Химическая физика, 2019, T. 38, № 12, стр. 48-53

ВВЕДЕНИЕ

Развитие нанотехнологий дало новый импульс к созданию высокотехнологичных материалов с уникальными свойствами и поиску сфер их эффективного применения. Одна из таких сфер – биомедицинская оптика со стоящими перед ней задачами диагностики и лечения целого ряда социально значимых заболеваний. Среди материалов, разрабатываемых для этой области, следует выделить материалы с оптически управляемыми свойствами на основе углеродных наночастиц, в том числе наночастиц алмазов, прежде всего детонационного синтеза [1, 2]. Свойства наноразмерных алмазов детонационного происхождения представляют значительный интерес во многих аспектах [3] из-за их разнообразных применений. Алмазные наночастицы малотоксичны, имеют относительно большую поверхность и сравнительно легко функционализируются, что позволяет рассматривать их в качестве перспективных материалов для биомедицинских приложений. В настоящей работе представлены модельные исследования нанокомплексов алмазов с Кумарином 343, применяемым в качестве люминесцирующего красителя. Современные области исследования, в которых используется данный люминофор, отличаются большим разнообразием – от создания биоаналитических и биосенсорных методов и технологий [4] до разработки новых люминесцентных спектральных преобразователей для современных источников света [5, 6]. Кумарин 343 оказался удобен для настоящего исследования не в последнюю очередь благодаря наличию в нем карбоксильной группы, способствующей конъюгированию с алмазными наночастицами, обладающими аминогруппами.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Приготовление образцов. Синтез алмазных нанокомплексов Кумарина 343 осуществлялся по отработанным ранее методикам [7–10] c использованием ультрадисперсных синтетических алмазов марки “УДА-СП” НП ЗАО “Синта” (Минск, Беларусь).

Спектральные измерения. Спектры люминесценции измеряли на спектрофлуориметре Lambda 55, электронные спектры поглощения – с помощью спектрофотометра Lambda 25 (оба спектрометра производства фирмы “PerkinElmer Inc.”, США). Регистрацию спектров ЭПР экспериментальных образцов проводили на ЭПР-спектрометре Bruker EMX (Германия).

Работа с клетками. В работе использовались клетки острой моноцитарной лейкемии человека линии ТНР-1 (Российская коллекция клеточных культур). Для культивирования THP-1 использовали среду RPMI-1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина, 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США). Флаконы с клеточной суспензией инкубировали в СО₂-инкубаторе при температуре 37 °С и 5% СО₂. При высокой численности клетки склонны образовывать агрегаты, которые легко распадаются при встряхивании флакона. Активно пролиферирующие клетки нуждаются в частичной смене среды каждые 2–3 дня.

Макрофагальную дифференцировку клеток культуры THP-1 индуцировали путем добавления форболового эфира (Sigma-Aldrich, США). Принцип действия последнего до конца не известен, но предполагается, что он имитирует сигнальные молекулы, которые взаимодействуют с внутренним слоем плазматической мембраны и запускают каскад протеинкиназы С. В процессе необратимой дифференцировки клетки из суспензии оседают на субстрат, прикрепляются к нему и приобретают веретеновидную форму. В данной работе использовался форболовый эфир с концентрацией 10^–4 М в исходном растворе и 10^–7 М – в экспериментальных образцах.

Электронная и световая микроскопия. Для получения клеточного лизата, содержащего алмазные нанокомплексы, клетки рассаживали в культуральные флаконы в количестве 5 ⋅ 10⁵ клеток на 1 мл (2.5 ⋅ 10⁶ клеток на флакон) в присутствии форболового эфира с концентрацией 10^–7 М. На 3-й день дифференцировки во флаконы добавляли суспензию алмазных наночастиц для получения концентрации в 250 мкг/мл. Спустя 10 сут культивирования ростовую среду, содержащую непоглощенные наночастицы, отбирали, клетки открепляли от субстрата, добавляя раствор трипсина на буфере Версена в соотношении (1 : 3) по 1 мл на флакон. Полученную суспензию клеток центрифугировали при 2750 об/мин в течение 30 мин для осаждения клеток. После удаления супернатанта преципитат переносили в микропробирку, к осадку прибавляли 500 мкл дистиллированной воды и встряхивали на вортексе в течение 5 мин для разрушения клеток осмотическим шоком. Клеточный лизат затем центрифугировали при 10⁴ об/мин и удаляли супернатант. Далее нагревали в термостате до 85 °С в течение получаса для разрушения остатков клеточных компонентов и несколько раз отмывали дистиллятом с последующим центрифугированием и отбором супернатанта.

