1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Химическая физика
  4. T. 38, № 12, 2019

Химическая физика, 2019, T. 38, № 12, стр. 33-37

Способность шапероноподобного белка α-кристаллина предотвращать агрегацию, но не рефолдинг βL-кристаллина, поврежденного ультрафиолетом

К. О. Муранов 1, *, Н. Б. Полянский 1, С. Ю. Клейменов 2, М. А. Островский 1

1 Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук
Москва, Россия

2 Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук
Москва, Россия

* E-mail: k.muranov@hotmail.com

Поступила в редакцию 05.06.2019
После доработки 05.06.2019
Принята к публикации 20.06.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

α-Кристаллин, входящий в семейство малых белков теплового шока, участвует в поддержании прозрачности хрусталика, предотвращая агрегацию поврежденных белков цитоплазмы волоконных клеток хрусталика. Целью работы было исследовать способность α-кристаллина восстанавливать нативную структуру βL-кристаллина, поврежденного ультрафиолетом (УФ). Было показано, что α‑кристаллин тормозит агрегацию βL-кристаллина, поврежденного УФ, в условиях, близких к физиологическим (температура – 37 °C, изотонический раствор, pH 7.0). Однако инкубация βL-кристаллина, поврежденного УФ, с α-кристаллином не приводила к ренатурации белка, что было показано методом дифференциальной сканирующей калориметрии. Таким образом, α-кристаллин не обладает свойствами истинного шаперона и не способен восстанавливать нативную структуру белка, поврежденного УФ.

Ключевые слова: α-кристаллин, молекулярный шаперон, βL-кристаллин, УФ-излучение.

ВВЕДЕНИЕ

Олигомерный белок α-кристаллин, принадлежащий к семейству малых белков теплового шока (sHSP) [1], образован полипептидами αА- и αВ‑кристаллина, которые состоят соответственно из 173 и 175 аминокислотных остатков молекулярной массой в 19.8 и 20.0 кДа [2]. Если αA-кристаллин обнаружен только в хрусталике и сетчатке глаза, то αB-кристаллин присутствует и во множестве других тканей организма – мозге, сердечной мышце и др. [3–5].

α-Кристаллин выполняет несколько функций в хрусталике. Во-первых, он вместе с β-, и γ-кристаллином обеспечивает хрусталику прозрачность [6–8]. Во-вторых, как шапероноподобный белок α-кристаллин предотвращает агрегацию дестабилизированных белков [9, 10]. И, в-третьих, α‑кристаллин участвует в формировании хрусталика на ранних стадиях онтогенеза [11–14].

Шапероноподобное действие α-кристаллина обнаружено более 20 лет назад, но молекулярный механизм этого явления понятен не до конца [10, 15]. В частности, до сих пор не ясно, способен ли α-кристаллин только предупреждать агрегацию поврежденного белка или, как истинный шаперон, может восстанавливать его структуру. Поскольку в некоторых модельных системах α-кристаллин восстанавливает структуру поврежденных белков, то такая возможность не исключена и в условиях in vivo [16–18].

Целью данной работы было исследовать способность α-кристаллина ренатурировать поврежденные белки. В качестве целевого белка для исследования этой способности α-кристаллина был использован поврежденный ультрафиолетом βL-кристаллин. Такой белок ближе к реальным субстратам, чем другие, широко используемые в исследованиях целевые белки, как то: белки, дестабилизированные под воздействием тепла, восстановителей дисульфидных связей, детергентов и др. [19–22]. Следует отметить, что ультрафиолет является важнейшим катарактогенным фактором [23], при действии на глаз in vivo он способен повреждать белки хрусталика [24, 25].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Выделение α- и βL-кристаллина

Белки выделяли из свежезамороженных хрусталиков бычков двухлеток с помощью ранее описанной методики [21, 26]. Кортекс хрусталика гомогенизировали при 0 °C в Na-фосфатном буфере (ФБ) (40 мМ Na-фосфат, 100 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 3 мМ NaN3, pH 6.8). Гомогенат центрифугировали при 27 000g и 4 °C в течение 1 ч. Супернатант разделяли на колонке TSK-gel HW-55 fine. Фракции, содержащие α- и βL-кристаллин, собирали и рехроматографировали на колонках TSK-gel HW-55 fine и Sephacryl S200 superfine соответственно. Полученные фракции концентрировали с помощью ультрафильтрации (Millipore PTTK disk membrane, NMWL 30,000). Молекулярный вес полученных α- и βL-кристаллина составлял (828 ± 45) и (43 ± 3) кДа соответственно. Концентрация белков измерялась фотометрически при 280 нм, коэффициент экстинкции составлял 0.85 см2 ∙ мг–1 для α-кристаллина и 2.3 см2 ∙ мг–1 для βL-кристаллина [27].

