Химическая физика, 2019, T. 38, № 12, стр. 54-58

Синтез ацетилцистеината 6-гидрокси-2-аминобензотиазола

Синтез АЦЦ ГАБТИ (Схема 1) основан на взаимодействии эквимолярных количеств 6-гидрокси-2-аминобензо-тиазола и N-ацетил-L-цистеина в растворе низшего спирта при кипячении с последующими частичной отгонкой растворителя, охлаждением реакционной массы, отделением выпавших кристаллов и перекристаллизацией полученного продукта из этилового спирта с добавкой активированного угля [11].

Схема 1 . Структурная формула АЦЦ ГАБТИ

Выделение наружных сегментов фоторецепторов из сетчатки глаз быка

Наружные сегменты фоторецепторов (НСФ) были выделены из сетчатки глаз быка по модифицированной методике [14].

Выделение липофусциновых гранул из РПЭ глаз человека

Липофусциновые гранулы были изолированы из клеток ретинального пигментного эпителия с помощью модифицированной методики, предложенной Boulton и Marshall [15].

Измерение антирадикальной активности АЦЦ ГАБТИ и мексидола

Антирадикальную активность изучаемых веществ оценивали с помощью хемилюминесцентной модельной системы окисления, состоящей из гемоглобина, пероксида водорода и люминола [16]. В качестве измеряемого параметра была взята максимальная интенсивность свечения (амплитуда хемилюминесценции).

Измерение кинетики пероксидации липидов наружных сегментов фоторецепторов

Кинетику пероксидации липидов наружных сегментов фоторецепторов определяли по накоплению продуктов реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-активные продукты), содержание которых измеряли по поглощению при длине волны 532 нм [17].

Облучение образцов видимым и УФ-светом

Для облучения образцов полным белым светом в видимом диапазоне (390–700 нм) использовали галогенную лампу накаливания КГМ24–150 мощностью 150 Вт (энергия облучения – 100 мВт/см²) с оптической системой фокусирования и тепловым фильтром при непрерывном перемешивании. Для облучения образцов УФ-светом использовали сфокусированный полный белый свет дуговой ртутно-кварцевой лампы ДРК-120 (мощность – 120 Вт, световой поток – 3900 Лм) на расстоянии 15 см от объекта при постоянном перемешивании. Свет этого источника включает как УФ-полосы, начиная со 190 нм, так и видимую область спектра.

Устойчивость к действию видимого и УФ-облучения

Принципиально важной характеристикой антиоксидантов, особенно применяемых в офтальмологии, является их устойчивость к действию света. На рис. 1 представлены дифференциальные спектры поглощения этих соединений через 10 мин (мексидол – кривая 2) и через 30 мин облучения (АЦЦ ГАБТИ – кривая 1). Видно, что мексидол уже через 10 мин претерпевает фотодеструкцию, распадаясь на неактивные компоненты, в то время как АЦЦ ГАБТИ в тех же условиях облучения и через 30 мин остается стабильным и не претерпевает каких-либо существенных спектральных изменений. Даже экспозиция АЦЦ ГАБТИ в течение 1 ч не приводила к значительным изменениям его состава (на рис. 1 не показано), что свидетельствует о его высокой устойчивости к действию УФ- и видимого облучения.

Рис. 1.

Дифференциальные спектры поглощения АЦЦ ГАБТИ (кривая 1) и мексидола (кривая 2) после УФ-облучения.

Сравнение антирадикальной активности АЦЦ ГАБТИ и мексидола

Антирадикальная активность АЦЦ ГАБТИ, измеренная в наших опытах в хемилюминесцентной модельной системе окисления люминола, оказалась в несколько раз выше, чем у мексидола. Из значений констант тушения для АЦЦ ГАБТИ – (2.4 ± 0.4) ∙ 10⁵ М^–1 и мексидола – (3.6 ± 0.5) ∙ 10⁴ М^–1 следует, что антирадикальная активность АЦЦ ГАБТИ более чем в 6 раз превышает таковую для мексидола.

Ингибирующее действие АЦЦ ГАБТИ на процесс пероксидации липидов в сравнении с мексидолом

Как продемонстрировано в экспериментах с суспензией наружных сегментов фоторецепторных клеток (НСФ) в темновых условиях в присутствии окислительной системы “Fe²⁺ + аскорбиновая кислота”, степень ингибирования процессов пероксидации липидов у АЦЦ ГАБТИ существенно выше, чем у мексидола (рис. 2). Так, уже в концентрации 0.3 мМ (кривая 1) АЦЦ ГА-БТИ практически на 100% подавляет процесс пероксидации липидов, в то время как мексидол даже в концентрации 1.0 мМ (кривая 2) ингибирует этот процесс примерно на 50%. Полученные результаты свидетельствуют о более высокой антиоксидантной активности АЦЦ ГАБТИ в отношении темновых свободнорадикальных процессов по сравнению с мексидолом.

Рис. 2.

