Химическая физика, 2020, T. 39, № 6, стр. 87-92

ВВЕДЕНИЕ

Атомно-силовая микроскопия (АСМ) стала широко используемым методом для характеристики различных свойств биологических, органических и неорганических материалов, связанных с поверхностью [1]. Метод АСМ способствовал развитию нанотехнологии как дисциплины и до сих пор регулярно используется для изучения наноматериалов, таких как углеродные нанотрубки и графен.

Супрамолекулярная химия на поверхности − это область исследований, доля которых значительно выросла за последние годы. В недавних исследованиях была разработана концепция использования супрамолекулярных взаимодействий, включая координационные, галогеновые и водородные связи, для управления молекулярной организацией на поверхностях [2].

Механизм катализа часто включает в себя образование супрамолекулярных структур за счет водородных связей в процессе каталитической реакции. Супрамолекулярные структуры открывают весьма перспективное направление анализа нековалентных взаимодействий [3].

Нами предложен новый подход к изучению методом АСМ супрамолекулярных комплексов и роли водородных связей при образовании супрамолекулярных структур на основе металлокомплексов, являющихся катализаторами процессов окисления и моделями активных центров ферментов, а также к изучению структурных изменений клеток. В настоящем сообщении коротко представлены результаты АСМ-исследований авторов, полученные за последние 7 лет.

В АСМ-исследованиях использовали атомно-силовой микроскоп SOLVER P47/SMENA/ с кремниевым кантиливером NSG11S (NT MDT), радиусом кривизны 10 нм, высотой наконечника 10–15 мкм и углом конуса ≤22°; в режиме записи на пленку была использована резонансная частота в 150 кГц. Топографические изображения объектов получены в режиме “tapping mode” [4]. С целью изучения возможности связывания с поверхностью и дальнейшего роста за счет межмолекулярных H-связей супрамолекулярных структур на основе гетеролигандных комплексов никеля и железа была использована гидрофобная химически модифицированная кремниевая поверхность в качестве субстрата.

Образование супрамолекулярных структур на поверхности обусловлено балансом между взаимодействиями молекул с поверхностью и межмолекулярными взаимодействиями [5]. Если межмолекулярных связей нет или они слабы, то роста стабильных структур практически не происходит. Разработаны методы фиксации на поверхности за счет H-связей и количественной оценки размерных параметров растительных митохондрий и эритроцитов. Получены топографические изображения объектов в режиме “tapping mode”.

РОЛЬ СУПРАМОЛЕКУЛЯРНЫХ СТРУКТУР В МЕХАНИЗМАХ КАТАЛИЗА ГЕТЕРОЛИГАНДНЫМИ КОМПЛЕКСАМИ НИКЕЛЯ РЕАКЦИЙ ОКИСЛЕНИЯ АЛКИЛАРЕНОВ МОЛЕКУЛЯРНЫМ КИСЛОРОДОМ

Проблема снижения активности гомогенного катализатора в ходе реакции окисления углеводородов молекулярным кислородом – одна из основных проблем катализа, так как функционирование катализатора всегда сопровождается процессами его дезактивации [5]. Метод модификации металлокомплексных катализаторов, направленный на повышение селективности и степени конверсии окисления алкиларенов в соответствующие гидропероксиды, впервые предложенный Л.И. Матиенко [5], заключается во введении дополнительных моно- или мультидентатных модифицирующих лигандов L² в каталитические комплексы ${\text{ML}}_{n}^{{\text{1}}},$ где M = Ni^II, Fe^{II, III}, L¹ = acac^–, enamac^–. Исследован механизм действия L² и разработаны новые эффективные катализаторы селективного окисления этилбензола в α-фенилэтил гидропероксид (ФЭГ). Механизм катализа заключается в формировании in situ первичных комплексов ${{\left( {{{{\text{M}}}^{{{\text{II}}}}}{\text{L}}_{{\text{2}}}^{{\text{1}}}} \right)}_{x}}{{\left( {{{{\text{L}}}^{{\text{2}}}}} \right)}_{y}}$ и образовании эффективных гетеролигандных комплексов ${\text{M}}_{x}^{{{\text{II}}}}{\text{L}}_{y}^{{\text{1}}}{{\left( {{\text{L}}_{{ox}}^{{\text{1}}}} \right)}_{z}}{{({{{\text{L}}}^{{\text{2}}}})}_{n}}{{({{{\text{H}}}_{{\text{2}}}}{\text{O}})}_{m}},$ которые являются промежуточными продуктами окисления комплексов ${{\left( {{{{\text{M}}}^{{{\text{II}}}}}{\text{L}}_{{\text{2}}}^{{\text{1}}}} \right)}_{x}}{{({{{\text{L}}}^{{\text{2}}}})}_{y}}$ кислородом в ходе процесса окисления этилбензола [5]. Наиболее эффективными каталитическими системами селективного окисления этилбензола в ФЭГ молекулярным кислородом являются трехкомпонентные системы {Ni(acac)₂ + L² + PhOH} (L² = = NMP (N-метил-2-пирролидон), HMPA, MSt; M = Na, Li)¹⁾¹⁾ [5, 6]. Эти системы включают в себя фенол в качестве третьего компонента. Образование комплексов Ni(acac)₂ ∙ L² ∙ PhOH доказано кинетически. Тройные системы не окисляются молекулярным кислородом и очень стабильны в ходе процесса окисления этилбензола.

Мы предположили, что высокая эффективность катализаторов ${\text{N}}{{{\text{i}}}_{x}}{\text{L}}_{y}^{{\text{1}}}{{\left( {{\text{L}}_{{ox}}^{{\text{1}}}} \right)}_{z}}{{({{{\text{L}}}^{{\text{2}}}})}_{n}}{{({{{\text{H}}}_{{\text{2}}}}{\text{O}})}_{m}}$ (L¹ = = acac⁻, ${\text{L}}_{{ox}}^{{\text{1}}}$ = CH₃COO⁻) и Ni(acac)₂ ∙ L² ∙ PhOH в процессе селективного окисления RH в ФЭГ могла быть связана с образованием устойчивых супрамолекулярных структур за счет межмолекулярных водородных связей и, возможно, других нековалентных взаимодействий [5]. Действительно, методом АСМ зарегистрирована самоорганизация супрамолекулярных структур на основе Ni₂(acac)(OAc)₃ ∙ NMP ∙ 2H₂O (${\text{N}}{{{\text{i}}}_{x}}{\text{L}}_{y}^{{\text{1}}}{{\left( {{\text{L}}_{{ox}}^{{\text{1}}}} \right)}_{z}}{{({{{\text{L}}}^{{\text{2}}}})}_{n}}{{({{{\text{H}}}_{{\text{2}}}}{\text{O}})}_{m}},$ L² = NMP), а также тройных комплексов Ni(acac)₂ ∙ L² ∙ PhOH (L² = NMP, HMPA, MSt; M = Na, Li) в очень стабильные супрамолекулярные структуры (с максимальной высотой h частиц − до 100 нм). Полученные АСМ-данные указывают на высокую вероятность образования стабильных супрамолекулярных структур на основе гетеролигандных комплексов никеля Ni₂(acac)(OAc)₃ ∙ NMP ∙ 2H₂O и Ni(acac)₂ ∙ ∙ L² ∙ PhOH за счет межмолекулярных H-связей и, возможно, других нековалентных взаимодействий в реальных условиях каталитического окисления [4, 7].

ПРЕДПОЛАГАЕМАЯ РОЛЬ СУПРАМОЛЕКУЛЯРНЫХ СТРУКТУР В МЕХАНИЗМАХ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ НА ОСНОВЕ АСМ-ДАННЫХ

Ранее мы установили механизм окислительной трансформации комплексов никеля и железа, активированных добавками электронодонорных лигандов $\left( {{{{\left( {{{{\text{M}}}^{{{\text{II}}}}}{\text{L}}_{{\text{2}}}^{{\text{1}}}} \right)}}_{x}}{{{({{{\text{L}}}^{{\text{2}}}})}}_{y}}} \right)$ в процессе окисления этилбензола молекулярным O₂ [5]. Маршруты превращений комплексов различны, но приводят к образованию аналогичных гетеролигандных комплексов: ${\text{M}}_{x}^{{{\text{II}}}}{\text{L}}_{y}^{{\text{1}}}{{\left( {{\text{L}}_{{ox}}^{{\text{1}}}} \right)}_{z}}{{({{{\text{L}}}^{{\text{2}}}})}_{n}}{{({{{\text{H}}}_{{\text{2}}}}{\text{O}})}_{m}}$ (${\text{L}}_{{ox}}^{{\text{1}}}$ = OAc⁻). В случае M = Ni присоединение O₂ по γ-С-атому одного из (acac)^– лигандов приводит к разрыву образующейся циклической конфигурации с образованием хелатного иона ${\text{L}}_{{ox}}^{{\text{1}}}$ = (OAc)^–, ацетальдегида и элиминированием CO (через Criegee перегруппировку) по аналогии с механизмом действия Ni-ARD – ациредуктон диоксигеназы [8] или Cu- и Fe-содержащих кверцетин-2,3-диоксигеназ [8, 9]. Гипотетический механизм трансформации комплекса железа в результате присоединения O₂ по γ-С-атому (acac)^–-лиганда включает в себя образование интермедиата, содержащего 1,2-диоксетановый фрагмент, с последующим его распадом на хелатный (OAc)^– лиганд и метилглиоксаль без образования CO [9] по аналогии с действием Fe-ациредуктон диоксигеназы (Fe-ARD) и Fe-ацетилацетон диоксигеназы (Dke 1) [8, 9].

