Химическая физика, 2020, T. 39, № 2, стр. 42-49

ВВЕДЕНИЕ

Ранее [1] нами были проанализированы результаты анализа химического загрязнения объектов окружающей среды Жиздринского и Ульяновского районов Калужской области, которые оказались в числе наиболее пострадавших в результате аварии на ЧАЭС в 1986 году. В населенных пунктах этих районов было проведено два цикла натурных исследований – в осеннюю межень и в весеннее половодье.

Параллельно с химическими анализами в ходе полевых исследований был проведен анализ токсических характеристик отобранных проб воды водных объектов и почвенных вытяжек, результаты которого и являются предметом данной статьи. Особое внимание было уделено проявлению генотоксических эффектов, как наиболее характерных при радиационном загрязнении территории.

Для получения объективной оценки мутагенной и канцерогенной опасности загрязнения окружающей среды токсикологические исследования проведены с учетом рекомендаций ВОЗ [2], включая обязательное использование батареи тестов для первичного скрининга: тест Эймса на индукцию мутаций у бактерий и исследование хромосомных нарушений в перевиваемых культурах клеток млекопитающих в краткосрочном тесте (in vitro). Для получения более значимой доказательной базы результатов тестирования, наряду с цитогенетическими, использовали также и другие (традиционные) методы биотестирования.

Цель данной работы – выявление наиболее значимых токсикологических последствий сочетанного действия факторов химического и радиационного загрязнения территорий.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Токсикологические исследования на мутагенную активность проб воды были проведены двумя независимыми группами специалистов из Медицинского радиологического научного центра РАМН и НПО “Тайфун”. Статистический анализ показал удовлетворительную сходимость для 95%-ной доверительной вероятности результатов определения мутагенной активности одних и тех же нативных проб подземных и поверхностных вод, полученных разными группами специалистов при использовании нескольких тест-объектов, включая перевиваемую клеточную тест-культуру китайского хомячка ((КХ), клоны 237 и СНО).

Для сравнительного анализа чувствительности и информативности метода определения мутагенной активности проб воды в качестве базового использовали тест Эймса (сальмонелла/микросомы) [3]. Процедура тестирования генотоксичности с помощью клеточной культуры млекопитающих (китайский хомячок) и мутагенной активности в бактериальном тесте Эймса осуществлялась сразу же после доставки проб в лабораторию. Длительность периода между отбором проб воды и их анализом на мутагенную активность составляла от 10 до 20 ч. Методы определения мутагенной активности проб воды с использованием в качестве тест-объекта культуры клеток КХ подробно изложены в работах [4, 5]. Соблюдались единые условия тестирования: выдерживание тест-объекта в тестируемой среде в течение 2 ч с последующей фиксацией эффекта воздействия через 10 ч [6]. В качестве контрольных растворов использовали физиологический раствор и питательную среду.

Для определения мутагенной активности содержащихся в водной среде органических веществ последние экстрагировали смесью растворителей гексана и диэтилового эфира в соотношении 1 : 1. Полученные сухие остатки хранили в холодильнике.

Непосредственно перед опытами экстракты растворяли в 1 см³ метанола (СН₃ОН) на водяной бане при температуре 50 °С в течение 10 мин. Затем компенсировали испарившийся метанол, доводя конечный объем метанольного раствора до 1 см³. Для последующего тестирования из этого раствора микродозатором отбирали две аликвоты объемом 0.050 см³. В качестве тест-объекта использовали клетки КХ линии 237. В тестируемой среде подготовленную клеточную культуру экспонировали в течение 2 ч с последующей фиксацией через 14 ч, учитывая возможную задержку деления клеток. Для получения достоверного эффекта использовали четыре контрольных раствора: питательную среду Игла, физиологический раствор (ФР) без добавок и с добавками 0.05 см³ метилового спирта или 0.08 см³ метаболической смеси на 5 см³ общего объема тестируемой смеси.

