Химическая физика, 2020, T. 39, № 5, стр. 51-58

Противоопухолевые свойства и механизм взаимодействия антиоксиданта 2-(карбокси)-2-(N-ацетиламино)-3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)пропионата натрия с пептидами в водной среде по данным расчета методами квантовой химии

А. А. Володькин 1*, В. Н. Ерохин 1, Е. М. Миль 1, А. А. Албантова 1, В. И. Бинюков 1

1 Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук
Москва, Россия

* E-mail: AlVolodkin@yandex.ru

Поступила в редакцию 10.09.2018
После доработки 11.11.2019
Принята к публикации 20.11.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

Противоопухолевые свойства антиоксиданта-2-(карбокси)-2-(N-ацетиламино)-3-(3,5ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)пропионата натрия изучались на асцитной опухоли – саркоме 37 и на солидной опухоли – карциноме Льюис. Обнаружено полное торможение саркомы 37 при внутрибрюшинном введении препарата и усиление апоптоза (снижение уровня антиапоптозного белка Bcl-2) в клетках карциномы Льюис. Квантовохимическим методом осуществлен расчет структуры комплексов 2-(карбокси)-2-(N-ацетиламино)-3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)пропионата натрия с пептидами. Получены количественные данные, характеризующие внутри- и межмолекулярные взаимодействия вышеуказанных компонентов в наноассоциатах.

Ключевые слова: саркома 37, карцинома Льюис, белок Bcl-2, апоптоз, молекулярное моделирование, квантовая химия, наноассоциаты, энтропия, энтальпия, пептид, антиоксидант.

ВВЕДЕНИЕ

Компьютерный дизайн становится важнейшей составляющей процесса рациональной разработки новых лекарственных препаратов [1] и новым инструментом исследований в молекулярной биологии и фармацевтике. Компьютерное моделирование имеет значение при исследовании таких проблем, как возникновение генетического кода [2], и рассматривается в качестве пути к управлению биохимическими процессами [3]. Описание механизмов трансформации молекул пептидов и белков – одна из неотложных задач молекулярной биоинженерии [4]. Одним из подходов в разработке нового лекарственного препарата является поиск веществ, способных связываться с выбранным белком-мишенью и блокировать пролиферацию клеток.

При построении квантовохимической модели этого взаимодействия возникает задача поиска глобального минимума энергии системы, заданной в многомерном пространстве. Несмотря на полуэмпирический характер программ серии NDDO, последние имеют преимущества перед программами ab initio вследствие существенно более высокой скорости и в настоящее время используются в практике расчетов биологических объектов [5]. Наиболее содержательно этот вид вычислительных программ оформлен в пакете программ MOPAC [68].

Цель настоящей работы – продолжение исследований биологических свойств антиоксиданта 2-карбокси-2-(N-ацетиламино)-3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)пропионата натрия (соединение 1) [9] – противоопухолевого препарата [10]. Это соединение образует кристаллогидраты, а в водной среде – ассоциаты [11]. По расчетным данным антиокислительная активность, свободная энергия и энтропия ассоциата зависит от его структуры. Это соединение обладает широким спектром биологической активности и исследовано при некрозе вследствие термического ожога у животных [10], в условиях стресса [12, 13], а также при воздействии на эритроциты [14]. В этих случаях соединение 1 проявило высокую активность в качестве антиоксиданта. Однако строение этого соединения предполагает возможность его участия во взаимодействии с пептидами по иному механизму – с участием атома натрия. Такой подход для понимания взаимодействия белков и пептидов с соединением 1 является перспективным, что определяет актуальность исследования в целом.

В настоящей работе квантовохимическим методом осуществлен расчет структур камплексов соединения 1 с молекулами ряда пептидов и Н2О и установлено строение этих комплексов, а также найдены изменения свободной энергии и энтальпии при их образовании. Указанные термодинамические функции являются физическими критериями реакционной способности соединения 1 по отношению к биологическим объектам, и такой подход в поиске биологически активных соединений уже применялся ранее [5]. Поэтому исследования роли молекул воды в образовании водородных связей с молекулами пептидов и соединения 1 актуальны, так как участие воды в биологической жизни очевидно.