Облучение βL-кристаллина ультрафиолетом

Раствор βL-кристаллина (2 мг/мл) облучали в кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 см при температуре (8 ± 2) °C светом ртутной лампы (ДРШ-1000), снабженной 15-сантиметровым водяным фильтром и ультрафиолетовым фильтром УФС-2. Суммарную дозу ультрафиолета, полученную образцом в процессе облучения в диапазоне 260–305 нм, измеряли с помощью оптического спектрометра AvaSpec-2048. Суммарная мощность ультрафиолета составляла (0.8 ± 0.1) мВт/см2. Раствор белка в указанной концентрации полностью поглощал падающий на образец свет. В дальнейшем такой перпарат белка мы будем называть УФ-βL-кристаллином. Концентрацию белка в УФ-βL-кристаллине измеряли методом микробиурета [28].

Исследование взаимодействия белков

Препарат УФ-βL-кристаллин смешивали с α‑кристаллином в весовом соотношении 1/1 (конечная концентрация каждого белка в фосфатно-солевом буфере составляла 2 мг/мл) и инкубировали сутки при 37 °C. Смесь разделяли на колонке Sephacryl S200 superfine (Sigma), получая фракцию потенциально ренатурированного УФ-βL-кристаллина для исследования методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК).

Агрегацию УФ-βL-кристаллина при 37 °C в присутствии α-кристаллина оценивали по интенсивности светорассеяния при 450 нм с помощью спектрофотометра Shimadzu model 1240 mini (Shimadzu, Japan). Температуру образца поддерживали с помощью термостата Julabo-12 (Julabo, Germany) с точностью 0.1 °C.

Калориметрические измерения

Тепловую денатурацию облученного ультрафиолетом βL-кристаллина изучали методом ДСК с помощью микрокалориметра DASM-4M (Институт биологического приборостроения РАН, Пущино, Россия). Раствор белка нагревали с постоянной скоростью 1 °C/мин от 5 до 90 °C при постоянном давлении 2.2 атм. Калориметрические профили необратимо денатурированного белка были скорректированы на базовую линию, а поправка на возможную агрегацию была получена при вторичном нагревании образца.

Статистические методы

Эксперименты были повторены от 3 до 5 раз. Статистический анализ проведен с использованием методов описательной статистики и тестов Краскела–Уоллиса и Коновера (© И.П. Гайдышев. Статистический пакет “AtteStat”, 2018).

Ингибирование агрегации УФ-βL-кристаллина α-кристаллином

Использованный в работе препарат βL-кристаллина по данным денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле (данные не приводятся) является смесью βB3-кристаллина и βB2-кристаллина, а также протеолитических фрагментов βB2-, βA2- и βA1-кристаллинов, что хорошо согласуется с литературными данными [29, 30].

Облучение ультрафиолетом раствора βL-кристаллина вызывает его агрегацию (рис. 1). Однако если агрегация при 37 °C начинается при дозе ультрафиолета, несколько меньшей 1 Дж/см2, то при 10 °C старт агрегации наблюдается при вдвое большей дозе, близкой к 2 Дж/см2.

Рис. 1.

Агрегация раствора βL-кристаллина под действием ультрафиолета. По оси ординат – поглощение при 450 нм, по оси абсцисс – доза ультрафиолета; 1 – агрегация при 37 °C, 2 – агрегация при 10 °C.

Это означает, что при низкой температуре в растворе накапливаются денатурированные, способные к агрегации молекулы βL-кристаллина (УФ-βL-кристаллин). Если такой раствор нагреть до 37 °C, то белок агрегирует в течение 30–40 мин [31].

При добавлении α-кристаллина к раствору УФ-βL-кристаллина наблюдается концентрационно-зависимое ингибирование процесса агрегации. Полное блокирование процесса наблюдается при соотношении повреждаемого белка к шаперону 1/1 по весу (данные не приводятся).

Влияние α-кристаллина на термостабильность облученного ультрафиолетом βL-кристаллина

На рис. 2 представлены ДСК-профили нативного и облученного ультрафиолетом βL-кристаллина до и после инкубации с α-кристаллином. Образец нативного βL-кристаллина на ДСК-профиле имеет сложную форму (кривая 1 на рис. 2), что подтверждает гетерогенность препарата белка. Площадь под кривой соответствует молярной энтальпии при денатурации белка (ΔH) и пропорциональна количеству нативного белка. Облучение ультрафиолетом существенно снижает площадь под кривой, что указывает на снижение доли нативного белка (рис. 2). Инкубация поврежденного ультрафиолетом белка с α-кристаллином незначительно влияет на энергию денатурации. Необходимо отметить, что положение Tmax на ДСК-профилях практически неизменно после облучения белка ультрафиолетом. Значение Tmax для нативного βL-кристаллина составляет (64.9 ± 0.2) °C (среднее ± стандартное отклонение). Значение Tmax для УФ-βL-кристаллина – (63.7 ± 0.2) °C, а для УФ-βL-кристаллина, инкубированного с α‑кристаллином в течение 24 ч, – (63.2 ± 0.2) °C.

