Химическая физика, 2019, T. 38, № 12, стр. 11-18

Мезо-замещенные карбоцианины – эффективные спектрально-флуоресцентные и фотохимические зонды для структурно-организованных систем на основе биомолекул

А. С. Татиколов 1*, П. Г. Пронкин 1, Л. А. Шведова 1, И. Г. Панова 2

1 Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук
Москва, Россия

2 Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук
Москва, Россия

* E-mail: tatikolov@mail.ru

Поступила в редакцию 03.06.2019
После доработки 03.06.2019
Принята к публикации 20.06.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

Исследования фотоники красителей в структурно-организованных системах имеют большое фундаментальное и прикладное значение. В связи с этим, поиск простых и удобных методов анализа состава и изучения структурно-организованных систем на основе биомолекул (белков, нуклеиновых кислот и др.) с использованием красителей-зондов, весьма актуален. Такими зондами могут быть мезо-замещенные полиметиновые (карбоцианиновые) красители. Мезо-замещенные красители обладают уникальным набором спектрально-флуоресцентных и фотохимических свойств, чувствительных к молекулярному окружению. В структурно-организованных системах фотоника этих красителей резко изменяется, что позволяет их использовать для изучения таких систем. Одной из особенностей этих красителей является подвижное равновесие между транс- и цис-изомерами, по-разному взаимодействующими с биомолекулами. Взаимодействие красителей с компонентами структурно-организованных систем приводит к росту флуоресценции и интеркомбинационной конверсии в триплетное состояние. Нами разработаны и применены на практике спектрально-флуоресцентные и фотохимические зонды на основе мезо-замещенных карбоцианинов. В частности, один из анионных карбоцианинов широко использовался нами как зонд в биологических системах, содержащих сывороточный альбумин и коллагены. Настоящий обзор посвящен работам авторов по исследованию взаимодействия мезо-замещенных карбоцианиновых красителей с биомолекулами и фотонике мезо-замещенных карбоцианинов в комплексах с биомолекулами. Рассмотрены также работы по применению этих красителей в качестве зондов в биологических системах.

Ключевые слова: карбоцианиновые красители, биомолекулы, фотоника, спектрально-флуоресцентные свойства, транс-цис-изомеризация.

ВВЕДЕНИЕ

Изучение фотоники красителей в структурно-организованных молекулярных и супрамолекулярных биосистемах имеет фундаментальное и прикладное значение. Эти исследования способны внести вклад в фотофизику и фотохимию красителей, а также могут иметь практическое значение при разработке и совершенствовании методов анализа и исследования структурно-организованных систем. Методы анализа систем на основе биомолекул с использованием красителей-зондов являются сравнительно простыми и удобными, поэтому их разработка весьма актуальна. Полиметиновые (цианиновые) красители могут служить такими красителями-зондами, поскольку они обладают высокими коэффициентами экстинкции и их свойства зависят от молекулярного окружения [1]. Известно также, что ряд этих красителей образуют нековалентные комплексы с биомолекулами, что также создает предпосылки для их использования в качестве зондов в системах, содержащих биомолекулы [2]. Среди этих красителей особенно выделяются мезо-замещенные карбоцианины, которые обладают уникальным набором спектрально-флуоресцентных и фотохимических свойств, чувствительных к молекулярному окружению. Ниже приведена общая структура молекулы мезо-замещенных карбоцианиновых красителей:

где R – мезо- (или 9-) заместитель в полиметиновой цепи, Х – гетероатом (обычно S или O), A – противоион. Заместители могут находиться также в концевых гетероциклах молекулы. Красители, изображенные выше, являются катионными; если оба заместителя R' содержат анионные группы (обычно сульфогруппы), то красители становятся анионными.

Одной из важных особенностей таких красителей является подвижное равновесие между транс- и цис-изомерами, по-разному взаимодействующими с биомолекулами, которое зависит от среды [2, 3]. Для разработки новых зондов на биомакромолекулы нами проводилось изучение взаимодействия мезо-замещенных карбоцианинов с биомолекулами и исследование их фотофизических и фотохимических свойств в биомолекулярных средах. Настоящий обзор посвящен рассмотрению таких работ.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КАТИОННЫХ МЕЗО-ЗАМЕЩЕННЫХ КАРБОЦИАНИНОВЫХ КРАСИТЕЛЕЙ С ДНК И ДРУГИМИ БИОМОЛЕКУЛАМИ

Хотя в мировой литературе первые работы по исследованию взаимодействия мезо-замещенных карбоцианиновых красителей с ДНК и другими биомолекулами опубликованы еще в 1964 г. (изучался катионный краситель 3,3'-диэтил-4,5,4',5'-дибензо-9-метилтиакарбоцианин-бромид (Stains-all) [46], такие работы все же довольно редки по сравнению с исследованиями других красителей [2]. Можно упомянуть, в частности, работу, в которой был синтезирован большой ряд катионных карбоцианинов (среди них семь мезо-замещенных) с целью использования для детектирования биомолекул и кратко изучено их взаимодействие с ДНК, РНК и бычьим сывороточным альбумином [7]. Однако исследование, проведенное в ней, было весьма поверхностным. Кроме того, в этой и в других подобных работах не проводилось изучения элементарных фотохимических процессов (транс-цис-фотоизомеризации и гибели образующегося фотоизомера, образования и тушения триплетного состояния) с участием полиметиновых красителей в биомолекулярных средах. Такое изучение, дающее ценную информацию о молекулярном окружении красителя-зонда, было сделано в ряде наших работ.