В экспериментах на мышах с саркомой 37 показано, что препарат количественно подавляет развитие опухоли. При исследовании апоптоза опухолевых клеток карциномы Льюис установлено снижение содержания антиапоптозных белков, что приводит к гибели опухолевых клеток путем апоптоза. Расчет структуры комплексов соединения 1 апоптозным пептидом Mcl-1 из домена ВН3 белка Bcl-2 [15] указывает на увеличение свободной энергии, т.е. исследуемое соединение изменяет свойства этого пептида.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Квантово-химические расчеты

Метод PM7 является последним по времени создания в семействе методов NDDO [5, 8]. В нем улучшено описание дисперсионных взаимодействий, а также образования водородных связей за счет введения на стадии параметризации поправок, аналогичных использованным в методе функционала плотности DFT (density functional theory). Эти поправки в методе PM7 включаются в расчет на стадии параметризации, для которой были использованы экспериментальные и высокоуровневые ab initio данные для ранее известных соединений (подробнее см. в [5]).

Расчет многокомпонентных систем, состоящих из двух соединений, взаимодействующих в водной среде, накладывает определенные условия на создание файла с исходными данными. Исходные начальные конфигурации рассматриваемых молекулярных систем описаны в работе [11]. Первую структуру Н2О в исходном файле фиксировали путем создания строки в комбинации ННО–Na. Последующие структуры Н2О фиксировали путем создания строк в комбинациях ННО–[ННО]m–ННО–Na. Координаты молекул Н2О в окружении структуры соединения 1 программа находила по минимуму энергии образования. При моделировании исходных данных молекул пептидов атом Нn, где n есть n–1, n–3, n–4, – соответствующие координаты в структуре молекулы из комбинации НnНО–[ННО]m–ННО–Na заменяли на атом Н карбоксильной группы аминокислоты (аспарагина) и далее последовательно конструировали исходные данные атомов Оn+ 1 (nn–1, n–3) и Сn+ 2 (карбоксильной группы аминокислоты) в многомерном пространстве. Координату Н с индексом n переформатировали в координату с индексом n–1, n–2. При оптимизации энергии системы варьировались внутренние координаты всех атомов нейтральных молекул. В рассматриваемой системе внутреннее вращение ограничено образованием водородных связей и наличием заместителей с заторможенным вращением (трет-бутильные группы и наличие заместителей у одного из углеродных атомов). В данной работе расчет останавливается при глобальном минимуме образования, что соответствует структуре, в которой заместители в молекулах пептидов находятся в транс-положении. Для расчета по модели COSMO в командную строку дополнительно вводили ключ расчета в следующем виде: Nspa = 60 gradients 1SCF eps =78.4 charge = 0.

Противоопухолевая активность

Противоопухолевые свойства соединения 1 изучались на мышах весом 18–22 грамма с асцитной саркомой 37 при внутрибрюшинной трансплантации ~106 опухолевых клеток в 0.2 мл асцитической жидкости, разведенной физиологическим раствором по методу [10]. Для построения кинетических кривых роста опухоли забивали по несколько животных и определяли у каждого из них объем асцитической жидкости и общее количество взвешенных в ней опухолевых клеток.

