Химическая физика, 2021, T. 40, № 2, стр. 49-52

ВВЕДЕНИЕ

Табачный дым – аэрозоль, состоящий из газовой и твердой фаз, представляет собой сложнейшую композицию из нескольких тысяч химических соединений [1] и оказывает на организм как курящего человека, так и окружающих многогранное воздействие, являющееся фактором риска развития целого ряда заболеваний [2]. Среди разнообразных путей влияния дыма на человеческий организм следует обратить внимание на развитие в организме окислительного стресса под воздействием этого физиологически активного аэрозоля, поскольку окислительный стресс является универсальным генератором патологий [3]. В самом деле, в дыме образуются и содержатся большие количества активных форм кислорода и азота, прежде всего в свободнорадикальной форме [1]. Но кроме этих высокоактивных оксидантов дым содержит также и вещества, обладающие антиоксидантными свойствами, как показали исследования с нашим участием [4, 5]. Таким образом, суммарное воздействие дыма на окислительные процессы in vivo зависит одновременно от его оксидантных и антиоксидантных свойств. Необходимо отметить, однако, что в то время как оксидантам, образующимся в дыме, посвящено немалое количество исследований, антиоксидантным свойствам дыма до упомянутых работ [4, 5] совершенно не уделялось внимания. При исследовании антиоксидантных свойств табачного дыма необходимо иметь в виду, во-первых, то, что антиоксидантную активность проявляют как газовая фаза дыма [4], так и твердая фаза, называемая также смолой или TPM (“total particulate matter”) [4, 5]. А во-вторых, очень важным аспектом является возможная трансформация свойств экзогенных антиоксидантов, попавших в человеческий организм (прежде всего, со смолой), в метаболических процессах in vivo. Настоящая работа посвящена моделированию такой ситуации в условиях in vitro. Основу экспериментального подхода к исследованию антиоксидантной активности составили измерения хемилюминесценции в модельной системе, куда вводились пробы, проявляющие антиоксидантные свойства. Хемилюминесцентные подходы в анализе антиоксидантов наиболее удобны именно тогда, когда речь идет об исследовании активности таких реагентов [5–16].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Ввиду участия пероксидаз (ферментов, неизбежно присутствующих в слизистых оболочках в местах попадания в организм человека компонентов табачного дыма) в метаболических процессах трансформации составляющих смолы́ в качестве хемилюминофора использовался люминол – 5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион марки “Special Grade” производства компании Sigma-Aldrich (USA). Его хемилюминесценцию измеряли c помощью хемилюминометра Lum-5773 (МГУ) в присутствии перекиси водорода (Н₂О₂) и пероксидазы хрена производства компании AppliChem (Germany) [16] при добавлении в хемилюминесцирующий раствор глицина марки “Pharma Grade” (Sigma-Aldrich, USA) в качестве модельной аминокислоты, экстрактов смолы табачного дыма и проб типичного фенольного антиоксиданта – пирокатехина (катехола, 1,2-дигидроксибензола) марки “BioReagent Grade” (Sigma-Aldrich, USA), входящего в состав смолы табачного дыма [1].

Для автоматического прокуривания экспериментальных сигарет использовали курительную машину марки A14 производства фирмы Borgwaldt KC GmbH (Германия). Сбор смолы сигаретного дыма от четырех полностью выкуренных сигарет осуществлялся с помощью кембриджских фильт-ров [1, 4, 5] с ее последующим экстрагированием бензолом в течение 12 ч при 8 °C.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На рис. 1 показаны сигналы хемилюминесценции люминола в присутствии пероксидазы хрена и перекиси водорода (которую вводили маленькими порциями через каждые 1.5–2.0 мин) при добавлении глицина (слева), экстракта смолы (в центре) и смолы с глицином в одной пробе в тех же самых концентрациях (справа). Как видно из этого рисунка, ввод глицина вместе со смолой табачного дыма приводит к сильнейшему ингибированию окисления люминола, отражающемуся в тушении его хемилюминесценции.

Рис. 1.

Сигналы хемилюминесценции люминола (5 ⋅ 10^–5 М) в присутствии пероксидазы хрена (10 ед./мл) в фосфатно-карбонатном буфере (рН 7.8) при добавлении глицина (Gly, 20 мг/мл) – слева, экстракта смолы (Tar, 20 мг/мл) – в центре и смолы с глицином в одной пробе в тех же концентрациях – справа. Перекись водорода вводилась в концентрациях 5.9 ⋅ 10^–7 М с интервалами 1.5–2.0 мин.

Замена смолы на пирокатехин приводит качественно к тем же результатам. Как видно из рис. 2, пирокатехин тушит хемилюминесценцию окисляющегося люминола, и степень ингибирования этого хемилюминесцентного процесса растет с увеличением концентрации пирокатехина. Но наиболее интересной оказалась зависимость интенсивности хемилюминесценции люминола от отношения концентраций глицина (Gly) и пирокатехина (Cat) (рис. 3). Как видно из этих данных, чем больше отношение [Gly]/[Cat], тем больше глубина тушения хемилюминесценции.

Рис. 2.

Сигналы хемилюминесценции люминола (5 ⋅ 10^–5 М) в присутствии пероксидазы хрена (10 ед./мл) в фосфатно-карбонатном буфере (рН 7.8) в зависимости от добавок прирокатехина в следующих концентрациях: 0 (1), 4.54 ⋅ 10^–6 (2), 9.10 ⋅ 10^–6 (3), 1.36 ⋅ 10^–5 (4) и 1.82 ⋅ 10^–5 М (5). Перекись водорода вводилась в концентрациях 5.9 ⋅ 10^–7 М с интервалами 1.5–2.0 мин.

Рис. 3.

Сигналы хемилюминесценции люминола (5 ⋅ 10^–5 М) в присутствии пероксидазы хрена (10 ед./мл) в фосфатно-карбонатном буфере (рН 7.8) в зависимости от отношения концентраций глицина и пирокатехина, lg([Gly]/[Cat]): 2.4 (1), 3.00 (2), 3.48 (3), 4.07 (4). Перекись водорода вводилась в концентрациях 5.9 ⋅ 10^–7 М с интервалами 1.5–2.0 мин.

Как было показано относительно недавно [17], пирокатехин в присутствии глицина способен образовывать в ферментативном окислительном процессе пирокатехин-глициновые аддукты (рис. 4) [17], которые, возможно, проявляют бóльшую антирадикальную активность, чем сам пирокатехин. По всей видимости, именно это и происходит при введении пирокатехина в хемилюминесцентную систему, использованную в настоящей работе, и объясняет зависимость глубины тушения свечения от соотношения концентраций [Gly]/[Cat].

Рис. 4.

Строение пирокатехин-глициновых аддуктов (слева) и олеуропеина (справа).

В этой связи следует упомянуть интересный случай взаимодействия глицина с катехольными (пирокатехиновыми) фрагментами в присутствии пероксидазы в in vivo. Такие процессы используются личинками бабочек Brahmaea Wallichii с целью преодолеть денатурирующее действие олеуропеина (используемого растениями для своей защиты от поедания) в своем пищеварительном тракте [18], имеющего в своей структуре катехольный фрагмент (рис. 4). Для нейтрализации воздействия олеуропеина личинки Brahmaea Wallichii синтезируют в своем пищеварительном тракте до 50 мМ глицина [18]. Этот пример показывает, что метаболические ферментативные процессы с участием глицина и полифенольных соединений действительно играют важную роль живой природе. Поэтому использованный в настоящей работе ферментативный хемилюминесцентный процесс является адекватной моделью таких взаимодействий in vitro.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе показана важность учета трансформации свойств экзогенных антиоксидантов в метаболических процессах при их попадании в живой организм для оценки и прогнозирования суммарного биоантиоксидантного эффекта. Полифенольные соединения могут вступать в окислительные ферментативные процессы с участием аминокислот с образованием продуктов, обладающих большей антиоксидантной активностью, чем исходные вещества.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российским фондом фундаментальных исследований (грант № 19-53-18019 Болг_а) и Национальным научным фондом Болгарии (грант № КП-06-Русия-28).