Первая наша публикация по исследованию мезо-замещенных карбоцианинов и их комплексов с биомолекулами вышла в 2002 г. [8]. В ней описано исследование нековалентного взаимодействия двух мезо-замещенных карбоцианиновых красителей – 3,3'-диэтил-9-метилтиакарбоцианин-иодида (ДЭМТКЦ) и 3,3'-диэтил-9-метилоксакарбоцианин-иодида (ДЭМОКЦ) – с ДНК. Для сравнения изучалось также взаимодействие с ДНК двух мезо-незамещенных аналогов – 3,3'-диэтил-тиакарбоцианин-иодида (ДТКЦ) и 3,3'-диэтил-оксакарбоцианин-иодида (ДОКЦ). Было показано, что красители образуют с ДНК комплексы, что сопровождается резким ростом флуоресценции, которая для мезо-замещенных красителей выше, чем для незамещенных.

Исследовалось также влияние ДНК на цис-транс-равновесие и флуоресцентные свойства 3,3'-диэтил-9-тиометилтиакарбоцианин-иодида (ДЭТТКЦ) [9]. Было показано, что в водном растворе ДЭТТКЦ находится в цис-форме, в то время как в изопропаноле имеется равновесие между цис- и транс-изомером. Обнаружено, что краситель образует с ДНК нековалентные комплексы преимущественно в форме цис-изомера. Комплексобразование с ДНК приводит к существенному росту квантового выхода триплетного состояния ДЭТТКЦ, константа скорости тушения которого кислородом kq(O2) ~ 9 ⋅ 107 л моль–1 ⋅ с–1 оказалась существенно ниже диффузионного предела (за счет экранирования молекул красителя связанного с биополимером).

В дальнейшем наша работа в этом направлении интенсивно развивалась. В частности, изучалось влияние ДНК на цис-транс-равновесие и спектрально-флуоресцентные свойства ряда мезо-замещенных карбоцианинов: 3,3'-диэтил-9-метокситиакарбоцианин-иодида (ДМТКЦ), 3,3',9-триэтилтиакарбоцианин-иодида (ТЭТКЦ), 3,3'-диметил-9-этилоксакарбоцианин-иодида (ДМЭОКЦ), 3,3',9-триэтил-6,6'-диметоксиоксакарбоцианин-иодида (ТЭООКЦ), 3,3',9-триэтил-5,5'-диметилоксакарбоцианин-иодида (ТЭМОКЦ) [10]. Для тиакарбоцианинов в ряде органических растворителей обнаружено равновесие между цис- и транс-изомерами, причем рост полярности растворителя сдвигает равновесие в сторону цис-изомера. Показано, что образование стабильных нековалентных комплексов тиакарбоцианиновых красителей с ДНК приводит к сдвигу изомерного равновесия и протекает преимущественно через цис-форму.

В работе [11] было показано, что взаимодействие с ДНК мезо-замещенного карбоцианинового красителя 3,3'-диэтил-9-хлортиакарбоцианин-перхлората (ДХТКЦ) протекает в цис-форме. Первоначально ДХТКЦ связывается с ДНК в комплекс в форме длинноволнового транс-изомера ($\lambda _{{max}}^{{abs}}$ = 556 нм), который затем (в течение десятков минут) переходит в более устойчивый комплекс цис-изомера ДХТКЦ с ДНК ($\lambda _{{max}}^{{abs}}$ = 520 нм). Обнаружено существенное влияние концентраций реагентов и ионной силы раствора на кинетику транс-цис-перехода комплекса ДХТКЦ с ДНК.

Методом импульсного фотолиза исследовались фотохимические процессы в молекулах мезо-замещенных тиакарбоцианинов ДМТКЦ, ТЭТКЦ, ДХТКЦ, ДЭМТКЦ [12]. При импульсном фотовозбуждении растворов ДМТКЦ наблюдались процессы транс-цис- и цис-транс-фотоизомеризации, получены данные о структуре полос поглощения изомеров. Комплексообразование с ДНК приводит к росту квантового выхода триплетного состояния красителей, что объясняется увеличением жесткости связанных молекул. В присутствии ДНК дезактивация триплетного состояния протекает по двухэкспоненциальному закону (отметим, что аналогичные результаты были также получены для ДЭТТКЦ [8]). Были изучены процессы тушения триплетного состояния красителей кислородом в растворах и в комплексах с ДНК. Константы скорости тушения триплетного состояния красителей в комплексах с ДНК кислородом оказались существенно ниже ожидаемых величин для диффузионно-контролируемых реакций (с учетом спин-статистического фактора (kq(O2) < 1/9 kdif), что объясняется стерическим фактором комплексообразования. Комплексообразование определяет стерические препятствия при тушении триплетных состояний лигандов и обусловливает большую разницу в константах скоростей процессов тушения. Подробно изучено также тушение триплетного состояния ДМТКЦ, ДЭМТКЦ, ТЭТКЦ, ДЭТТКЦ нитроксильными радикалами, иодид-ионом и кислородом в растворах и в комплексах с ДНК [13]; определены соответствующие константы скорости. Полученные в [9, 12, 13] результаты свидетельствуют об образовании комплексов краситель-ДНК двух различных типов.