Влияние на апоптоз опухолевых клеток карциномы Льюис изучали в опытах ex vivo смешиванием суспензии опухолевых клеток в питательной среде 199 (концентрация 5 ⋅ 108 кл/мл) с раствором соединения 1. Суспензию клеток делили на две части по 2 мл каждая. К одной части добавляли среду 199, а к другой – такой же раствор соединения 1 в концентрации 2.5 мг/мл. Соответствующим образом готовили контрольный образец, где вместо раствора соединения 1 использовали среду 199. Суспензию опухолевых клеток с соединением 1 инкубировали при 37 °С от 0.5 до 3 ч. Далее методом иммуноблоттинга [16] определяли содержание антиапоптозного белка Bcl-2 с помощью антител “Monoclonal Anti-BCL-2 clone ab 32124” и препарата “кроличьи антитела Ig G” компании Sigma-Aldrich. Визуализацию полос белка на нитроцеллюлозной мембране проводили с помощью набора Kit компании Sigma-Aldrich. Затем после оптического сканирования и обработки сканов исследуемых полос с использованием программы BMP Scale проводили расчет оптической плотности каждой полосы на компьютере, что пропорционально концентрации белков.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Свойства водорастворимого антиоксиданта 1 в водной среде в присутствии пептида представляют интерес как в плане влияния на него белков и отдельных пептидов, так и возможности взаимодействия с полярными группами молекул, выбранных для расчета пептидов. При инъекции соединения 1 мышам в дозе 10 и 100 мг/кг спустя сутки после трансплантации, наблюдалось практически полное торможение опухолевого роста (рис. 1, кривая 2) при экспоненциальном росте показателей опухолевого роста в контроле (рис. 1, кривая 1).

Рис. 1.

Зависимости роста количества (N) опухолевых клеток саркомы 37 в контроле (1) и в присутствии соединения 1 (2).

Изучение процесса апоптоза в опухолевых клетках на примере карциномы Льюиса показало, что соединение 1 усиливает апоптоз опухолевых клеток. На рис. 2 приведены результаты эксперимента по измерению методом иммуноблотинга уровня гомодимера антиапоптозного белка Bcl-2 в суспензии опухолевых клеток карциномы Льюис при инкубации с соединением 1. Содержание димера Bcl-2 (51 кДа) в присутствии соединения 1 существенно снижается с 1-го по 3-й час инкубации, что может привести к изменению баланса в системе про- и антиапоптозных белков и к запуску процесса апоптоза.

Рис. 2.

Изменение концентрации димера белка Bcl-2 в суспензии клеток карциномы Льюис в контроле (1) и при инкубации соединением 1 (2) в течение 0–3 ч.

Также наблюдали снижение содержания белка мономера Bcl-2 (26 кДа) на 40–50% в течение первых 1–1.5 ч, которое несколько увеличивается к 3-му часу инкубации, возможно, за счет распада димера (рис. 3). При этом в контрольной группе уровень антиапоптозного белка оставался достаточно стабильным в течение 3 ч.

Рис. 3.

То же, что и на рис. 2, но для мономера белка Bcl-2 в суспензии клеток карциномы Льюис.

Факт снижения содержания белка Bcl-2, по-видимому, связан с воздействием соединения 1 на внутриклеточные мишени путей апоптоза. Как следует из данных работы [15], белок Bcl-2 состоит из нескольких групп полипептидов, объединенных в домены. В настоящей работе для расчета структуры выбрана молекула пептида Мсl-1 домена ВН3, состоящая из цепочки аминокислот лейцин – аргинин – аргинин – глицин – аспарагиновая кислота – аргинин, в молекуле белка Bcl-2. Из расчета комплекса соединения 1 пептидом Мсl-1 (рис. 4) следует, что при его образовании уменьшается энтропия (ΔS = –92.12 Дж ⋅ моль–1 ⋅ град; 298 К) по сравнению с суммой энтропий индивидуальных компонентов. Изменение энтальпии ΔН° ~ 7 кДж ⋅ моль–1, что свидетельствует об увеличении свободной энергии комплекса соединения 1 с пептидом Mcl-1. Эти данные указывают на возможность взаимодействия соединения 1 с антиапоптозными белками семейства Bcl-2 опухолевых клеток.

Рис. 4.

Структура комплекса соединения 1 с пептидом Mcl-1 белка Bcl-2.

