции, $\eta _{{Rad}}^{{EM}}$ обычно значительно меньше 1 за счет тушения флуоресценции металлическими частицами и увеличения доли безызлучательных переходов.

В соответствии с этими представлениями, для красителей Fl и Ce6, имеющих высокий квантовый выход флуоресценции (${{Q}_{0}}$ равны, соответственно, 0.37 для аниона флуоресцеина [23] и 0.22 для Ce6 [24]), наблюдаемая SEF выражена в меньшей степени, чем для диад PFD–Fl и PFD–Ce6, для которых значения ${{Q}_{0}}$ находятся в диапазоне 10^–3–10^–4 [3, 4].

Как отмечалось выше, коэффициент усиления сигналов SERS и SEF зависит от расстояния между анализируемым веществом и поверхностью подложки [10–13]. Этот эффект может иметь особенное значение при встраивании исследуемых соединений в биологические мембраны и в структуру белков. С целью моделирования спектров SERS и SEF диад PDF–Fl в биологических структурах исследовались спектры данных диад, встроенных в модельные биологические мембраны (липосомы) и в гидрофобную полость белка альбумина.

Спектры SERS и SEF PFD–Fl регистрировались в зависимости от концентрации PFD–Fl, которая изменялась соотношением PFD–Fl/липид при встраивании PFD–Fl в структуру липосом или в зависимости от концентрации белка альбумина при соотношении PFD–Fl/белок = 0.7.

При анализе спектров SERS и SEF диады PFD–Fl в структуре лецитиновых липосом необходимо принять во внимание, что при встраивании диады в структуру модельных мембран интенсивность ее спектра SERS определяется локальной концентрацией молекул вблизи поверхности подложки. В структуре липосом анализируемые молекулы разбавлены молекулами липида пропорционально их молярному соотношению и молекулярному объему. Как видно из рис. 4а, интенсивности спектра SERS (амплитуда узких линий) и спектра SEF (амплитуда широкой составляющей спектра) изменяются с изменением соотношения PDF–Fl/липид.

При встраивании ковалентных диад PFD–Fl в гидрофобные сайты альбумина, имеющего молекулярный вес ~65 000 дальтон и диаметр макромолекулы ~5 нм, вероятность непосредственного контакта анализируемых соединений с поверхностью подложки также значительно уменьшается. При этом линейные размеры диады PFD–Fl примерно в 5 раз меньше размера молекулы альбумина, что приводит к снижению поверхностной концентрации PFD в одном монослое макромолекул альбумина на подложке в 25 раз. Последующий, второй монослой макромолекул белка будет находиться на расстоянии более 5 нм от поверхности подложки, а объемная концентрация в целом уменьшается в 125 раз. Эти факторы должны приводить к резкому снижению интенсивности сигнала SERS при встраивании PFD в структуру альбумина и нанесении макромолекул белка на поверхность подложки.

В эксперименте было обнаружено, что при введении диады PFD–Fl в структуру альбумина и нанесении их на подлодку спектры SERS и SEF удается регистрировать при концентрациях белка 10^–4–10^–5 М (рис. 4б). По мере роста концентрации комплекса белка с PFD–Fl наблюдается рост амплитуды спектра SEF красителя, при этом изменения амплитуды узких линий спектра SERS выражены значительно слабее. Это можно объяснить тем, что спектр SERS диады в структуре белка обусловлен в основном вкладом только первого монослоя белка на подложке, в то время как эффект SEF проявляется при наслоении последующих молекул белка на большем удалении от подложки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Продемонстрирована возможность уверенного детектирования методами SERS или SEF диад фуллерен–краситель PFD–Fl и PFD–Ce6, создаваемых в качестве перспективных фотодинамических соединений, даже в том случае, когда флуоресценция красителя, присоединенного к фуллерену, сильно потушена. При регистрации SERS у диад PFD–Fl и PFD–Ce6 наблюдается выраженный сигнал поверхностно-усиленной флуоресценции SEF, тогда как у индивидуальных красителей флуоресценция SEF не наблюдается, что согласуется с теорией, предсказывающей обратную зависимость интенсивности флуоресценции SEF от квантового выхода обычной флуоресценции соединений в растворе. Этот эффект позволяет регистрировать такие гибридные молекулярные структуры по высокоинтенсивному спектру SERS или SEF красителя в диапазоне концентраций 10^–7–10^–5 М и открывает возможность широкого использования метода SERS и SEF для исследования взаимодействия данных производных фуллеренов с биологическими структурами различного уровня организации.

Исследования финансировались Министерством науки и образования Российской федерации (тема государственного задания № АААА-А19-119112590105-7). Работы по синтезу производных фуллерена поддержаны Министерством науки и образования Российской федерации (тема государственного задания № AAAA-A19-119071190044-3).