Был осуществлен перенос энергии электронного возбуждения (ПЭЭВ) между молекулами карбоцианиновых красителей в комплексе с ДНК [14]. В качестве донора энергии использовался мезо-замещенный оксакарбоцианин ТЭМОКЦ, в качестве акцептора – ДТКЦ. Переносу энергии при этом способствует сближение молекул донора и акцептора при связывании с биомолекулой. При этом в спектре возбуждения флуоресценции акцептора наблюдалась полоса, принадлежащая донору. Изучено тушение флуоресценции донора акцептором в присутствии ДНК. Результаты экспериментов обсуждаются с позиции образования стехиометрического комплекса краситель–ДНК и с точки зрения концентрирования красителей в микрофазе (псевдофазе) биополимера. Показано, что экспериментальные результаты не описываются моделью стехиометрического комплекса. В дальнейшем обнаруженный ПЭЭВ был изучен более подробно [15, 16], при этом в качестве доноров энергии, помимо ТЭМОКЦ, использовался ДМЭОКЦ, в качестве акцептора – ДТКЦ. Методом пикосекундной спектроскопии была измерена кинетика затухания флуоресценции доноров и ее тушение акцептором в присутствии ДНК. При интерпретации экспериментальных данных использовалась микрофазная модель, при этом учитывалось концентрирование молекул красителей вблизи молекул ДНК. Анализ кинетических зависимостей позволил получить данные о распределении расстояний в донорно-акцепторных парах при ПЭЭВ. Обнаружено влияние концентрации акцептора на параметры распределения его молекул в микрофазе тушения [16].

Проводилось также спектрально-флуоресцентное изучение взаимодействия с ДНК двух катионных карбоцианинов – мезо-замещенного красителя 3,3',9-триметилтиакарбоцианин-иодида (ТМКЦ) и, для сравнения, его незамещенного аналога 3,3'-диметилтиакарбоцианин-иодида (ДМКЦ) [17]. При титровании растворов красителей ДНК происходит падение интенсивности полосы поглощения исходного красителя, длинноволновый сдвиг и рост интенсивности полосы поглощения и интенсивности флуоресценции красителя, связанного с ДНК. Проведено математическое моделирование роста интенсивности флуоресценции, исходя из образования одного или двух типов комплексов красителя с ДНК. Экспериментальные результаты удовлетворительно описываются моделью, включающей один тип комплекса краситель–ДНК. Показано, что ТМКЦ связывается с ДНК в виде цис-изомера, в то время как ДМКЦ – в виде транс-изомера.

Спектрально-флуоресцентными методами подробно исследовалось цис-транс-равновесие ряда мезо-замещенных оксакарбоцианиновых красителей: ДЭМОКЦ, ДМЭОКЦ, ТЭООКЦ, ТЭМОКЦ, а также для сравнения – незамещенного красителя ДОКЦ в растворах и в комплексе с ДНК [18]. В присутствии ДНК наблюдается сдвиг изомерного цис-транс-равновесия в сторону образования транс-изомера, что во многом определяет спектральные эффекты, наблюдаемые при комплексообразовании оксакарбоцианиновых красителей. Резкий рост флуоресценции (благодаря связыванию транс-изомера) в комплексе с ДНК является благоприятным фактором для использования оксакарбоцианиновых красителей в качестве зондов для определения ДНК.

Методом импульсного фотолиза изучались: фотоизомеризация, обратная термическая изомеризация, а также спектрально-кинетические свойства триплетного состояния мезо-замещенных оксакарбоцианиновых красителей ДМЭОКЦ, ТЭМОКЦ и незамещенного красителя ДОКЦ в растворах и в комплексах с ДНК [19]. В растворах при импульсном фотовозбуждениии красителей наблюдались процессы фотоизомеризации, получены дифференциальные спектры поглощения фотоизомеров. Образование комплексов красителей с ДНК затрудняет фотоизомеризацию и приводит к росту квантового выхода триплетного состояния. Дезактивация триплетного состояния протекает по двухэкспоненциальному закону, что указывает на возможность образования комплексов двух различных типов. Изучены процессы тушения триплетного состояния ТЭМОКЦ кислородом в растворах и в комплексах с ДНК. В присутствии ДНК константы скорости тушения оказались существенно ниже величин, характерных для диффузионно-контролируемых реакций с учетом спин-статистического фактора.

Изучены спектрально-флуоресцентные и фотохимические свойства двух мезо-замещенных тиакарбоцианинов: 3,3'-диэтил-9-фенилтиакарбоцианин-иодида и 3,3'-диэтил-9-(о-гидрокси-п-метоксифенил)тиакарбоцианин-иодида в растворах и их взаимодействие с ДНК [20]. Красители образуют нековалентные комплексы с ДНК, что сопровождается изменениями спектров поглощения и ростом флуоресценции. Полученные данные указывают, что красители находятся в форме транс-изомеров как в растворителях различной полярности, так и в комплексах с ДНК. Это обусловлено поворотом и выходом мезо-фенильных колец из плоскости хромофора, что уменьшает их стерическое влияние на геометрию молекулы красителя. Показано, что взаимодействие красителей с ДНК – сложный процесс, включающий мономерные молекулы и агрегаты красителей. При импульсном фотовозбуждении в растворах наблюдаются образование и последующая гибель фотоизомеров красителей; триплетное состояние не образуется. В комплексе с ДНК не наблюдается сигналов фотоизомеров; в отсутствие кислорода наблюдается образование триплетного состояния. Кинетика гибели триплетного состояния двухэкспоненциальна; константы скорости тушения триплетных состояний кислородом ниже диффузионно-контролируемого предела.