В структуру соединения 1 включены фрагменты трет-бутильных групп в 2,6-положениях молекулы фенола и функциональные заместители производных ацетиламиномалоновой кислоты с участием атома натрия. Указанное сочетание заместителей в молекуле ограничивает свободное вращение и позволяет стабилизировать структуры, находящиеся в виде ассоциатов [9]. В расчете структуры комплекса соединения 1 с молекулами Н2О использовали ассоциат с глобальным максимумом образования [11]. В такой структуре атом натрия связан с двумя атомами кислорода карбонильных групп и сохраняет свое положение в окружении 12 молекул Н2О. Такому составу соответствует кристаллогидрат соединения 1. Исследование структуры комплексов соединения 1, молекул Н2О и пептидов методом квантовой химии является одним из этапов установления механизма дезактивации пептидов в биологической среде. Количественную оценку этого механизма, связанного со структурными изменениями пиптидов, можно получить в результате термодинамического расчета изменения энтропии в начальном и конечном состояниях системы. Поскольку в молекулах пептида, полипептида или белка концевой группой является карбоксильная группа, то при расчете вид пептида не важен. Результат будет зависеть от координации атома металла в структуре соединения 1 с карбоксильной группой молекулы пептида.

Проведены расчеты трехкомпонентной системы, состоящей из молекул соединения 1, 12 молекул Н2О и ряда пептидов. В пептидах были использованы аминокислоты с полярными группами и аминокислоты с алкильными заместителями. Что касается торсионных степеней свободы, то этот подход справедлив для пептидов, содержащих только алкильные заместители в пептидной цепочке. В данном исследовании использовались пептиды из аминокислот с функциональными группами в заместителях, что приводит к образованию внутримолекулярных водородных связей (внутренний скелет). Разрушение внутреннего скелета у белков приводит к потере биологической активности.

Для расчета были выбраны структуры восьми аминокислот: аспарагина (Asn), серина (Ser), цистина (Cys), аланина (Ala), изолейцина (Ile), треонина (Thr), орницина (Orn), глутамина (Gln). Термодинамические величины при учете движения молекул рассчитывали с учетом жесткости структур. Результаты квантовохимических расчетов структур 28, представлены в табл. 1.

Таблица 1.  

Энергии образования, энтальпии и энтропии наноассоциатов, образованных из трех компонентов: соединения 1, 12 молекул H2O и пептида

Номер структуры Пептид Энергия образования Hf, кДж ⋅ моль–1 Энтальпия H°, кДж ⋅ моль–1 Энтропия S, Дж ⋅ моль–1 ⋅ град (298 К)
1 4627.51 175.17 1509.06
2 Asn–Ser–Cys 6060.87 236.11 1947.21
3 Asn–Ser–Cys–Ala 6244.38 248.63 2016.06
4 Asn–Ser–Cys–Ala–LLe 6552.73 276.38 2236.47
5 Asn–Ser–Cys–Ala–Lle–Thr 6929.27 299.12 2412.36
6 Asn–Ser–Cys–Ala–Lle–Thr–Asn 7531.73 319.02 2512.18
7 Asn–Ser–Cys–Ala–Lle–Thr–Asn–Orn 7819.48 343.01 2686.07
8 Asn–Ser–Cys–Ala–Lle–Thr–Asn–Orn–Gln 8240.83 369.60 2882.44

Наноассоциаты 28 представляют собой образования из трех компонентов: соединения 1, 12 молекул Н2О и пептида. В зависимости от природы пептида взаимное расположение молекул этих компонентов изменяется. Наиболее подвижной является структура из 12 молекул Н2О, которая преимущественно локализована между молекулами соединения 1 и пептидом (рис. 5).

Рис. 5.

Структура наноассоциата 8.

На рис. 4 представлены два обособленных компонента, а на рис. 5 три компоненты образуют единое целое, причем молекулы Н2О образуют с молекулой соединения 1 и пептидом многочисленные водородные связи, длины которых определяли по расстояниям между соответствующими атомами Например, связь с пептидом происходит посредством цепочки из водородных связей (табл. 2): О(17)–Н(62)–О(66)–Н(68)–О(72)–Н(73)–О(75)– Н(86)–О(84)–Н(191), где номера в скобках соответствуют номерам атомов в исходных данных.