Из традиционных методов биотестирования (in vitro), которые в настоящее время широко применяются на практике при оценке токсичности сточных вод, в работе использовались:

– изменение интенсивности биолюминесценции светящихся бактерий Benekea harvei под воздействием токсических веществ, присутствующих в анализируемой пробе по сравнению с контролем. Количественная оценка параметра тест-реакции выражается в виде индекса токсичности Т, равного процентному отношению 100(I₀ – I)/I₀, где I₀ и I – интенсивность биолюминесценции бактерий в контроле и в опыте соответственно. Токсическое действие исследуемой пробы определяется за 5‑минутный (экспрессный вариант) и/или 30-минутный периоды экспозиции. Значение Т < 20% считается допустимым (анализируемая проба нетоксична), Т ≥ 20% – образец токсичен, при Т ≥ 50% – сильно токсичен. При активации процессов, сопровождающихся биолюминесценцией бактерий, индекс Т является отрицательной величиной. Считается, что анализируемая проба токсична и при индукции свечения, т.е. при абсолютных значениях Т ≥ 10% [7], однако в этом случае рекомендуется подтверждить токсичность пробы другими методами биотестирования;

– прирост клеток инфузорий Tetrahymena pyriformis через 24 ч после начала инкубации. Вывод о наличии или отсутствии токсичности пробы воды делается на основании достоверного отличия коэффициента прироста инфузорий, K_Т. р, в опыте по сравнению с контролем. Критерий достоверности (t_d) сравнивают со значением критерия Стьюдента (t_st), который для нашего случая (трех параллельных определений) был равен 2.78. Если t_d ≥ t_st, то анализируемая проба считается токсичной [8];

– количество выметанной молоди в трех поколениях рачков Ceriodaphnia dubia (хроническая токсичность, K_С.d) [9].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Методы биотестирования in vitro, в том числе с использованием клеточных культур млекопитающих и бактериальной тест-системы Эймса, служат интегральным индикатором токсического воздействия на живые организмы всей совокупности содержащихся в анализируемом образце воды загрязняющих веществ или скрытых факторов токсического воздействия (например, нерегистрируемых токсикантов или радионуклидов). С применением методов биотестирования можно не только оценить токсикологическую опасность водной среды, но и выявить источник (причину) возникновения токсичности, а также выбрать наиболее эффективные способы защиты водных экосистем от негативных антропогенных воздействий [10–12] с использованием, в частности, математических методов на основе современных программ моделирования химических и биологических процессов в окружающей среде в рамках кинетического подхода [13, 14].

В табл. 1 представлены результаты анализа генотоксичности проб речных вод Жиздринского района. Из приведенных данных следует, что генотоксичность нативных проб поверхностных вод достоверно выше контрольного уровня.

Результаты анализа генотоксичности подземных вод, отобранных в населенных пунктах Жиздринского и Ульяновского районов, представлены в табл. 2, 3. Из представленных данных следует, что достоверный цитогенетический эффект обнаружен при воздействии на клетки КХ клона СНО нативных проб воды, отобранных из питьевых источников в поселках Кцынь, Ульяново, Судимир, Жиздра, Мужитино.

В табл. 4 приведены данные по генотоксичности почвенных вытяжек и органических экстрактов из проб почв. Видно, что метод in vitro, основанный на анализе частоты индуцированных аберраций хромосом в клетках КХ, позволяет оценивать мутагенную активность вытяжек без их дополнительной обработки.

Результаты проведенных цитотоксикологических исследований с использованием тестов in vitro объективно отражают потенциальную мутагенную опасность состояния окружающей среды в районах, подверженных сочетанному действию факторов радиационного и химического загрязнения местности.