Суспензию наночастиц объемом 10 мкл помещали на медную сетку, покрытую формваровой пленкой и высушивали при комнатной температуре в течение суток. Полученные препараты исследовали (в том числе методом дифракции электронов) с помощью аналитического электронного микроскопа JEM 2100 (Jeol, Япония).

Исследование ультраструктуры клеток THP-1, содержащих поглощенные алмазные нанокомплексы, проводили по стандартной методике. Клетки рассаживали в чашки Петри со стеклами в количестве 5 ⋅ 10⁵ клеток на 1 мл (10⁶ клеток на чашку) в присутствии форболового эфира в концентрации 10^–7 М. На 3-й день дифференцировки во флаконы добавляли суспензию алмазных наночастиц для получения концентрации 250 мкг на 1 мл. Спустя десять суток культивирования ростовую среду, содержащую непоглощенные наночастицы, отбирали, промывали клетки 0.1 М фосфатным буфером (pH 7.2–7.4) и фиксировали глутаровым 2.5%-ным альдегидом (Ted Pella, INC) на 0.1 М фосфатном буфере в течение 2 ч. Далее отмывали от фиксатора и дофиксировали 1%-ным раствором тетраоксида осмия (OsO₄) в течение 2 ч при 4 °С. Обезвоживание образцов проводили в спиртах восходящей концентрации и ацетоне, после чего заключали в эпоксидную смолу. Срезы с полученных блоков получали на ультрамикротоме (Leica, Германия) и окрашивали по Рейнольдсу. Полученные препараты исследовали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа (ТЭМ) JEM 2100. Для получения ТЭМ-изображений использовали программное обеспечение Gatan. Изображения клеточной культуры были получены путем световой микроскопии с помощью DIC-микроскопа компании Leica (объектив с увеличением 40×, апертура – 0.5 HI plan).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Спектральные свойства комплексов Кумарина 343 с наноразмерными алмазами

На рис. 1 приведены спектры поглощения образцов Кумарина 343 и его комплексов с наноразмерными алмазами, а также спектры возбуждения флуоресценции тех же образцов. Спектры флуоресценции Кумарина 343 и его алмазных нанокомплексов показаны на рис. 2.

Рис. 1.

a – Спектры поглощения: 1 и 2 – Кумарин 343 в фосфатном буфере (рН 7.4) в присутствии 5% ДМСО и в этаноле соответственно; 3 – конъюгат Кумарина 343 с наноразмерным алмазом в фосфатном буфере (рН 7.4) в присутствии 5% ДМСО; 4 – наноразмерный алмаз в фосфатном буфере (рН 7.4 ) в присутствии 5% ДМСО; б – спектры возбуждения флуоресценции: 1 и 2 – Кумарин 343 в фосфатном буфере (рН 7.4) в присутствии 5% ДМСО и в этаноле соответственно (при длине волны регистрации λ_рег = 525 нм); 3 – конъюгат Кумарина 343 с наноалмазом в фосфатном буфере (рН 7.4) в присутствии 5% ДМСО, λ_рег = 500 нм.

Рис. 2.

a – Спектры флуоресценции: 1 и 2 – Кумарин 343 в фосфатном буфере (рН 7.4) в присутствии 5% ДМСО и в этаноле соответственно; 3 – конъюгат Кумарина 343 с наноразмерным алмазом в фосфатном буфере (рН 7.4) в присутствии 5% ДМСО (при длине волны возбуждения λ_возб = 310 нм); б – спектры флуоресценции: 1 – Кумарин 343 в этаноле, 2 – конъюгат Кумарина 343 с наноразмерным алмазом в фосфатном буфере (рН 7.4) в присутствии 5% ДМСО (λ_возб = = 370 нм).

Из приведенных на рис. 1а спектров поглощения видно, что произошли существенные изменения в системе при комплексообразовании: наблюдаются сдвиги спектральных полос и исчезновение пика поглощения в области 420 нм, что свидетельствует об образовании новых оптических центров в изучаемых образцах. Приведенные спектры возбуждения (рис. 1б) и испускания (рис. 2) флуоресценции также указывают на существенные изменения в природе излучающих центров при комплексообразовании.

На рис. 3 показаны спектры ЭПР исследовавшихся в настоящей работе алмазных нанокомплексов с Кумарином 343 без освещения и при освещении ртутно-кварцевой лампой ДРШ-1000 через светофильтры УФС-5 (250–380 нм) и БС-6 (>320 нм) в течение 8 мин, и, как видно, существенного различия в этих спектрах не наблюдается. Таким образом, облучение алмазных нанокомплексов не влияет на сигналы ЭПР (последние связывают с наличием дефектов в структуре синтетических алмазных частиц детонационного происхождения [11]) и, следовательно, не приводит к появлению новых парамагнитных центров.

Рис. 3.

Спектры ЭПР нанокомплексов алмазов при 77 K и облучении лампой ДРШ-1000 через светофильтры УФС-5 (250–380 нм) – слева и БС-6 (>320 нм) – справа в течение 8 мин (1) в сравнении со спектром ЭПР необлученных образцов (2).

Характеристика наноразмерных алмазов и клеточной культуры по данным электронной микроскопии

Образцы алмазных наночастиц представляют собой порошки серого цвета. Диаметры отдельных наночастиц составляют от 4 до 25 нм. В воде наночастицы формируют неустойчивую суспензию и оседают примерно через 5 мин после суспендирования. Также алмазные наночастицы могут образовывать агрегаты, как видно из рис. 4а. Кристаллическая решетка наноразмерных алмазов хорошо видна на рис. 4б.

Рис. 4.

a – Внешний вид алмазных наночастиц, б – кристаллическая решетка наноразмерных алмазов (слева) с кольцами электронограммы (справа). Трансмиссионная аналитическая электронная микроскопия.

Клеточная культура ТНР-1 – суспензионная культура, использующаяся для моделирования процессов фагоцитоза. Клетки в суспензии размерами 10–20 мкм имеют шарообразную форму (не показаны). В суспензии присутствуют преимущественно одиночные клетки, способные, тем не менее, агрегироваться в кластеры. Добавление форболового эфира к суспензии клеток в итоговой концентрации (10^–7 М) индуцирует макрофагальную дифференцировку, клетки прикрепляются к субстрату, распластываются и формируют отростки. На третьи сутки после добавления форболового эфира в культуральную среду наблюдаются многочисленные адгезировавшие клетки. Также часть клеток может приобретать вытянутую, часто веретеновидную форму и иметь длинные отростки либо распластанную округлую форму без отростков. Часть клеток сохраняет моноцитоподобную форму.

Внутриклеточная локализация алмазных наночастиц

На десятые сутки после инкубации клеток с алмазными наночастицами стало видно, что клетки имеют морфологию, несколько отличающуюся от морфологии контрольных макрофагов – большая часть клеток имеет сильно зернистую цитоплазму, клетки приобретают более округлую форму. Также наблюдались крупные агрегаты непоглощенных наночастиц (рис. 5а). На снимках срезов клеток, полученных с помощью ТЭМ, видны поглощенные макрофагами алмазные наночастицы (рис. 5б).

Рис. 5.

а – Клетки линии ТНР-1 на десятые сутки инкубации с суспензией алмазных нанокомплексов с Кумарином 343 (темными стрелками показаны клетки, светлой – агрегат наночастиц); б – интернализированные наночастицы (стрелками показаны кластеры алмазных нанокомплексов с Кумарином 343. Трансмиссионная электронная микроскопия.

Итак, в работе установлено, что алмазные наночастицы эффективно фагоцитируются макрофагами и легко детектируются внутри клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Комплексообразование наноразмерных алмазов с Кумарином 343 приводит к существенному изменению спектрально-люминесцентных свойств люминофора, позволяющему различать его свободные и связанные молекулы в разнообразных системах, включая живые клетки. Эффективное фагоцитирование изученных в настоящей работе нанокомплексов клетками и их легкая визуализация внутри клеток говорят о том, что такие комплексы можно использовать для переноса в клетки фотоуправляемых агентов, включая терапевтические.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 18-53-00038 Бел_а) и Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований (грант № Ф18Р-206).