Таблица 2.  

Характерные длины водородных связей между атомами кислорода и водорода в наноассоциатах 2–8

Номер структуры Длина водородной связи О–Н, Å
О17–Н62 О95–Н40 О100–Н41 Н202 Н211 О112–Н185
Н193
Н202
О117–Н137 Н144 Н152 Н160 Н169 О132–Н153 Н144 Н160 Н170 О139–Н212 О148–Н156
2 1.819 1.744 Н41 1.838
3 1.724 Н41 1.817
4 1.867 1.834 Н41 1.692 Н137
2.065
5 1.859 Н41 1.758 Н144
1.942
Н144
1.942
6 2.378 Н185
1.790
Н152 1.955 Н153
2.009
7 1.928 Н202
2.073
Н193
1.792
Н160
2.013
Н160
2.013
1.901
8 1.928 1.902 Н211
1.952
Н202
1.793
Н169
2.031
Н170
2.118
2.072

Молекула соединения 1 состоит из 56 атомов (номера 1–56), 12 молекул Н2О представлены номерами атомов от О(57) до Н(91) и далее – номера пептидов от Н(92) до Н(221). Номер О(17) принадлежит карбоксильной группе молекулы 1, О(95) – молекуле пептида. Номера О(66) и О(84) связаны с атомами кислорода молекул Н2О. Атом водорода Н(41) является атомом молекулы соединения 1. Атомы водорода от номера Н(137) и выше принадлежат структурам пептида. В структурах пептидов с атомами О(100), О(112), О(117), О(132) водородные связи образуются с различными атомами водорода в порядке увеличения пептидной цепочки из аминокислот. Данные, по изменению энтальпии и энтропии наноассоциатов (28 в зависимости от количества и природы аминокислот в структуре пептида представлены в табл. 3.

Таблица 3.  

Изменения энтальпии, энтропии и свободной энергии при межмолекулярном взаимодействии соединения 1, молекул воды и молекул пептида в зависимости от строения наноассоциата

Номер структуры Пептид Наноассоциат
состав из аминокислот энтальпия H°, кДж ⋅ моль–1 энтропия S, Дж ⋅ моль–1 ⋅ град (298 К) ΔH°, кДж ⋅ моль–1 ΔS, Дж ⋅ моль–1 ⋅ град (298 К) ΔE, кДж ⋅ моль–1
2 Asn–Ser–Cys 66.17 730.58 +5.23 +292.43 –81.91
3 Asn–Ser–Cys–Ala 81.84 857.19 +8.38 +350.19 –95.98
4 Asn–Ser–Cys–Ala–LLe 112.15 1094.91 +10.99 +367.50 –98.53
5 Asn–Ser–Cys–Ala–Lle–Thr 135.60 1286.27 +11.65 +382.97 –102.48
6 Asn–Ser–Cys–Ala–Lle–Thr–Asn 157.04 1437.75 +13.19 +434.62 –116.33
7 Asn–Ser–Cys–Ala–Lle–Thr–Asn–Orn 181.00 1623.93 +13.16 +446.97 –120.04
8 Asn–Ser–Cys–Ala–Lle–Thr–Asn–Orn–Gln 207.91 1839.07 +13.48 +465.69 –125.32

Расчеты однозначно указывают на существенное увеличение энтропии при образовании наноассоциатов, т.е. этот процесс может протекать самопроизвольно с уменьшением свободной энергии. Из данных табл. 2 следует, что процесс сопровождается преимущественно взаимодействием соединения 1 с пептидом посредством водородных связей молекул Н2О.