Сравнительные результаты биотестирования мутагенной активности одних и тех же проб воды с использованием теста Эймса и теста по числу аберраций в клетках КХ приведены в табл. 5. В тесте Эймса, наряду со штаммами сальмонеллы ТА 98 и ТА 100 [5], был использован штамм ТА 97 (мутация hisD6610), который является более чувствительным к мутагенному воздействию агентов, индуцирующих мутации типа сдвига рамки считывания по сравнению с мутацией hisD3052 штамма ТА 98 [15]. В настоящее время штаммы ТА 97, ТА 98 и ТА 100 наиболее часто используются в России в системе контроля природных и сточных вод на мутагенную активность.

Из данных, приведенных в табл. 5, следует, что большинство проб воды из источников питьевого водоснабжения обладали острой токсичностью (гибель) по отношению ко всем трем штаммам сальмонеллы, что свидетельствует о наличии в этих пробах факторов токсичности в отношении сальмонеллы. Не исключено, что токсичность может быть связана с присутствием в анализируемых пробах воды микроколлоидальных частиц смешанно-валентного марганца Mn(III,IV) [1]. Эффект острой токсичности по отношению к сальмонелле исчезал при добавке системы метаболической активации, что может быть связано с детоксикацией Mn(III,IV) компонентами S9-фракции печени крыс, используемой в системе метаболической активации теста Эймса. В пробах воды, отобранных в реках Жиздра и Рессета, наблюдался эффект мутагенной активности, качественно коррелирующий с повышенным числом хромосомных аберраций в клетках КХ в тех же пробах.

Как правило, при оценке потенциальной токсичности природных вод основное внимание уделяется содержанию малорастворимых в воде веществ, извлекаемых из воды с помощью органических растворителей. Для оценки вклада таких веществ в генотоксичность нативных проб воды нами была изучена токсичность содержащихся в пробах воды эфирорастворимых веществ (ЭРВ).

Результаты тестирования органических экстрактов представлены в табл. 6. Видно, что содержащиеся в анализируемых пробах воды ЭРВ, будучи сконцентрированными в процессе экстракции в 100 раз, проявляют заметную мутагенную активность и без дополнительной активации. Добавки в тестируемые водные растворы системы метаболической активации на основе S9-фракции привели к возрастанию числа индуцированных аберраций хромосом в клеточной тест-культуре КХ. Это свидетельствует о том, что в изученных пробах питьевой воды содержится значительное количество проканцерогенных малорастворимых в воде органических веществ. При этом мутагенная активность органического экстракта в относительных единицах проявилась в наиболее выраженном виде в пробе питьевой воды, отобранной из колодца в поселке Зикеево Жиздринского района.

Результаты тестирования проб поверхностных и подземных вод с применением традиционных методов биотестирования приведены в табл. 7. В пробах речных вод (Жиздра и Рессета) токсический эффект по изменению активности люциферазы светящихся бактерий наблюдается как при воздействии на клеточную мембрану (5 мин), так и при включении в клеточный метаболизм (30 мин). В отношении репродуктивной функции цериодафний по количеству выметанной молоди в трех поколениях отмечена хроническая токсичность. Пробы воды из подземных источников, отобранных с разных водоносных горизонтов, вызывают гибель обоих видов дафний. На ростовую функцию инфузорий (коэффициент прироста клеток в опыте по отношению к контролю через 24 ч после начала инкубации) оказали токсическое влияние пробы питьевой воды из поселков Жиздра, Дудоровский и Кцынь.

При сравнении показателей токсичности со значениями контролируемых гидрохимических показателей [1] обнаруживается лишь качественная корреляция. Так, наблюдаемая в пробе воды поселка Дудоровский токсичность в отношении инфузорий коррелирует с максимальным уровнем радиоактивного загрязнения (6.88 Ku/км²), заметная токсичность пробы вод из колонки поселка Жиздра коррелирует с максимальным содержанием в воде ионов железа (3.02 мг/л), а вода из колодца Кцыни, характеризующаяся наибольшим содержанием нитрит-ионов (0.057 мг N/л) при их содержании в других пробах не более 0.007 мг N/л, проявляет токсичность в отношении бактерий и инфузорий.