Ациредуктон-диоксигеназы Ni(Fe)-ARD являются ферментами, участвующими в универсальном процессе превращения серосодержащих метаболитов в метионин (methionine salvage pathway (MSP)). Оба фермента Ni(Fe)-ARD являются членами структурного суперсемейства, известного как “cupins” (купины), включающего Dke 1 и цистеин диоксигеназу. Семейство купинов использует три лиганда гистидина (His), а также один или два атома кислорода из воды и кислорода карбоксилатной группы (Glu) для связывания с Fe(Ni)-центром [8, 9]. В зависимости от природы иона металла в активном месте ферменты различаются структурой и механизмом действия в отношении общих субстратов (1,2-дигидрокси-3-оксо-5 (метилтио) пент-1-ен (β-дикетон ациредуктон) и молекулярный кислород) [8]. По аналогии с действием Dke1 фермент Fe-ARD катализирует присоединение O₂ к ациредуктону с образованием формиата и 2-кето-4-(тиометил) бутирата, предшественника метионина. Фермент Ni-ARD катализирует трансформацию, не приводящую к образованию метионина. В результате этой реакции образуется CO, являющийся нейротрансмиттером, который идентифирован в качестве антиапоптозной молекулы у млекопитающих [8].

Поскольку комплексы ${{\left( {{{{\text{M}}}^{{{\text{II}},{\text{III}}}}}{\text{L}}_{n}^{{\text{1}}}} \right)}_{x}} \cdot {{\left( {{{{\text{L}}}^{{\text{2}}}}} \right)}_{y}},$ ${\text{M}}_{x}^{{{\text{II}}}}{\text{L}}_{y}^{{\text{1}}}{{\left( {{\text{L}}_{{ox}}^{{\text{1}}}} \right)}_{z}}{{({{{\text{L}}}^{{\text{2}}}})}_{n}}{{({{{\text{H}}}_{{\text{2}}}}{\text{O}})}_{m}}$ (M = Ni, Fe), Ni(acac)₂ ∙ L² ∙ · PhOH являются структурными и функциональными моделями активных центров Ni(Fe)-ARD, результаты АСМ-исследований могут быть полезными при объяснении механизма действия этих ферментов. Образование многомерных форм может быть одним из возможных способов регулирования активности ферментов Ni(Fe)-ARD в цикле MSP. Так, с формированием стабильных структур, подобных Ni₂(acac)(OAc)₃ ∙ NMP ∙ 2H₂O [4], может быть связано снижение активности Ni-ARD в цикле MSP. Мы впервые высказали предположение о том, что, рассматривая механизм действия ферментов Ni(Fe)-ARD, необходимо принимать во внимание роль их второй координационной сферы, включающей фрагмент тирозин (Tyr). Например, участие Tyr-фрагмента предполагалось в действии Homoprotocatechuate 2,3-диоксигеназы [7].

Образованием стабильных супрамолекулярных структур за счет H-связей на основе модельных комплексов {Ni(acac)₂ ∙ L² ∙ L³} (L² = NMP, HMPA, L³ = PhOH), и {Ni(acac)₂ ∙ L² ∙ Tyr} (L² = = NMP, (His)), можно объяснить снижение активности Ni-ARD и регуляторную роль Tyr- и His-фрагментов (рис. 1) [7, 10]. Данные УФ-спектроскопии свидетельствуют о внутри- и внешнесферной координации экстралигандов Tyr и His с Ni(acac)₂ [10].

Рис. 1.

а − Трехмерное АСМ-изображение наноструктур (h = 40 нм) на основе тройных систем {Ni(acac)₂ + His + Tyr} (His = L-гистидин, Tyr = L-тирозин); б − диаграмма средних значений объемов частиц на основе бинарных (1) {Ni(acac)₂ + His} и тройных (2) систем {Ni(acac)₂ + His + Tyr} (на диаграмме – 95%-ный доверительный интервал); в − эмпирическое и теоретическое кумулятивное логнормальное распределение объемов частиц на основе системы {Ni(acac)₂ + His + Tyr}.

В случае катализа Fe-ARD самоорганизация комплексов железа в супрамолекулярные структуры может благоприятствовать реакциям, приводящим к образованию метионина. Методом АСМ нами установлена самоорганизация за счет H-связей комплексов ${\text{Fe}}_{x}^{{{\text{III}}}}$(acac)_y18C6_m(H₂O)_n и ${\text{Fe}}_{x}^{{{\text{III}}}}$(acac)_y (His)_m(Tyr)_n(H₂O)_p, моделирующих активный центр Fe-ARD, в супрамолекулярные структуры, напоминающие по форме трубочки белка тубулина (рис. 2) [10]. Бинарные системы {Fe(acac)₃ + His} в отсутствие L-тирозина образуют менее четкие структуры, характеризующиеся меньшей стабильностью.