Рис. 2.

Термостабильность препаратов нативного и поврежденного ультрафиолетом βL-кристаллина. а – Профили дифференциальной сканирующей калориметрии: 1 – нативный βL-кристаллин, 2 – УФ-βL-кристаллин, 3 – УФ-βL-кристаллин, инкубированный в течение суток с α-кристаллином; б – молярная энтальпия денатурации нативного βL-кристаллина (1), поврежденного ультрафиолетом βL-кристаллина (2), поврежденного ультрафиолетом βL-кристаллина, инкубированного в течение суток с α-кристаллином (3); ** – P < 0.02 – достоверность различия между нативным белком и УФ-βL-кристаллином и УФ-βL-кристаллином, инкубированным в течение суток с α-кристаллином (тесты Краскела–Уоллиса и Коновера).

Для повреждения βL-кристаллина ультрафиолетом были использованы дозы около 2 Дж/см2, что сравнимо с естественным уровнем УФ-облучения. Например, житель Южной Европы (Франция, Бордо) в течение жизни получает дозу ультрафиолета около 1 Дж/см2 [32]. Это дает основания предполагать, что в условиях in vivo солнечный свет может вызывать повреждение белков. Таким образом, УФ-βL-кристаллин, использованный в нашем эксперименте, является естественным субстратом для α-кристаллина.

Денатурация βL-кристаллина при ультрафиолетовом облучении описывается в рамках одноударной модели [31]. Это значит, что молекула белка накапливает фотохимические повреждения без изменения нативной конформации. Но в определенный момент, при достижении порога фотохимического повреждения, поглощение только одного кванта света вызывает одномоментную денатурацию молекулы [33].

Нагревание раствора до 37 °C индуцирует агрегацию белка, тогда как добавление α-кристаллина ингибирует этот процесс. Полное блокирование агрегации наблюдали при соотношении белок/шаперон 5/1 (моль на моль), что совпадает с данными, полученными нами на других моделях – при тепловой и химической денатурации белка [21, 34].

Показано, что α-кристаллин восстанавливает структуру белков, денатурированных детергентами за счет образования с ними комплекса [16–18]. Поэтому можно было бы ожидать, что денатурированные молекулы УФβL-кристаллина, образовавшие комплекс с α-кристаллином, также будут восстанавливать свою нативную структуру. Действительно, молекулы поврежденного белка в составе комплекса находятся в особом положении по сравнению с молекулами в растворе. Такие молекулы не могут агрегировать, поскольку не имеют возможности взаимодействовать друг с другом. Вместе с тем денатурированные молекулы УФ-βL-кристаллина, связанные с α-кристаллином, частично экспонированы в гидрофильную среду растворителя. Под действием полярного окружения частично развернутые белковые цепи могут складываться в структуры, близкие к нативным, как это происходит при ренатурации белка из раствора детергента. В случае восстановления нативной структуры УФ-βL-кристаллина при инкубации с α-кристаллином доля нативного белка должна возрасти по сравнению с белком, не подвергнутым этой процедуре.

Чтобы оценить такую возможность, нами был использован метод ДСК, который позволяет определить долю нативного βL-кристаллина в облученных ультрафиолетом образцах. Площадь под кривой ДСК соответствует общей теплоте денатурации белка и пропорциональна количеству в образце нативного белка [22, 31]. Мы установили, что общая энергия денатурации стабильных водорастворимых белковых форм облученного ультрафиолетом βL-кристаллина не отличается от энергии денатурации βL-кристаллина, инкубировавшегося с α-кристаллином в течение 24 ч. Иными словами, взаимодействие денатурированного под действием ультрафиолета βL-кристаллина с α-кристаллином не приводит к восстановлению нативной структуры денатурированного белка.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для исследования шапероноподобных свойств α-кристаллина широко используются модельные системы, основанные на взаимодействии денатурированных детергентами белков с α-кристаллином in vitro. В таких системах α-кристаллин проявляет свойства истинного шаперона и способствует восстановлению нативной структуры денатурированного белка. Такие свойства α-кристаллина могли бы играть важную роль в предупреждении возникновения помутнения хрусталика глаза (катаракты). Однако при использовании в качестве целевого белка физиологически значимого субстрата, а именно βL-кристаллина, поврежденного воздействием ультрафиолета, ренатурация дестабилизированного белка в присутствии α-кристаллина нами не обнаружена. Учитывая, что взаимодействие белков проводилось в условиях, близких к физиологическим (температура, рН, солевой состав среды), можно ожидать, что и в условиях in vivo ренатурация поврежденных ультрафиолетом белков не происходит. Авторы полагают, что причиной этому могут быть внутримолекулярные сшивки, образующиеся в белке при действии ультрафиолета, которые стабилизируют молекулу в развернутом (денатурированном) состоянии.