Ингибирующее действие АЦЦ ГАБТИ (1) и мексидола (2) на индуцированную системой Fe²⁺ + + аскорбат пероксидацию фоторецепторных клеток в зависимости от концентрации. Реакционная среда содержала 0.1 М калий-фосфатный буфер (рН 7.4), 250 мкг ∙ мл^–1 белка суспензии НСФ, 10 мкМ FeSO₄(NH₄)₂SO₄ ∙ 6H₂O, 0.5 мМ аскорбат и АЦЦ ГАБТИ или мексидол в различных концентрациях. Приведены средние значения по пяти опытам.

Сравнение фотопротекторных свойств АЦЦ ГАБТИ и мексидола

Влияние антиоксидантов на процесс пероксидации липидов в суспензии НСФ изучали при облучении их УФ- и видимым светом. На рис. 3 представлена скорость накопления ТБК-активных продуктов в образцах НСФ при облучении светом. Видно, что АЦЦ ГАБТИ (столбик 3) намного эффективнее действует как фотопротектор в этой модельной системе, чем мексидол (столбик 2). Так, ингибирующее действие мексидола при его концентрации 1.5 мМ примерно в 5 раз меньше, чем в случае АЦЦ ГАБТИ, концентрация которого составляет всего лишь 0.3 мМ. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об эффективных фотопротекторных свойствах АЦЦ ГАБТИ.

Рис. 3.

Ингибирующее действие мексидола (2) и АЦЦ ГАБТИ (3) на индуцированную ультрафиолетом пероксидацию НСФ: 1 – контроль (без ингибиторов), 2 – в присутствии 1.5 ммоль ∙ л^–1мексидола, 3 – в присутствии 0.3 ммоль ∙ л^–1 АЦЦ ГАБТИ. Реакционная среда содержала 0.1 М калий фосфатный буфер (рН 7.4), 300 мкг ∙ мл^–1 белка суспензии наружных сегментов фоторецепторных клеток и АЦЦ ГАБТИ или мексидол. По оси ординат – средняя скорость накопления ТБК-активных продуктов в нмоль/мг белка за 1 мин облучения.

Та же тенденция сохраняется и в отношении фотосенсибилизированной видимым светом в присутствии липофусцина или его флуорофора А2Е пероксидации липидов суспензии НСФ (на рис. 3 не показано). Ингибирующая активность мексидола в этой системе даже при больших его концентрациях существенно ниже, чем у АЦЦ ГАБТИ. Эти результаты свидетельствуют о высоком защитном эффекте АЦЦ ГАБТИ в отношении фототоксического действия “старческого пигмента” липофусцина.

Исследование влияния АЦЦ ГАБТИ на образование поздних продуктов гликирования

Известно, что поздние продукты гликирования (ППГ), как и поздние продукты пероксидации липидов, представляющие собой в основном поперечно сшитые белковые молекулы, чрезвычайно токсичны для клеток. Формирование и накопление ППГ в различных клетках и тканях ведет к повреждению внеклеточных и внутриклеточных структур и нарушению их функций. Известно, что накопление ППГ – одна из основных причин развития диабетических осложнений. На начальных стадиях процесса гликирования белков происходит формирование флуоресцирующих оснований Шиффа. Ингибирующее действие АЦЦ ГАБТИ в отношении процесса фруктозилирования сывороточного альбумина и белков наружных сегментов фоторецепторных клеток было исследовано в сравнении с мексидолом и известными ингибиторами этого процесса – аминогуанидином и пиридоксамином. Как видно из рис. 4, АЦЦ ГАБТИ в той же концентрации, что и аминогуанидин, приводит к более выраженному замедлению процесса накопления флуоресцирующих продуктов в альбумине. В этих же условиях мексидол практически не оказывал никакого ингибирующего действия на процесс модификации альбумина при фруктозилировании. Одинаковую эффективность с аминогуанидином АЦЦ ГАБТИ показал также и при ингибировании накопления продуктов модификации белков в процессе фруктозилирования наружных сегментов фоторецепторных клеток (на рис. 4 не показано).

Рис. 4.

Влияние АЦЦ ГАБТИ (3) и аминогуанидина (2) на образование флуоресцирующих продуктов в альбумине при его взаимодействии с фруктозой; 1 – без добавления ингибиторов. Среда инкубации содержала 0.1 М калий-фосфатный буфер, рН 7.4, концентрация альбумина – 4 мг/мл, концентрация фруктозы – 50 мМ, концентрация ингибиторов – 5 мМ. Смесь инкубировали в течении 4 сут при температуре 37°С и постоянном перемешивании. Для устранения микробного заражения использовали 3 мМ азид натрия. После окончания реакции смесь диализировали против фосфатного буфера в течение 1 сут.

Обнаруженное свойство антиоксиданта АЦЦ ГАБТИ, заключающееся в его способности тормозить накопление ППГ в белках крови и фоторецепторных клетках, может быть использовано в фармакологической практике при лечении заболеваний, связанных со старением и диабетом, таких как артриты, атеросклероз, хроническая почечная недостаточность, нефропатия, нейропатия, болезнь Альцгеймера, катаракта, возрастная макулярная дегенерация, диабетическая ретинопатия. Три последних заболевания являются самыми распространенными глазными заболеваниями, которыми страдают миллионы людей в мире.