Влияние внешних факторов на строение и свойства наноассоциатов исследовано в модели COSMO, имитирующей воздействие континуальной воды на наноассоциат. Свойства наноассоциатов 28 в модели COSMO не соответствуют данным, приведенным в табл. 3. Результаты расчетов указывают на то, что при значении диэлектрической энергии, равном ~3.4 эВ, энтропия наноассоциата 8 составляет 678.89 ед., что на 1.5% меньше исходного значения (табл. 3), но при этом геометрические параметры и структура наноассоциата сохраняются. Уменьшение величины энтропии может указывать на увеличение свободной энергии, что согласуется с данными сравнения расчетных полных энергий (total energy) в модели COSMO (~–21107.41 эВ) и энергий расчета в РМ7 (~–21104.37 эВ).

ВЫВОДЫ

Установлено, что антиоксидант 2-(карбокси)-2-(N-ацетиламино)-3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидро-ксифенил)пропионат натрия тормозит развитие асцитной саркомы 37 и вызывает снижение уровня антиапотозного белка Bcl-2 в суспензии клеток карциномы Льюис, что связано, по-видимому, с усилением апоптоза в опухолевых клетках под влиянием препарата.

Квантово-химическим методом осуществлен расчет структур, образованных из молекул соединения 1, Н2О и пептидов.

Получены количественные данные, характеризующие внутри- и межмолекулярные взаимодействия вышеуказанных компонентов.

Предположено, что аналогичная ассоциация может иметь место при взаимодействии соединения 1 с некоторыми белками, в том числе с белками семейства Bcl-2.

Список литературы

  1. Садовничий В.А., Сулимов В.Б. // Суперкомпьютерные технологии в науке, образовании и промышленности / Под ред. Воеводина Вл.В., Садовничего В.А., Савина Г.И. М.: Изд-во МГУ, 2009. С.16.

  2. Дементьев В.А. Проблемы зарождения и эволюции биосферы. Т. 2. М.: URSS, 2013.

  3. Yolamanova M., Meier Ch. // Nat. Nanotechnol. 2013. V. 8. P. 130.

  4. Кондратьева М.С., Кабанов А.В., Комаров В.М. // Компьютерные исследования и моделирование. 2010. Т. 2. № 1. С. 83.

  5. Каткова E.В., Офёркин И.В, Сулимов В.Б. // Вычислительные методы и программирование. 2014. Т. 15. С. 258.

  6. Dewar M.J.S., Zoebisch E.G., Healy E.F. et al. // J. Amer. Chem. Soc. 1985. V.107. P. 3902.

  7. Stewart J.J.P. // J. Comp. Chem. 1989. V. 10. P. 209.

  8. Stewart J.J.P. // J. Mol. Modeling. 2007. V. 13. P. 1173.

  9. Володькин А.А., Заиков Г.Е., Курковская Л.Н., Бурлакова Е.Б. // Хим. физика. 2011. Т. 30. № 10. С. 72.

  10. Володькин А.А., Ерохин В.Н., Бурлакова Е.Б., Заиков Г.Е., Ломакин С.М. // Хим. физика. 2013. Т. 32. № 2. С. 66.

  11. Володькн А.А., Заиков Г.Е., Ломакин С.М., Коверзанова Е.В., Ярошевская Х.М. // Вестн. Казанского технол. ун-та. 2016. Т. 19. № 14. С. 19.

  12. Volodkin A.A., Zaikov G.E., Klodzinska E. et al. // Physics, Chemistry, Biology, Medicine and Agriculture. 2014. V. 1. P. 11.

  13. Volod’kin A.A., Zaikov G.E., Burlakova E.B. et al. // Organic chemistry, Biochemistry, Biotechnology, and Renewable Resoures and Development. V. 24. N.Y.: Nova Sci. Publ., 2013. P. 271.

  14. Паршина Е.Ю., Силичева Т.А., Володькин А.А. и др. // Биофизика. 2017. Т. 62. № 5. С. 920.

  15. Gabellini Ch., Trisciuoglio D., Bufalo D. // Carcinogenesis. 2017. V. 38. Issue 6. P. 579.

  16. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: уч. для мед. вузов. 3-е издание, испр. и доп. СПб.: СпецЛит, 2002.

Дополнительные материалы отсутствуют.