Список литературы

  1. Caspers G.J., Leunissen J.A., de Jong W.W. // J. Mol. Evol. 1995. V. 40. P. 238.

  2. Bloemendal H., De Jong W., Jaenicke R. et al. // Prog. Biophys. Mol. Biol. 2004. V. 86. P. 407.

  3. Iwaki T., Kume-Iwaki A., Goldman J.E. // J. Histochem. Cytochem. 1990. V. 38. P. 31.

  4. Kannan R., Sreekumar P.G., Hinton D.R. // Biochim. Biophys. Acta. 2016. V. 1860. P. 258.

  5. Srinivasan A.N., Nagineni C.N. Bhat S.P. // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 23337.

  6. Benedek G.B. // Appl. Opt. 1971. V. 10. P. 459.

  7. Delaye M., Tardieu A. // Nature. 1983. V. 302. P. 415.

  8. Mirarefi A.Y., Boutet S., Ramakrishnan S. et al. // Biochim. Biophys. Acta. 2010. V. 1800. P. 556.

  9. Derham B.K., Harding J.J. // Prog. Retin. Eye Res. 1999. V. 18. P. 463.

  10. Horwitz J. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992. V. 89. P. 10449.

  11. Boyle D.L., Takemoto L., Brady J.P. et al. // BMC Ophthalmol. 2003. V. 3. P. 3.

  12. Graw J. // Exp. Eye Res. 2009. V. 88. P. 173.

  13. Hu W.F., Gong L., Cao Z. et al. // Curr. Mol. Med. 2012. V. 12. P. 177.

  14. Maddala R., Rao V.P. // Exp. Cell Res. 2005. V. 306. P. 203.

  15. Haslbeck M., Vierling E. // J. Mol. Biol. 2015. V. 427. P. 1537.

  16. Ganea E., Harding J.J. // Biochem. J. 2000. V. 345. P. 467.

  17. Nath D., Rawat U., Anish R. et al. // Protein Sci. 2002. V. 11. P. 2727.

  18. Rachdan D., Lou M.F., Harding J.J. // Curr. Eye Res. 2005. V. 30. P. 919.

  19. Bumagina Z.M., Gurvits B.Y., Artemova N.V. et al. // Biophys. Chem. 2010. V. 146. P. 108.

  20. Hook D.W., Harding J.J. // Intern. J. Biol. Macromol. 1998. V. 22. P. 295.

  21. Khanova H.A., Markossian K.A., Kurganov B.I. et al. // Biochemistry. 2005. V. 44. P. 15480.

  22. Maloletkina O.I., Markossian K.A., Chebotareva N.A. et al. // Biophys. Chem. 2012. V. 163–164. P. 11.

  23. Javitt J.C., Taylor H.R. // Doc. Ophthalmol. 1994. V. 88. P. 307.

  24. Artigas C., Navea A., Lopez-Murcia M.M. et al. // J. Fr. Ophtalmol. 2014. V. 37. P. 773.

  25. Lofgren S. // Invest Ophthalmol.Vis.Sci. 2001. V. 42. P. 1833.

  26. Chiou S.H., Azari P., Himmel M.E. et al. // Intern. J. Pept. Protein Res. 1979. V. 13. P. 409.

  27. Putilina T., Skouri-Panet F., Prat K. et al. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 13747.

  28. Itzhaki R.F., Gill D.M. // Anal Biochem. 1964. V. 9. P. 401.

  29. Slingsby C., Bateman O.A. // Exp. Eye Res. 1990. V. 51. P. 21.

  30. Srivastava K., Gupta R., Chaves J.M. et al. // Biochemistry. 2009. V. 48. P. 7179.

  31. Muranov K.O., Maloletkina O.I., Poliansky N.B. et al. // Exp. Eye Res. 2011. V. 92. P. 76.

  32. Delcourt C., Cougnard-Gregroire A., Boniol M. et al. // Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 2014. V. 55. P. 7619.

  33. Setlow R., Doyle B. // Biochim. Biophys. Acta. 1957. V. 24. P. 27.

  34. Borkman R.F., Knight G., Obi B. // Exp. Eye Res. 1996. V. 62. P. 141.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Химическая физика

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал