Химическая физика, 2021, T. 40, № 2, стр. 33-43

Приготовление липосом

Для приготовления липосом использовали суспензию соевого лецитина в концентрации 1 мг/мл (1.29 мМ) марки L-α-фосфатидилхолин производства компании Sigma-Aldrich (USA) в фосфатном буфере (1 мM, рН 7.4). В состав лецитина данной марки входило два основных фосфолипида: фосфатидилхолин – 63% и фосфатидилэтаноламин – 32%. Содержание жирных кислот в % к общему их количеству составило: пальмитиновая – 17, стеариновая – 4, олеиновая – 9, линолевая – 60, линоленовая – 7.

Смесь перемешивали в течение 20 мин в шейкере, добавляя от 7 до 100 мкл раствора PPP-a с концентрацией 9.1 мМ в толуоле. Липосомы формировали c использованием ультразвукового гомогенизатора VCX-130 производства компании Sonics & Materials (USA) в течение 15 мин при мощности 70 Вт. Для предохранения липосом от окисления во время ультразвуковой обработки сосуд с суспензией помещали в смесь воды со льдом. Дисперсию липосом центрифугировали при Т = 4 °С в течение 20 мин при 13 000 об/мин. Для регистрации люминесценции синглетного кислорода суспензии липосом были приготовлены с применением тяжелой воды.

Спектральные измерения

Спектры поглощения и флуоресценции снимали в кварцевых кюветах размером 10 мм × 4 мм на спектрофотометрах Shimadzu UV-3101 PC (Япония), Perkin Elmer Lambda-25 (США) и на спектрофлуориметре Флюорат-02-Панорама (Россия) [19, 20]. Для инициирования окисления липосом использовали водорастворимый инициатор ААРН – 2.2′-азо-бис(амидинопропан)дигидрохлорид производства компании Acros Organics (USA). Кинетику образования продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) – диеновых конъюгатов регистрировали на длине волны максимума их поглощения λ  = 234 нм при физиологической температуре (37  °С) [20]. Диеновы коньюгаты являются начальными продуктами ПОЛ и образуются в результате миграции двойных связей при отрыве протона от метиленовой группы, окруженной двойными связями.

Времена жизни флуоресценции PPP-a, включенного в липосомы, измеряли при 678 нм на времяразрешенном спектрофлуориметре Fluotime 300 PicoQuant (Germany): фотовозбуждение от лазера Solea при 507 нм. Времена жизни люминесценции синглетного кислорода измеряли на этом же приборе при 1275 нм. Фотовозбуждение РРР-а проводили с помощью ксеноновой лампы при 543 нм. Образцы разводили до значений поглощения 0.065–0.07 на длине волны λ  = 543 нм. Для расчета квантового выхода синглетного кислорода аналогичные измерения были сделаны и для раствора бенгальского розового в тяжелой воде.

Анизотропию флуоресценции свободного PPP-a в дихлорметане и в составе водной суспензии липосом измеряли также на Fluotime 300 PicoQuant: фотовозбуждение поляризованным светом от лазера LDH 405 при 398 нм, флуоресценция (поляризованный свет) при 680 нм.

Метод динамического светорассеяния

Для определения размеров липосом в суспензии использовался метод динамического светорассеяния. Измерения среднего диаметра липосом проводили на высокочувствительном приборе Zetasizer Nano ZS (Great Britain) по оценке корреляционной функции флуктуаций интенсивности рассеянного на липосомах под углом 173° лазерного излучения с λ = 633 нм. Концентрация лецитина в суспензии липосом составляла 0.5 мг/мл, температура – 25  °С, индекс полидисперсности варьировался в пределах 0.21–0.26. Для каждого размера выполняли регистрацию 5–10 распределений интенсивности по размерам частиц с 15 накоплениями в каждом измерении; усреднение проводили по размерам частиц с максимальной интенсивностью рассеяния. Для измерения ζ-потенциала (Z) липосом этот же прибор использовался в режиме регистрации электрофоретической подвижности частиц. Усреднение максимальных значений ζ-потенциала выполняли по результатам трех измерений, погрешность измерений не превышала 10%.

Определение вязкости компонентов в липосомах

Текучесть липидного бислоя мембран определяли методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) спиновых зондов. В качестве зонда использовали стабильные нитроксильные радикалы 2,2,6,6-тетраметил-4-каприлоилоксилпиперидин-1-оксил, синтезированные в Институте химической физики им. Н.Н. Семёнова РАН. Глубина расположения нитроксильного радикала в липосомах составляла 0.2–0.4 нм. Из полученных спектров ЭПР рассчитывали время корреляции вращательной диффузии (τ_с), характеризующее микровязкость компонентов мембраны. Регистрацию спектров ЭПР проводили на радиоспектрометре ER 200D-SRC компании Bruker (Germany).

ИК-спектроскопия

Измерение методом ИК-спектроскопии проводили на приборе Specord (M80 Carl Zeiss, Germany). Спектры регистрировали в диапазоне волновых чисел от 1000 до 2000 см^–1. Образцы наносили в виде водных суспензий на стекло марки КРС-5 (объем суспензии составлял 3 мкл) и прижимали вторым таким же стеклом. Условия облучения красным светом кювет с суспензиями липосом аналогичны условиям опытов, проведенных с клетками (светофильтр КС-11, 30 Дж/см²).

Культивирование клеток HCT 116

В работе использовали клеточную линию аденокарциномы кишки НСТ 116. Клетки культивировали в питательной среде DMEM производства компании ПанЭко (Россия). В культуральные среды добавляли 10% эмбриональной телячьей сыворотки (GE LifeSciences, USA), 2 мМ L-глутамина (ПанЭко, Россия), 100 ед/мл пенициллина (ПанЭко, Россия) и 100 мкг/мл стрептомицина (ПанЭко, Россия), инкубировали при 37 °С в увлажненной атмосфере c 5%-ным содержанием СО₂. В экспериментах использовали культуры в логарифмической фазе роста.

Для проведения экспериментов на клетках карциномы толстой кишки НСТ 116 была приготовлена суспензия липосом с концентрациями лецитина и РРР-а в них соответсвенно 1 мг/мл и 31.7 мкM. Данная концентрация PPP-a была выбрана как наиболее эффективная по результатам спектральных исследований.

Конфокальная спектроскопия

Для определения локализации PPP-a и подтверждения генерации АФК использовался метод конфокальной микроскопии. Клетки НСТ 116 инкубировали с липосомами в конечной концентрации PPP-a, равной 3.5 мкМ, в течение 24 ч в СО₂-инкубаторе. Далее их (клетки) промывали и инкубировали с флуоресцентными клеточными маркерами: Hoechst 33342 (концентрация – 0.01 мг/мл, λ_ex = 405 нм/λ_em = 415–470 нм), LysoTracker™ Green DND-26 (0.05 мкМ, λ_ex = = 488 нм/λ_em = 500–580 нм), ER-Tracker™ Green (1 мкМ, λ_ex = 488 нм/λ_em = 510–570 нм), Dihydrorhodamine 123 (10 мкМ, λ_ex = 488 нм/λ_em = 510–570 нм), пропидия иодид (0.1 мг/мл) согласно методике производителя (Thermo Fisher Scientific, USA). Регистрацию результатов осуществляли на конфокальном микроскопе Leica TCS SPE 5 (Leica Microsystems GmbH, Germany).

Проведение экспериментов in vitro

Клетки НСТ 116 инкубировали в суспензии липосом с конечными концентрациями 0.06–0.33 мг/мл в течение 24 ч в СО₂-инкубаторе. Затем клетки освещали галогеновой лампой через красный светофильтр КС-11 (Оптические лазерные технологии, Россия) с пропусканием в области свыше 610 нм. Дозы освещения составили 0–60 Дж/см². Для предотвращения нагревания использовали теплоотведение насыщенным раствором нитрата натрия. В темновом варианте эксперимента клетки не освещали, оставляя в инкубаторе. После освещения или темновой инкубации клетки инкубировали в СО₂-инкубаторе в течение 24 ч для развития эффектов гибели и анализировали жизнеспособность клеток методом МТТ-теста. Показатели выживаемости рассчитывали в процентах как отношение оптической плотности растворов формазана в диметилсульфоксиде в экспериментальных лунках к среднему значению в контрольных лунках (клетки без препаратов). Каждую пробу анализировали в трех повторах, погрешность измерений не превышала 5%.

Физико-химические свойства суспензий липосом с различной концентрацией в них метилового эфира пирофофорбида-а

Метиловый эфир пирофеофорбида-а, обозначаемый в зарубежных источниках как PPME, является тетрапиррольным соединением, практически нерастворимым в воде (его структурная формула приведена на рис. 1). Для исследования фотохимических и физико-химических свойств липосомальной формы PPP-a были приготовлены шесть видов липосом: “чистые” липосомы (без PPP-a) и липосомы с концентрациями PPP-a в липидной фазе, составляющими 3.4, 9.1, 32.9, 48 и 75 мкмоль/г липидов; так как концентрация лецитина в водной суспензии составляла 1 мг/мл, то моляльные концентрации PPP-a в липидной фазе числено совпадают с молярными в водной суспензии. На спектрах PPP-a (рис. 2) видны две основные полосы поглощения: Сорэ с максимумом при λ = 417 нм и Q-полосы в красной области спектра с максимумом при λ = 673 нм; последняя используется для возбуждения ФС при выполнении ФДТ. Кроме этих полос, PPP-a имеет несколько менее выраженных максимумов поглощения при 512, 542 и 615 нм.

Рис. 1.

Структурная формула метилового эфира пирофеофорбида-а.

Рис. 2.

Спектры поглощения липосом: 0 – без PPP-a, 1 – с концентрацией PPP-a, равной 3.42 мкмоль/г липидов, 2 – 32.9 мкмоль/г липидов. Разбавление исходных липосом в 4 раза.

Кинетические кривые инициированного ААРН окисления липосом с приведенными в подписи к рис. 2 концентрациями PPP-a представлены на рис. 3. Видно, что PPP-a дозозависимо тормозит окисление, что свидетельствует о проявлении этим ФС антиокислительных свойств. Еще, по-видимому, PPP-a значительно структурирует бислой липосом, что способствует уменьшению проникновения кислорода в липосому и снижению скорости окисления (происходит ингибирование окисления липидов в липосоме). Аналогичные эффекты были ранее описаны в работах [20, 21]. Применяя хемилюминесцентные методы, можно получить более точную картину антиокислительного действия PPP-a. Особенности изучения ингибированного окисления подробно рассмотрены в работе [22]. Результаты по измерению вязкости бислоя липосом приведены на рис. 4.

Рис. 3.

Кинетические кривые образования диеновых конъюгатов при инициированном ААРН окислении липосом: 0 – без PPP-a, 1 – с концентрацией PPP-a, равной 3.42 мкмоль/г липидов, 2 – 32.9 мкмоль/г липидов; А – оптическая плотность ДК при λ = 234 нм, [лецитин] = 0.1 мг/мл, [AAPH] = 0.3 мМ.

Рис. 4.

Зависимость времени корреляции вращательной диффузии (τ_c) зонда от концентрации PPP-a в липидной фазе липосом.

Пирофеофорбид-а, встроенный в липидную мембрану, сложным образом изменяет ее микровязкость. Порфирины в малых концентрациях координируют вокруг себя молекулы липидов, способствуя их более плотной упаковке в мембране. При концентрации PPP-a, равной  32.9 мкмоль/г липидов, наоборот, микровязкость снижается, а выход на плато происходит при концентрациях более 48 мкмоль/г липидов. Липидные фазы “чистых” липосом и липосом, содержащих 9.1 мкмоль/г липидов PPP-a, имели близкие значения микровязкости. Механизмы данных эффектов рассмотрены в работе [23], а локальная динамика и локальная организация мицеллярной фазы показаны в работе [24].

Влияние различного содержания PPP-a в липосомах видно и по изменению размеров липосом и их ζ-потенциала (рис. 5). При малых концентрациях PPP-a наблюдался рост среднего диаметра D липосом, однако уже при концентрации 32.9 мкмоль/г липидов значение D становится сопоставимым с диаметром “чистых” липосом и далее уменьшается с увеличением концентрации PPP-a. Наибольшее абсолютное значение отрицательного ζ-потенциала и максимальный размер липосом достигались при концентрации PPP-a, равной 9.1 мкмоль/г липидов, при которой, по-видимому, значительно структурируется бислой липосом. Увеличение их поверхностного заряда способствовало уменьшению агрегации частиц. Следует отметить, что значения ζ-потенциала липосом менее –30 мВ свидетельствуют о высокой стабильности суспензии.

Рис. 5.

Зависимость среднего размера D и ζ-потенциала липосом от концентрации PPP-a.

Люминесцентные характеристики водной суспензии липосом с PPP-a

При формировании водной суспензии липосом PPP-a включался в липидную фазу мицелл, что доказывается данными анизотропии флуоресценции: для “свободного” PPP-a, растворенного в CH₂Cl₂, время вращательной корреляции τ_с = (0.09 ± 0.013) нс, а для PPP-a в составе водной суспензии липосом ввиду более высокой вязкости липидов τ_с = (4.7 ± 0.24) нс (рис. 6).

Рис. 6.

Анизотропия флуоресценции РРР-а в растворе CH₂Cl₂ (а) и в составе водной суспензии липосом (б).

Растворенный в CH₂Cl₂ PPP-a при возбуждении лазерным излучением с длиной волны λ = = 410 нм имел квантовый выход возбужденного синглетного состояния ϕ_f = 0.66, время жизни τ_1f = 6.5 нс и ϕ (∆¹O₂) = 0.78. При включении PPP-a в состав бислоя липосом времена жизни τ_1f снижались при увеличении его концентрации в липидной фазе (табл. 1).

Были получены спектры флуоресценции липосом (рис. 7). Видно, что интенсивность флуоресценции PPP-a в составе липосом имеет колоколообразную зависимость от концентрации ФС с максимумом ее значения при 32.9 мкмоль/г липидов.

Рис. 7.

Спектры флуоресценции водной суспензии липосом с различной концентрацией PPP-a, мкмоль/г липидов: 1 – 3.4, 2 – 9.1, 3 – 32.9, 4 – 48, 5 – 75. На вставке – интенсивность флуоресценции (I) липосом при 678 нм (разведение суспензии в 10 раз).

Для определения квантового выхода ϕ(∆¹O₂) были приготовлены суспензии липосом в тяжелой воде с сопоставимыми концентрациями PPP-a. Время жизни ¹O₂ в тяжелой воде в среднем составляет 60–68 мкс, что на порядок больше, чем в водных растворах (3.9 мкс). Результаты, представленные на рис. 8, показывают, что наибольший квантовый выход ¹O₂ был в суспензии липосом с концентрацией PPP-a, равной 31.6 мкмоль/г липидов.

Рис. 8.

Квантовый выход ¹O₂ в суспензии липосом, приготовленных на тяжелой воде (D₂O), в зависимости от концентрации PPP-a в липидной фазе.

Образование димеров и агрегатов при высоких концентрациях PPP-a в липидной фазе приводило к уменьшению выхода триплетных состояний мономерного соединения PPP-a и, следовательно, к падению квантового выхода синглетного кислорода.

Фотосенсибилизаторы, инициирующие процессы перекисного окисления липидов

В основе фотохимических реакций II типа лежит генерация триплетным ФС синглетного кислорода, который окисляет ненасыщенные жирные кислоты фосфолипидов до их гидропероксидов. Продукты более глубокого окисления липидов являются результатом фотохимических реакций I типа, связанных с переносом электронов. Так, триплетный ФС образует из гидропероксидов жирных кислот высокореакционные пероксильные или алкоксильные радикалы, последние из которых превращаются в альдегиды [25]. Непосредственный отрыв протона от ненасыщенной жирной кислоты триплетным ФС приводит к образованию алкильного радикала и далее – пероксильного радикала, который участвует в разветвленных цепных реакциях ПОЛ. Наиболее цитотоксичными продуктами окисления липидов являются спирты, кетоны и особенно альдегиды, которые деформируют липидный бислой [26] Для определения вклада фотохимических реакций I типа в окислении липидов методом ИК-спектроскопии были проведены исследования образцов суспензий липосом с различными концентрациями PPP-a.

ИК-спектры поглощения суспензий липосом

Окисление липидов контролировали по появлению характерной полосы (плеча) в ИК-спектре при 1740 см^–1 (указана стрелкой на рис. 9). Эта полоса свидетельствует об образовании фрагмента, содержащего группу С=О в процессе окисления липидов. Обнаруженный результат свидетельствует, очевидно, о появлении альдегидной группы в составе окисленных липидов после фотоактивации суспензии липосом с концентрацией PPP-a, равной 3.42 мкмоль/г липидов.

Рис. 9.

ИК-спектры поглощения водных суспензий липосом с различными концентрациями PPP-a в мкмоль/г липидов (числа у кривых) в липидной фазе до (а) и после (б) облучения красным светом.

Исследование темновой и фотоиндуцированной цитотоксичности липосомальной формы PPP-a на клетках карциномы толстой кишки человека НСТ 116

В настоящее время вопрос о распределении ФС ряда порфиринов среди клеточных компартментов не решен. Одни авторы [18, 27] обнаружили преимущественно митохондриальную локализацию порфиринов, тогда как другие [28, 29] указывали на их тропность к мембранам эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи. В работе [18] было показано, что облучение клеток HCT 116, нагруженных PPP-a с использованием липосом, приводит к их гибели преимущественно по пути некроза, а не апоптоза, что ставит под сомнение факт преимущественного накопления этого ФС в митохондриях.

Полученные нами результаты показали, что краситель локализован главным образом в цитоплазме, в ядре сигнала практически не наблюдалось (рис 10). В результате наложения сигнала от PPP-a на сигналы от клеточных красителей DHR 123, ER-Tracker и Lysotracker (LT) не удалось установить точную локализацию PPP-a ввиду его высокой фотосенсибилизирующей активности, которая приводила к быстрому нарушению нормальной морфологии клетки при возбуждении лазером в ходе выполнения микроскопического исследования. Во всех случаях наблюдалось перекрывание сигналов (рис. 11).

Рис. 10.

Распределение PPP-a в клетке.

Рис. 11.

Наложение флуоресцентного сигнала от PPP-a и клеточных маркеров: а – DHR 123, б – ER-Tracker, в – LT.

Краситель DHR 123 способен улавливать АФК в клетке, в результате чего он переходит в флуоресцирующую форму (родамин 123), а его катионная природа способствует накоплению этого красителя в митохондриях клеток. На рис. 12 для контрольного образца (а) и образца с “чистыми” липосомами (б) виден сигнал от митохондрий клеток. В образце с PPP-a наблюдалось “разгорание” сигнала, связанного с генерацией АФК.

Рис. 12.

Визуализация клеточных органелл красителями DHR 123 (митохондрии), ER-Tracker (эндоплазматический ретикулум) и LT (лизосомы) в контроле (а), после инкубации с “чистыми” липосомами (б) и с липосомами, содержащими PPP-a (в).

Облучение клеток красным светом в присутствии PPP-a приводило к образованию АФК, что вызывало окислительную деструкцию и деградацию мембранных систем клетки. Это отчетливо видно по остаткам эндоплазматического ретикулума, окрашенного красителем ER-tracker, и по слабому сигналу от лизосом, окрашенных красителем LT. В контрольных пробах и в пробах с липосомами сохранялась нормальная морфология клеток НСТ 116.

Главным подтверждением фотоиндуцированной гибели содержащих PPP-a клеток карциномы НСТ 116 после инкубации с липосомами является проникновение в ядра клеток йодида пропидия PI (рис. 13). Этот флуоресцентный краситель не способен проникать через мембрану живых клеток, и окрашивание ядра возможно только в результате перфорации клеточных мембран.

Рис. 13.

Визуализация (Hoe) клеточных ядер, накопление пропидия йодида (PI) в клеточном ядре и наложение обеих картинок (Hoe + PI) в контроле (а), после инкубации с “чистыми” липосомами (б) и с липосомами, содержащими PPP-a (в).

Используя питательную среду DMEM, готовили серию разведений суспензии липосом с концентрацией липидов в фосфатном буфере 0.06, 0.11, 0.2 и 0.33 мг/мл, которые соответствовали содержанию PPP-a в водных растворах 1.9, 3.5, 6.3 и 10.5 мкМ. Результаты, представленные в табл. 2, показывают, что липосомальная форма PPP-a в исследованных концентрациях не имела темновой цитотоксичности. Увеличение доз облучения с 30 до 60 Дж/см² не приводило к ускорению фотоиндуцированной гибели клеток карциномы НСТ 116. Липосомы без фотосенсибилизатора при этом вызывали незначительный рост числа опухолевых клеток.

В работе [18] показано эффективное накопление PPP-a после двадцатичасовой инкубации клеток НСТ 116 с липосомальной формой PPP-a в концентрации 2 мкМ. В наших экспериментах мы также не видим существенного повышения клеточной гибели с ростом концентрации PPP-a выше 1.9 мкМ. Таким образом, липосомальная форма PPP-a обладала концентрационными ограничениями при ее использовании ФДТ, а низкая темновая цитотоксичность липосомальной формы PPP-a дает возможность многократного повторения процедур ФДТ. Необходимо отметить тот факт, что ФС, включенные в липидный бислой липосом, при действии света запускают процессы, ведущие к нарушению целостности липосом. В работе [30] рассматриваются молекулярные основы использования этого эффекта для оптимального выделения под действием света заключенных в липосомах лекарственных препаратов, что должно значительно повысить эффективность ФДТ. Применение PPP-a в этом качестве имеет, на наш взгляд, хорошие перспективы.