Рис. 2.

а – Трехмерное АСМ-изображение наноструктур (h = 4 нм) на основе комплексов ${\text{Fe}}_{x}^{{{\text{III}}}}$(acac)_y18C6_m(H₂O)_n; б – структура клеточных микротрубочек; в и г – двух- и трехмерное изображение наноструктур (h = 5 нм) на основе тройных комплексов ${\text{Fe}}_{x}^{{{\text{III}}}}$(acac)_y(His)_m(Tyr)_n(H₂O)_p (His = L-гистидин, Tyr = L-тирозин).

Мы предположили, что механизм действия Fe-ARD включает в себя стадию активации кислорода Fe^II + O₂ → Fe^III–${\text{O}}_{{\text{2}}}^{{ - \,\centerdot }}$ по аналогии с механизмом, предполагаемым для Dke1 [9]. Образование структур, подобных трубочкам тубулина, как это происходит, например, в случае формирования модельных комплексов ${\text{Fe}}_{x}^{{{\text{III}}}}$(acac)_y18C6_m(H₂O)_n и ${\text{Fe}}_{x}^{{{\text{III}}}}$(acac)_y(His)_m(Tyr)_n(H₂O)_p (рис. 2), может способствовать активации O₂, региоселективному присоединению активированного O₂ к ациредуктон лиганду и последующим реакциям, ведущим к образованию метионина.

Н-связывание в случае порфиринов − это тип связи, который обычно наблюдается в природе. Одним из наиболее простых искусственных типов самоорганизующихся супрамолекулярных порфириновых систем является димер, образующийся на основе функциональной группы карбоновой кислоты [11]. Согласно литературным данным о регуляторной роли Tyr-фрагмента в функционировании ферментов (гемовых белков) семейства P450 [12], возможно формирование наноструктур на модифицированной кремниевой поверхности за счет H-связей на основе модельных тройных систем, включающих Tyr-фрагмент. Мы действительно наблюдали самоорганизацию модельных систем {Hem + Tyr + His} (Hem = гемин) в стабильные наноструктуры (рис. 3, h = 20–30 нм). Интересно, что самоорганизация двойных систем {Hem + Tyr} и {Hem + His} на модифицированной кремниевой поверхности не наблюдается.

Рис. 3.

Двумерное (а) и трехмерное (б) АСМ-изображение наноструктур (h = 30 нм) на основе тройных систем {Hem + + Tyr + His} (Hem = гемин, Tyr = L-тирозин, His = L-гистидин).

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ КЛЕТОК МЕТОДОМ АСМ

С помощью метода АСМ обнаружено увеличение размеров митохондрий (способное привести к программированной клеточной смерти − апоптозу) при стрессовых воздействиях холодом (14 °С) и недостаточном увлажнении, которые предотвращались действием антиоксидантов и стимуляторами роста растений. Методом АСМ обнаружены изменения функционального состояния эритроцитов мыши, при гликолитическом голодании и в процессе опухолевого роста при трансплантации клеток карциномы Льюис. Прослежено изменение морфологии эритроцитов при введении мышам in vivo водных растворов антиоксидантов, синтезированных в ИБХФ РАН, таких как фенозан калия, ИХФАН-10 и анфен натрия, в большом диапазоне их концентраций. Актуальность таких исследований связана с тем, что фенозан калия введен в медицинскую практику как противосудорожный препарат, в то время как анфен натрия, как показано нами, является перспектиным противоопухолевым препаратом, вызывающим апоптоз по митохондриальному пути, воздействуя на белки семейства Bcl-2 [13–15].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предложен новый подход − метод АСМ для изучения возможности образования супрамолекулярных структур, а также роли межмолекулярных водородных связей (и других нековаленных взаимодействий) в механизмах реакций гомогенного и ферментативного катализа гетеролигандными комплексами никеля и железа. Факт образования на поверхности супрамолекулярных структур, полученных на основе комплексов никеля и железа за счет межмолекулярных водородных связей и, возможно, других нековалентных взаимодействий, свидетельствует о высокой вероятности образования подобных структур в реальных условиях каталитического окисления. Полученные АСМ-данные для комплексов никеля и железа, моделирующих активные центры ферментов, могут приблизить нас к пониманию механизмов действия ферментов Ni(Fe)-ARD, в частности роли Tyr- и His-фрагментов в синтезе метионина и CO, а также в функционировании ферментов семейства P450. Разработаны методические подходы атомно-силовой микроскопии для изучения структурных изменений клеток.

Часть работы, касающаяся АСМ-исследования роли супрамолекулярных структур в механизмах ферментативного катализа, получила финансовую поддержку РАН 14П (номер НИОКТР: АААА-А17-117121920169-0).