Химическая физика, 2020, T. 39, № 1, стр. 52-56

ВВЕДЕНИЕ

Класс полиоксометаллатов (ПОМ), к которому относятся и гетерополикислоты (ГПК) с комплексообразующими атомами (P, Si, Al и др.) – неисчерпаемое множество наноразмерных структур, физические и химические свойства которых, в зависимости от состава и архитектуры, варьируются в широких пределах и допускают тонкую подборку [1, 2]. Давно известные как эффективные катализаторы, сегодня ПОМ активно изучаются как новые, возможно, наиболее перспективные наноматериалы ХХI-го века [3]. Область известных и планируемых применений ПОМ охватывает все направления нанотехнологий, включая нанобиологию и наномедицину.

Открытия в 70–90-х годах высокой антивирусной, противоопухолевой и антибактериальной активности ПОМ [4] стимулировали интенсивные исследования, нацеленные на создание новых лекарственных препаратов, дешевых и эффективных, необходимых для борьбы со многими заболеваниями нашего времени и прежде всего с раком и СПИДом. На разных уровнях (in vitro и in vivo) к началу “нулевых” годов уже было продемонстрировано общее важное свойство ПОМ – способность этих препаратов эффективно подавлять активность вирусов и разрушать патологические клетки. Одновременно стали ясны принципиальные недостатки ПОМ – высокая токсичность в отношении здоровых клеток и сложность в подборе ПОМ-соединения в каждом конкретном случае его применения как малотоксичного и, в то же время, эффективного лекарственного средства направленного терапевтического действия.

В последние десятилетия поиски малотоксичных, биологически активных ПОМ ориентируются в основном на многокомпонентные соединения, неорганические [5] или композитные, органо-неорганические [6]. Эти поиски подобны тем, что ранее велись для металлооксидов, свойства которых зависят от степени их совершенства, т.е. природы и количества различных точечных дефектов [7]. Известно, что все свойства ПОМ-соединений зависят от их молекулярных параметров и характеристик, таких как ионные размеры, форма, анионные заряды, редокс-потенциалы и др. Природа этих зависимостей, т.е. микроскопические механизмы физических и биохимических процессов, идущих при взаимодействиях ПОМ с клетками, нуждается в тщательном изучении. Цель настоящего сообщения – исследовать и объяснить возможный механизм влияния заряда анионов ПОМ на их биологические свойства на примере взаимодействия ГПК Кеггина с клетками фибробластов эмбриона человека (ФЭЧ).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В экспериментах, результаты которых приводятся ниже, были использованы стерильные водные сантимолярные растворы ГПК Кеггина (H₃PW₁₂O₄₀, H₃PMo₁₂O₄₀, H₄SiW₁₂O₄₀, H₄SiMo₁₂O₄₀) фирмы “Biochem”(Франция), а также их ванадий-замещенные аналоги (№ 1 – Н₄PMo₁₁VO₄₀, № 2 – Н₅PMo₁₀V₂O₄₀, № 3 – Н₄PMo₁₁${\text{VO}}_{{40}}^{*},$ синтезированные в Институте общей и неорганической химии НАН Беларуси. Тестирование биологических свойств (цитотоксичности и иммуномодулирующей активности) осуществляли на перевиваемых линиях клеток фибробластов эмбриона человека (ФЭЧ), которые были получены из коллекции культур клеток “ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи” МЗ РФ. Во всех экспериментах клетки первоначально культивировали в течение 24 ч (37 °С, 5% CO₂) в питательных средах Игла ДМЕМ (“Биолот”, Санкт-Петербург, Россия) с добавлением 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (Gibco/Life Technologies, США). Исследовали влияние химического состава ГПК на жизнеспособность клеток ФЭЧ (их пролиферацию и гибель) и клеточный иммунитет.

Для качественной оценки цитотоксичности и визуализации процесса гибели клеток использовали метод прижизненной окраски клеточных материалов бромистым этидием, EtBr. Молекулы этого интеркалирующего агента способны проникать лишь в клетки с поврежденной цитоплазматической мембраной. Проникая в объем, EtBr образует комплекс с ДНК, который флюоресцирует в красной области спектра, тем самым позволяя регистрировать погибшие клетки.

В экспериментах по изучению гибели клеток под действием ГПК использовали следующий протокол. В 6-луночную панель с покровным стеклом вносили культуральную среду (КС) с 10%-ной ЭТС, содержавшей ФЭЧ в концентрации 200 тыс. клеток/мл. Спустя 24 ч после начала инкубации(37 °С, 5% CO₂) в лунки вносили водные растворы ГПК различных концентраций. Бромистый этидий, необходимый для оценки количества погибших клеток, вносили в лунки одновременно с ГПК в конечной концентрации 1 мкг/мл.

Для количественных оценок цитотоксичности ГПК применяли МТТ–тестирование [8]. Стандартный метод МТТ-теста основан на способности митохондриальных и цитоплазматических дегидрогеназ живых, метаболически активных клеток восстанавливать бесцветный водорастворимый МТТ-реагент до голубого формазана, кристаллизующегося внутри клеток. Кристаллы формазана переводят в раствор с помощью органического растворителя диметилсульфоксида (ДМСО) с последующей спектрофотометрией. Таким образом, восстановленный клетками МТТ-реагент является показателем жизнеспособности клеток в изучаемой культуре, что позволяет количественно оценить гибель клеток под воздействием тестируемой ГПК.

В наших экспериментах применяли следующий протокол. Зрелые клетки ФЭЧ переносили на 96-луночную панель фирмы “Costar” (США) в концентрации 200 тыс. клеток/мл в каждую лунку в объеме 100 мкл среды с 10%-ной ЭТС и помещали в СО₂-инкубатор при 37 °С. Через 24 ч после посадки клеток в лунки вносили по 100 мкл раствора изучаемого препарата в заданных разведениях. Контролем служили интактные клетки, культивируемые параллельно с опытными. После инкубации клеток в КС с выбранной ГПК культуральную среду отсасывали из лунок, добавляли по 100 мкл среды с 20 мкл МТТ (3[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2.5-дифенилтетразолия, “Sigma”) в исходной концентрации 5 мг/мл и инкубировали в течение 4 ч. Затем среду с МТТ удаляли и добавляли по 100 мкл ДМСО для растворения образовавшихся кристаллов формазана. Осадок клеток ресуспендировали в течение 5 мин пипетированием. Жизнеспособность клеток оценивали по интенсивности окраски раствора, измеряя оптическую плотность в каждой лунке при длине волны 545 нм фотометра Immunochem 2100 (США). Каждую концентрацию выполняли в трех повторах. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программного обеспечения MS Excel, “Statistica 6.0”. Достоверность различия средних величин устанавливали с помощью t-критерия Стьюдента при уровне значимости р < 0.05.

Вместе с цитотоксичностью в работе изучали также иммунный отклик клеток на действие ГПК. В работе [9] было показано, что, стимулируя экспрессию генов цитокинов, ГПК могут влиять на клеточный иммунитет. Оценка этого влияния важна для поисков оптимальных вариантов применения ПОМ-препаратов для лечения инфекционных и неврологических заболеваний. Для решения вопроса о возможной роли анионных зарядов мы поставили новые эксперименты с применением ванадий-замещенных ГПК с повышенными значениями анионных зарядов. Методами обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ–ПЦР) с использованием для детекции результатов маркера J1758 фирмы “Promega” (США) в этих экспериментах наблюдали ПОМ-стимулированную экспрессию генов интерлейкинов, фактора некроза опухолей и интерферонов. Полученные результаты (в сравнении с известными для других ГПК [9]) приводятся в табл. 1 и 2.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оценивая всю совокупность результатов, приведенных на рис. 1 и в табл. 1–4, можно прийти к выводу о весьма сильной зависимости цитотоксичности ГПК от анионного заряда, m (см. табл. 1 и 2, которые наглядно демонстрируют, что с ростом m токсичность быстро увеличивается). Из данных табл. 3 и 4 следует вывод о слабой, в наших экспериментах не выявленной, зарядовой зависимости иммуномодулирующей активности тестировавшихся соединений (см. табл. 3 и 4). Иммуномодулирующие свойства ГПК, в отличие от их токсичности, оказываются зависящими от элементного состава этих соединений. К такому выводу можно прийти, сравнивая данные, приведенные в табл. 3 и 4.

Рис. 1.

Флюоресценция поврежденных клеток ФЭЧ после их инкубации с ГПК H₄SiMo₁₂O₄₀: а – через 20 мин, б – через 40 мин, в – через 1 ч.

Оценивая цитотоксичность ГПК в целом, видно, что умеренно токсичная кремнемолибденовая кислота (m = 4) оказывает заметное воздействие на клетки. Из рис. 1в, видно, что уже спустя 2 ч после сокультивирования клеток ФЭЧ в питательном растворе, содержавшим H₄SiMo₁₂O₄₀, в ансамбле клеток происходит лизис, свидетельствующий об их полной гибели. (Первые признаки токсического воздействия H₄SiMo₁₂O₄₀ – единичные повреждения клеточных ДНК – становятся заметными спустя 10–20 мин после начала действия этой кислоты (см. рис. 1б)).

Обсудим теперь природу обнаруженной зарядовой зависимости цитотоксичности ГПК по отношению к клеткам ФЭЧ. Согласно современным представлениям воздействие ПОМ на живые клетки может быть связано с локальными нарушениями функциональных возможностей различных клеточных структур, которые оказываются в роли поражаемых биологических мишеней (в качестве примера см. рис. 13 из работы [10]).

Во многих случаях цитотоксичность препаратов, например, цисплатина [11], находит объяснение в предположении об образовании этими препаратами связанных с ДНК достаточно прочных комплексов. Последние сшивают звенья ДНК и затрудняют (или исключают) акты репликации, что неизбежно приводит к гибели клетки. Ясно, что с ростом заряда аниона прочность ДНК–ГПК комплексов и, соответственно, эффективность механизма “сшивки”, должны возрастать, что и наблюдается на опыте (см. табл. 1 и 2). Это также следует из результатов работы [12], в которой изучался механизм воздействия на раковые клетки ванадий-содержащих солей ГПК Кеггина. Среди последних максимально эффективными оказались соединения с наибольшими зарядами анионов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Отметим в заключение, что процесс взаимодействия многозарядного аниона с ДНК, возможно, основной, но не единственный этап в цепочке физико-химических, зарядово-зависимых процессов, которыми определяется цитотоксичность ПОМ. Можно указать, по крайней мере, еще два процесса, каждый из которых тем более вероятен, чем больше анионный заряд. Первый – прохождение анионом мембраны клетки, чья скорость зависит от заряда и повышается с его увеличением (см. работу [13]). Второй – этап перемещения высокозарядного аниона от места прохождения мембраны до ДНК, вероятность которого зависит от гидролитической стабильности аниона [14], которая зависит от валентности гетероатома, влияющей на анионный заряд.

Работа выполнена в рамках государственного задания по теме “Фундаментальные основы создания наноструктурированных систем нового поколения с уникальными эксплуатационными электрическими и магнитными свойствами” № 0082-2018-0003 (рег. номер АААА-А18-118012390045-2) и при финансовой поддержке Российским фондом фундаментальных исследований (грант № 18-54-00004 Бел_а) и Белорусским фондом фундаментальных исследований (договор № Х18Р-110).