Изучалось также взаимодействие катионных тиакарбоцианинов с другими биомолекулами. В частности, было изучено их нековалентное взаимодействие с гиалуроновой кислотой (ГК) – линейным полисахаридом, встречающимся в различных биосистемах [21]. Были взяты мезо-замещенные красители ТМКЦ и ДЭМТКЦ и для сравнения – незамещенные красители ДМКЦ и ДТКЦ. В присутствии ГК красители ТМКЦ, ДМКЦ и ДЭМТКЦ образуют Н-агрегаты, что отражается в появлении коротковолновой полосы поглощения с максимумом при 440–450 нм. По склонности к Н-агрегации в присутствии ГК красители можно расположить в ряд ТМКЦ > ДМКЦ > ДЭМТКЦ > ДТКЦ. Определено число агрегации ТМКЦ n = 3. В буферных растворах с рН 4.5, 7.0 и 9.1 полосы поглощения Н-агрегатов ТМКЦ более длинноволновые (с максимумами 460–470 нм), чем в отсутствие буферов. ТМКЦ предложен в качестве спектрального зонда для обнаружения ГК в биологических системах.

Изучалось также взаимодействие ТМКЦ с другим биологически важным соединением – гликозаминогликаном хондроитин-4-сульфатом (ХС) в буферных растворах с различным рН и в отсутствие буферов [22]. Показано, что во всех изученных средах при сравнительно больших концентрациях краситель связывается с ХС главным образом в виде мономера, что сопровождается резким ростом интенсивности флуоресценции (наблюдается также промежуточное образование агрегатов на ХС). Определены: константа связывания, число мономерных звеньев ХС на одну молекулу красителя и квантовый выход флуоресценции Φf связанного красителя. Зависимость Φf от рН немонотонна: она имеет минимум в области нейтральных рН, что объясняется изменением заряда макромолекулы ХС при изменении рН и конформационными изменениями в биополимере.

Методом импульсного фотолиза изучались первичные фотохимические процессы в молекулах ТМКЦ, ДЭМТКЦ и ТЭТКЦ в комплексах с ДНК и ХС [23]. Обнаружено, что, наряду с генерацией триплетного состояния красителей, наблюдается образование транс-фотоизомеров ТМКЦ и ДЭМТКЦ, связанных с биомолекулами (для свободных красителей фотоизомеризация не наблюдается). Эффект объясняется влиянием матрицы биополимера на поверхности потенциальной энергии процесса фотоизомеризации.

Проводилось спектрально-флуоресцентное изучение взаимодействия ТМКЦ с биологическими мицеллярными системами – солями желчных кислот (холатами): дезоксихолатом натрия, холатом натрия и таурохолатом натрия. При введении в водный раствор ТМКЦ малых концентраций холатов наблюдалась агрегация красителя на холатах. С ростом концентрации холатов выше второй критической концентрации мицеллообразования (ККМ2) наблюдался постепенный распад агрегатов на мономеры с ростом интенсивности флуоресценции красителя [24]. Методом импульсного фотолиза изучалась фотохимия ТМКЦ в мицеллах холатов. Наблюдалась фотоизомеризация и образование триплетного состояния красителя [25].

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АНИОННЫХ МЕЗО-ЗАМЕЩЕННЫХ КАРБОЦИАНИНОВЫХ КРАСИТЕЛЕЙ С БЕЛКАМИ И ДРУГИМИ БИОЛОГИЧЕСКИ ВАЖНЫМИ МОЛЕКУЛАМИ

В 2004 г. была опубликована наша первая работа по исследованию взаимодействия полиметиновых красителей с сывороточным альбумином [26], в которой изучалось нековалентное взаимодействие различных классов полиметиновых красителей с сывороточным альбумином человека (САЧ). Было установлено, что в то время как катионные полиметиновые красители сравнительно слабо взаимодействуют с САЧ (константа связывания Kb порядка 104 л/моль), ряд анионных красителей взаимодействуют с САЧ гораздо эффективнее (Kb порядка 107 л/моль). В частности, мезо-замещенный анионный карбоцианин пиридиниевая соль 3,3'-ди-(γ-сульфопропил)-4,5,4',5'-дибензо-9-этилтиакарбоцианин-бетаина (ДЭЦ) взаимодействует с САЧ с Kb > 106 л/моль и резким ростом интенсивности флуоресценции (при этом димеры красителя, в виде которых он в основном находится в водном растворе, распадаются, образуя транс-мономеры), что было в дальнейшем использовано нами при применении ДЭЦ в качестве зонда на САЧ в биологических системах. Резкий рост интенсивности флуоресценции обусловлен тем, что исходно ни димеры красителя, ни цис-мономеры практически не флуоресцируют. К тому же, при взаимодействии с САЧ резко изменяется и спектр поглощения красителя: полоса с максимумом $\lambda _{{max}}^{{abs}}$ ~ 535 нм (димеры) заменяется на полосу с $\lambda _{{max}}^{{abs}}$ = 612 нм (транс-мономеры). Было также обнаружено, что ДЭЦ, наряду с альбумином, эффективно взаимодействует с коллагенами с образованием J-агрегатов на молекулах коллагенов (с $\lambda _{{max}}^{{abs}}$ = 642–648 нм), причем по спектральным свойствам и поведению J-агрегатов удалось даже различить коллагены типа I и III. Обнаружено также, что другой анионный мезо-замещенный краситель – пиридиниевая соль 3,3'-ди-(γ-сульфопропил)-5,5'-дифенил-9-этилоксакарбоцианин-бетаина (ДОЦ) также образует агрегаты на коллагенах [27].

Вышеприведенные работы послужили предпосылками для использования ДЭЦ в качестве спектрально-флуоресцентного зонда на САЧ и коллагены. С помощью ДЭЦ был, в частности, наряду с коллагеном, обнаружен альбумин в стекловидном теле глаза плодов человека [28]. ДЭЦ был предложен в качестве зонда для количественного определения САЧ и коллагена в межклеточных средах, при этом гиалуроновая кислота не мешает их определению. Чувствительность метода по САЧ составляет около 10–7 моль/л по спектрам поглощения и 10–9 моль/л по спектрам флуоресценции, поскольку образующийся при связывании с САЧ транс-мономер ДЭЦ обладает интенсивной флуоресценцией [29]. ДЭЦ широко использовался нами в качестве зонда для измерения концентрации САЧ в тканях глаза человека [3032], а также для определения коллагена в тканях глаза лягушки (было установлено присутствие коллагена, близкого к типу I) [33]. Зонд ДЭЦ применялся также для определения содержания альбумина и коллагена в стекловидном теле глаза человека после ферментативной обработки протеиназой К, трипсином, коллагеназой и гиалуронидазой [34]. Этот же краситель использовался в качестве зонда для изучения состояния САЧ, образующего белковые покрытия на магнитных наночастицах [35, 36].

При анализе тканей глаза было показано, что ДЭЦ взаимодействует только с САЧ и коллагенами и не взаимодействует с другими компонентами тканей (альфа-фетопротеином, ГК, мочевиной, мочевой кислотой и др.). Было установлено к тому же, что ДЭЦ обладает высокой селективностью по отношению к различным видам сывороточных альбуминов: эффективно взаимодействует с САЧ и очень слабо взаимодействует с сывороточными альбуминами других животных [37]. Для изучения этого свойства ДЭЦ спектрально-флуоресцентными методами проведено сравнительное исследование нековалентного взаимодействия ДЭЦ с сывороточными альбуминами различных позвоночных: крысы, кролика, быка и человека [38]. Показано, что при взаимодействии с САЧ краситель образует лишь один продукт – транс-мономер, связанный с САЧ, в то время как с другими альбуминами образуются также другие продукты связывания (прежде всего, агрегаты красителя). Это является следствием более высокой энергии взаимодействия красителя с САЧ, чем с другими сывороточными альбуминами, что объясняет высокую селективность ДЭЦ по отношению к САЧ.

Были подробно изучены спектрально-флуоресцентные свойства ДОЦ в растворах и в комплексах с САЧ [39]. Взаимодействие с САЧ приводит к значительному росту флуоресценции красителя. Изучено тушение флуоресценции ДОЦ в комплексе с САЧ ибупрофеном и варфарином. Данные по тушению флуоресценции ибупрофеном указывают на связывание красителя в субдомене IIIA центра связывания II молекулы САЧ. Синхронные спектры флуоресценции САЧ в присутствии ДОЦ показали, что комплексообразование с ДОЦ не приводит к заметной перестройке молекулы белка в центре связывания.

Изучено также влияние образования комплексов ДОЦ с бычьим сывороточным альбумином (БСА) на его спектрально-флуоресцентные свойства [40]. Связывание ДОЦ с БСА приводит к значительному росту флуоресценции красителя. Изменения спектров поглощения и флуоресценции ДОЦ при взаимодействии с БСА свидетельствуют в пользу сдвига цис-транс-равновесия красителя в комплексе. Исследовано влияние добавок денатурирующих альбумин соединений (мочевины, додецилсульфата натрия) на спектрально-флуоресцентные свойства красителя в комплексе ДОЦ–БСА.

Исследована J-агрегация ДОЦ в водных растворах в присутствии белков (сывороточных альбуминов, коллагенов, иммуноглобулина G) и синтетических полиэлектролитов (полиэтиленимина, поливинилпирролидона) [41]. Обнаружено, что денатурация сывороточного альбумина человека мочевиной стимулирует J-агрегацию красителя. В присутствии денатурированного альбумина и полиэтиленимина краситель образует J-агрегаты двух типов. Образующиеся в присутствии полиэтиленимина J-агрегаты претерпевают перестройку во времени. Оксакарбоцианиновый краситель ДОЦ может служить зондом для альбуминов и использоваться для изучения процессов денатурации белков (см. [42]).

Проведено спектрально-флуоресцентное исследование взаимодействия c САЧ и БСА двух анионных полиметиновых красителей, один из которых – мезо-замещенный карбоцианин пиридиниевая соль 3,3'-ди-(γ-сульфопропил)-9-метилтиакарбоцианин-бетаина (ДСМТ) [43]. При взаимодействии с альбуминами наблюдается рост интенсивности флуоресценции и, в большинстве случаев, длинноволновый сдвиг полосы поглощения красителей. Для ДСМТ наблюдается подвижное цис-транс-равновесие: в свободном состоянии краситель находится главным образом в виде цис-изомера, а в комплексе с альбуминами равновесие сдвигается в сторону транс-изомера (этот сдвиг сильнее для САЧ, чем для БСА). Определены константы связывания красителей с альбуминами. ДСМТ рекомендован в качестве спектрально-флуоресцентного зонда на сывороточные альбумины.

Недавно были начаты исследования взаимодействия с САЧ близкого аналога ДЭЦ – натриевой соли 3,3'-ди-(γ-сульфопропил)-4,5,4',5'-дибензо-9-метилтиакарбоцианин-бетаина (ДМЦ) [44, 45]. Показано, что он эффективно взаимодействует с САЧ с ростом интенсивности флуоресценции.

Был изучен ПЭЭВ между молекулами двух мезо-замещенных тиакарбоцианиновых красителей, нековалентно связанных с САЧ [46]. В качестве донора энергии использовался ДСМТ и в роли красителя-акцептора выступал ДЭЦ. Перенос энергии был возможен вследствие сближения молекул донора и акцептора при связывании с молекулой САЧ. ПЭЭВ был изучен как в образцах, представляющих собой растворы САЧ, так и в системах, содержащих магнитные наночастицы с белковыми покрытиями. На основании полученных результатов сделан вывод о сохранении функциональных свойств САЧ в составе сшитого покрытия, что свидетельствует о биосовместимости покрытий, полученных свободнорадикальной окислительной модификацией белка.

Методами оптической и флуоресцентной спектроскопии изучен ПЭЭВ между рядом анионных полиметиновых красителей, связанных с САЧ; также проведены измерения кинетики затухания флуоресценции. При этом донорами энергии служили тетрацианотри- и пентаметины, а акцепторами – два мезо-замещенных красителя: ДЭЦ и 3,3'-ди-(γ-сульфопропил)-5,5'-диметокси-9-этилтиакарбоцианин-бетаин [47]. Сравнительно малое расстояние между донором и акцептором (2.5–2.8 нм), определенное из модели Ферстера (Förster) и некоторые спектроскопические данные показывают, что молекулы донора и акцептора, вероятно, находятся в одном и том же домене связывания САЧ.

Краситель ДЭЦ был использован также при изучении структурных изменений биологических мицеллярных систем – солей желчных кислот (холатов): дезоксихолата натрия, холата натрия и таурохолата натрия [24]. Было показано, что структурные перестройки в водных растворах холатов происходят в широком диапазоне их концентраций, а не только вблизи значений ККМ, а краситель ДЭЦ может служить в качестве спектрально-флуоресцентного зонда при исследовании таких перестроек (в частности, служить индикатором для определения величины ККМ2). Кроме того, методом импульсного фотолиза изучалась фотохимия ДЭЦ в мицеллах холатов. Наблюдалось образование фотоизомера и триплетного состояния красителя [25].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как показало рассмотрение вышеприведенных работ, мезо-замещенные карбоцианиновые красители обладают рядом уникальных свойств, которые делают их незаменимыми при исследовании структурно-организованных сред, содержащих биомолекулы. Высокие константы связывания с биомолекулами, зависимость спектрально-флуоресцентных и фотохимических свойств от молекулярного окружения – все это дает большие преимущества для использования этих красителей в качестве зондов в биомолекулярных системах. Одной из важных особенностей таких красителей является динамическое равновесие между транс- и цис-изомерами, зависящее от среды, что благоприятствует использованию красителей в качестве зондов. Более резкий рост интенсивности флуоресценции при связывании с биомолекулами, обычно наблюдающийся для мезо-замещенных тиакарбоцианинов по сравнению с незамещенными, является следствием того, что эти красители в водных растворах, как правило, находятся в форме нефлуоресцирующих цис-изомеров, молекулы которых, связываясь с биомолекулами, приобретают жесткость (что способствует флуоресценции), оставаясь в цис-форме (как в случае ДНК), или переходят во флуоресцирующие транс-изомеры (в случае альбуминов). В то же время незамещенные тиакарбоцианины находятся в форме флуоресцирующих транс-изомеров как в свободном, так и в связанном состоянии, что объясняет меньший интервал изменения интенсивности флуоресценции при связывании с биомолекулами.

Сближение пары молекул красителей – донора и акцептора – в комплексе с биомолекулой дает возможность осуществить ПЭЭВ между ними. Определение параметров ПЭЭВ (из модели Ферстера) (Förster) позволяет извлечь важную информацию о локализации и динамике молекул донора и акцептора в комплексе.

Подчеркнем, что мезо-замещенные карбоцианины могут служить зондами при изучении не только нативных биомолекул, но и денатурированных, а также биомолекул в составе белковых оболочек наноразмерных частиц и биологических тканей, подвергшихся действию ферментов. С помощью этих красителей могут также изучаться процессы денатурации альбуминов под действием различных денатурирующих агентов.

Следует отметить, что мезо-замещенные карбоцианины могут служить не только спектрально-флуоресцентными, но и фотохимическими зондами. Связывание с биомолекулами резко изменяет фотохимические свойства таких красителей. В водной среде они обычно находятся в цис-форме, не фотоизомеризующейся и не переходящей в триплетное состояние при фотовозбуждении. В то же время в комплексах с биомолекулами они часто переходят в транс-форму, которая может фотоизомеризоваться (в мицеллах) и генерировать триплетное состояние (в мицеллах и в комплексах с ДНК). При этом двухкомпонентная кинетика гибели триплетного состояния в комплексах с ДНК свидетельствует о двух типах комплексов краситель–ДНК: интеркаляции между парами оснований и связывания в желобе ДНК. Тушение триплетного состояния связанного красителя тушителями различной природы дает ценную информацию о доступности молекулы-лиганда в комплексе с ДНК для активных реагентов (кислорода, ионов, радикалов и др.). Хотя в комплексе с биомолекулами фотоизомеризация обычно затруднена, для ТМКЦ и ДЭМТКЦ нами был обнаружен новый эффект – появление цис-транс-фотоизомеризации при их связывании с ДНК и хондроитин-4-сульфатом (отсутствующей у красителей в водных растворах), что можно объяснить деформацией потенциальной поверхности фотоизомеризации красителей в комплексах с биомолекулой, приводящей при фотовозбуждении к образованию транс-фотоизомера.

Благоприятные спектрально-флуоресцентные свойства ряда мезо-замещенных карбоцианинов позволили нам рекомендовать их в качестве спектрально-флуоресцентных зондов для обнаружения и изучения биомолекул. К ним относятся: тиакарбоцианины ТМКЦ (для ДНК, ГК, ХС), ДЭЦ (для САЧ, коллагенов, холатов), ДМЦ (для САЧ), ДСМТ (для сывороточных альбуминов); оксакарбоцианины ДЭМОКЦ, ДМЭОКЦ, ТЭООКЦ, ТЭМОКЦ (для ДНК), ДОЦ (для альбуминов). Уникальные свойства красителя ДЭЦ дали нам возможность широко использовать его в качестве спектрально-флуоресцентного зонда при изучении разнообразных практически важных систем, включающих биомолекулы: тканей глаза человека и животных в развитии, белковых покрытий наноразмерных частиц, мицеллярных систем солей желчных кислот. Другие из рекомендованных красителей еще не нашли широкого практического применения. Не нашли широкого применения эти красители и в качестве фотохимических зондов, хотя изучение элементарных фотохимических процессов с участием данных красителей в комплексах с биомолекулами может дать большую и ценную информацию о детальном строении центров связывания, структуре и динамике биомолекулярных систем. Таким образом, в будущем можно ожидать интенсивного развития этого направления исследований.

Работа выполнена в рамках госзадания № 001201253314 (ИБХФ РАН) и частично в рамках госзадания № 0108-2019-0005 (ИБР РАН).

Список литературы

  1. Ищенко А.А. // Успехи химии. 1991. Т. 60. № 8. С. 1708.

  2. Tatikolov A.S. // J. Photochem. Photobiol., C: Photochem. Reviews. 2012. V. 13. № 1. P. 55; https://doi.org/10.1016/j.jphotochemrev.2011.11.001

  3. Khimenko V., Chibisov A.K., Görner H. // J. Phys. Chem. A. 1997. V. 101. № 39. P. 7304; https://doi.org/10.1021/jp971472b

  4. Kay R.E., Walwick E.R., Gifford C.K. // J. Phys. Chem. 1964. V. 68. № 7. P. 1896; https://doi.org/10.1021/j100789a040

  5. Kay R.E., Walwick E.R., Gifford C.K. // J. Phys. Chem. 1964. V. 68. № 7. P. 1907; https://doi.org/10.1021/j100789a041

  6. Bean R.C., Shepherd W.C., Kay R.E., Walwick E.R. // Ibid. 1965. V. 69. № 12. P. 4368; https://doi.org/10.1021/j100782a050

  7. Kovalska V.B., Volkova K.D., Losytskyy M.Yu. et al. // Spectrochim. Acta, Part A. 2006. V. 65. № 2. C. 271; https://doi.org/10.1016/j.saa.2005.10.042

  8. Аниковский М.Ю., Татиколов А.С., Кузьмин В.А. // Химия высоких энергий. 2002. Т. 36. № 3. С. 207.

  9. Аниковский М.Ю., Татиколов А.С., Пронкин П.Г. и др. // Там же. 2003. Т. 37. № 6. С. 445.

  10. Пронкин П.Г., Татиколов А.С., Аниковский М.Ю., Кузьмин В.А. // Там же. 2005. Т. 39. № 4. С. 280.

  11. Пронкин П.Г., Татиколов А.С., Кузьмин В.А. // Там же. 2007. Т. 41. № 2. С. 129.

  12. Пронкин П.Г., Татиколов А.С., Скляренко В.И., Кузьмин В.А. // Там же. 2006. Т. 40. № 4. С. 295.

  13. Пронкин П.Г., Татиколов А.С., Скляренко В.И., Кузьмин В.А. // Там же. 2006. Т. 40. № 6. С. 451.

  14. Пронкин П.Г., Татиколов А.С. // Там же. 2009. Т. 43. № 6. С. 527.

  15. Пронкин П.Г., Татиколов А.С. // Там же. 2011. Т. 45. № 2. С. 169.

  16. Пронкин П.Г., Татиколов А.С. // Там же. 2012. Т. 46. № 2. С. 148.

  17. Акимкин Т.М., Татиколов А.С., Ярмолюк С.М. // Там же. 2011. Т. 45. № 3. С. 252.

  18. Пронкин П.Г., Татиколов А.С. // Там же. 2012. Т. 46. № 4. С. 301.

  19. Пронкин П.Г., Татиколов А.С. // Там же. 2015. Т. 49. № 5. С. 368; https://doi.org/10.7868/S0023119315050113

  20. Pronkin P.G., Tatikolov A.S. // Spectrochim. Acta, Part A. 2018. V. 202. P. 269; https://doi.org/10.1016/j.saa.2018.05.053

  21. Акимкин Т.М., Татиколов А.С., Панова И.Г., Ярмолюк С.М. // Химия высоких энергий. 2011. Т. 45. № 6. С. 553.

  22. Tatikolov A.S., Akimkin T.M., Panova I.G., Yarmoluk S.M. // Spectrochim. Acta, Part A. 2017. V. 177. P. 93; https://doi.org/10.1016/j.saa.2017.01.033

  23. Tatikolov A.S., Akimkin T.M., Pronkin P.G., Yarmoluk S.M. // Chem. Phys. Lett. 2013. V. 556. P. 287; https://doi.org/10.1016/j.cplett.2012.11.097

  24. Tatikolov A.S., Pronkin P.G., Panova I.G. // Spectrochim. Acta, Part A. 2019. V. 216. P. 190; https://doi.org/10.1016/j.saa.2019.03.017

  25. Татиколов А.С., Пронкин П.Г. // Журн. прикл. спектроскопии. 2018. Т. 85. № 6. С. 861.

  26. Tatikolov A.S., Costa S.M.B. // Biophys. Chem. 2004. V. 107. P. 33; https://doi.org/10.1016/S0301-4622(03)00218-7

  27. Татиколов А.С., Панова И.Г. // Химия высоких энергий. 2005. Т. 39. № 4. С. 275.

  28. Панова И.Г., Татиколов А.С. // ДАН. 2005. Т. 402. № 5. С. 709.

  29. Panova I.G., Sharova N.P., Dmitrieva S.B. et al. // Anal. Biochem. 2007. V. 361. P. 183; https://doi.org/10.1016/j.ab.2006.11.029

  30. Панова И.Г., Татиколов А.С., Сухих Г.Т. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2007. Т. 144. № 11. С. 522.

  31. Panova I.G., Tatikolov A.S. // Proc. SPIE. 2009. V. 7163. P. 71631O; https://doi.org/10.1117/12.808400

  32. Панова И.Г., Татиколов А.С. // Изв. РАН. Сер. биол. 2011. № 2. С. 235.

  33. Panova I.G., Sharova N.P., Dmitrieva S.B., et al. // Comp. Biochem. Physiol., Part A. 2008. V. 151. P. 676; https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2008.08.020

  34. Panova I.G., Tatikolov A.S., Sharova N.P. // Proc. SPIE. 2010. V. 7550. P. 75501W; https://doi.org/10.1117/12.841128

  35. Пронкин П.Г., Бычкова А.В., Сорокина О.Н. и др. // Химия высоких энергий. 2013. Т. 47. № 5. С. 400; https://doi.org/10.7868/S0023119713050116

  36. Бычкова А.В., Пронкин П.Г., Сорокина О.Н. и др. // Коллоид. журн. 2014. Т. 76. № 4. С. 420; https://doi.org/10.7868/S002329121404003X

  37. Татиколов А.С., Акимкин Т.М., Кашин А.С., Панова И.Г. // Химия высоких энергий. 2010. Т. 44. № 3. С. 252.

  38. Татиколов А.С., Панова И.Г. // Там же. 2014. Т. 48. № 2. С. 116.

  39. Пронкин П.Г., Татиколов А.С. // Журн. прикл. спектроскопии. 2015. Т. 82. № 3. С. 429.

  40. Пронкин П.Г., Татиколов А.С. // Там же. 2016. Т. 83. № 6. С. 884.

  41. Пронкин П.Г., Татиколов А.С. // Там же. 2017. Т. 84. № 2. С. 192.

  42. Горобец М.Г., Вассерман Л.А., Васильева А.Д. и др. // ДАН. 2017. Т. 474. № 6. С. 751.

  43. Кашин А.С., Татиколов А.С. // Химия высоких энергий. 2009. Т. 43. № 6. С. 536.

  44. Шведова Л.А., Татиколов А.С., Пронкин П.Г., Панова И.Г. // Актуальные вопросы биологической физики и химии. 2018. Т. 3. № 1. С. 168.

  45. Шведова Л.А., Татиколов А.С., Пронкин П.Г., Панова И.Г. Приоритетные направления развития науки и образования (монография). Глава 16. Анионные мезо-замещенные карбоцианиновые красители в качестве спектрально-флуоресцентных зондов на альбумин in vitro. Пенза: МЦНС “Наука и просвещение”, 2018. С. 146.

  46. Пронкин П.Г., Сорокина О.Н., Бычкова А.В. и др. // Химия высоких энергий. 2015. Т. 49. № 1. С. 26.

  47. Tatikolov A.S., Costa S.M.B. // Photochem. Photobiol. 2004. V. 80. P. 250; https://doi.org/10.1111/j.1751-1097.2004.tb00079.x

Дополнительные материалы отсутствуют.