В отношении светящихся бактерий, помимо пробы воды из колодца Кцыни, токсичными оказались пробы воды, взятые в поселках Судимир, Зикеево и Мужитино; при этом в пробах воды из колодцев Зикеево и Мужитино вода характеризуется наибольшим содержанием нитрат-ионов (17.3–20.8 мг N/л), а вода поселка Судимир содержит наибольшее количество бенз(а)пирена (9.4 нг/л). Следует отметить, что тест на светящихся бактериях как информативный и наиболее экспрессный инструментальный метод биотестирования успешно внедряется в практику токсикологического контроля питьевых вод в России [16].

Приведенные примеры лишний раз свидетельствуют о том, что методы биотестирования дают более адекватную, интегральную оценку качества водной среды без привязки к отдельным гидрохимическим показателям.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты токсикологического обследования речных вод и подземных источников питьевого водоснабжения населенных пунктов Ульяновского и Жиздринского районов Калужской области, в наибольшей степени пострадавших в результате аварии на ЧАЭС, выявили значительную генотоксичность проб воды, качественно коррелирующую с токсичностью, измеряемой традиционными методами биотестирования. В то же время корреляции с уровнем химического загрязнения, характеризуемым “стандартным” набором гидрохимических показателей, не выявлено. Наблюдаемое расхождение в показателях качества, определяемых методами химического контроля, с фактическим уровнем токсического воздействия воды в отношении тест-организмов и модельных тест-систем лишний раз отражает неадекватность действующих систем санитарно-гигиенического и экологического мониторинга водных объектов, основанных исключительно на инструментальных методах контроля относительно узкого набора так называемых “приоритетных” загрязняющих веществ.

Немаловажное значение в формировании токсических свойств водных объектов изученных в данной работе регионов имеет, по нашему убеждению, сочетание химического загрязнения с радиационным воздействием, сохраняющимся в регионе после чернобыльской аварии. Основными долгоживущими радиоизотопами – загрязнителями водной среды днепровских водохранилищ после аварии на ЧАЭС были цезий-137 и стронций-90, характеризующиеся периодом полураспада, равным 28–30 лет. Среди долгоживущих изотопов, выбросы которых также имели место при аварии на ЧАЭС, существенный вклад в загрязнение окружающей среды вносят изотопы плутония, в частности источник альфа-излучения – плутоний-239 с периодом полураспада, равным 24 тысячи, лет и источник бета-излучения – плутоний-241 (Т_1/2 = 14.4 лет), при распаде которого в районах радиационного загрязнения со временем происходит накопление другого источника бета-излучения – изотопа амерция-241 с периодом полураспада, равным 433 года. Со временем, в результате радиоактивного распада плутония-241, загрязнение среды изотопом амерция-241 в местах выпадения аэрозольных осадков, содержащих изотопы плутония, будет превалировать значение.

О том, что “скрытое” (неконтролируемое обычными методами радиационного контроля) загрязнение среды изотопами радионуклидов, являющихся источниками альфа- и бета-излучения, может играть существенную роль в формировании токсических свойств природной водной среды, свидетельствуют, в частности, результаты, полученные нами в ходе исследований, проведенных в 1986–1989 годах на Киевском, Каневском, Кременчугском и других днепровских водохранилищах [17]. Выяснилось, что существенного воздействия на гидрохимический режим водохранилищ авария на ЧАЭС не оказала (если не считать дополнительного загрязнения среды аэрозольными выбросами тяжелых металлов, особенно свинца, и в меньшей степени марганца, цинка, меди, хрома). В то же время в первые месяцы после аварии в воде Киевского водохранилища, а в последующие годы – и в других водохранилищах нами была зарегистрирована значительная интенсификация процессов с участием ОН-радикалов. Скорость образования ОН-радикалов в результате радиационного воздействия, измеренная по скорости обесцвечивания красителя пара-нитрозодиметиланилина, широко используемого в радиационно-химических измерениях, составляла в толще днепровской воды в среднем 3 ∙ 10^–11 моль/л ∙ с [17]. Скорость процесса образования ОН-радикалов возрастала в присутствии взвеси донных отложений и уменьшалась при центрифугировании образцов воды. Это означает, что ОН-радикалы образуются в водной фазе, но при участии взвешенных частиц, сорбировавших радиоактивные загрязнения.

В отличие от предшествующих годов (1983–1985 гг.), когда в воде Киевского водохранилища на фоне доминирования в альгоценозе сине-зеленых водорослей регистрировались вещества восстановительной природы, эффективно взаимодействующие с пероксидом водорода [18], после аварии во всех обследованных в июне–июле 1986 года точках водохранилища в воде регистрировался пероксид водорода, причем при продвижении по водохранилищу в сторону Припятского отрога концентрация Н₂О₂ закономерно увеличивалась (до 10^–6 моль/л), что свидетельствует о вкладе радиационно-химических процессов в образование не только ОН-радикала, но и Н₂О₂. Появление в воде пероксида водорода привело к утрате сине-зелеными водорослями доминирующего положения в альгоценозе – биомасса их уменьшилась с 31.2–53.08 до 0.6 г/м³ [17].

Радиационный выход Н₂О₂ в пробах воды р. Днепр, измеренный нами с помощью гамма-радиационной установки Института физической химии АН Украины, оказался близким к единице (как и в дистиллированной воде). Зная радиационный выход, усредненную по анализируемому объему воды Киевского водохранилища мощность дозы радиации мы оценили равной порядка 100 рад/ч. В то же время уровень гамма-радиоактивности донных отложений и водной толщи Киевского водохранилища в мае-июне 1986 года не превышал 1 рад/ч. По результатам натурных измерений мы пришли к выводу, что основной вклад в инициирование ОН-радикалов вносят неконтролируемые (скрытые) источники альфа- и бета-излучения.

В результате радиационного воздействия, наряду с пероксидом водорода, нами в 1986–1988 гг. в воде днепровских водохранилищ были обнаружены вещества (до 8 ∙ 10^–6 г-экв/л), сорбированные мелкодисперсными (порядка 1 мкм) фракциями взвешенных частиц и обладающие сильно выраженными окислительными свойствами, причем при высоких концентрациях окислителя пероксид водорода в воде не регистрировался. По аналогии с наблюдавшимися ранее “сверх-окислителями” в Кучурганском водохранилище [5] можно прийти к выводу, что носителями “сверхокислительных” эквивалентов являются микроколлоидальные частицы смешанно-валентного марганца(III,IV).

В проведенных в данной работе токсикологических исследованиях наиболее информативным оказался метод биотестирования, основанный на оценке генотоксичности образцов воды по индукции хромосомных аберраций в клетках китайского хомячка (in vitro). Цитогенетические методы контроля широко распространены при работе с источниками радиоактивных излучений. Наличие хромосомных нарушений в данном тесте служит косвенным свидетельством того, что основной вклад в генотоксичность изученных проб воды из поверхностных и подземных вод на территориях, подверженных радиационному загрязнению, вносят “скрытые” источники радиационного воздействия, низкого по интенсивности, но приводящего к образованию ионов металлов, в частности ионов марганца в сверхокисленном состоянии, которые служат своего рода “носителями” ОН-радикалов. Таким образом, метод оценки генотоксичности проб воды может быть рекомендован для использования в системе санитарно-экологического контроля качества воды природных водных объектов.

Работа выполнена в рамках Программы фундаментальных исследований ИХФ РАН № 46.15 государственного задания № 0082-2014-0005 (номер государственной регистрации ЦИТИС: АААА-А17-117091220076-4).