Химическая физика, 2021, T. 40, № 2, стр. 44-48

ВВЕДЕНИЕ

Пандемия коронавируса COVID-19 стимулировала активное изучение молекулярных процессов, протекающих во всех компонентах вируса SARS-CoV-2, включая важнейший его участок – РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp), ответственную за репликацию и транскрипцию генетической информации [1]. Потенциальные ингибиторы RdRp рассматриваются как перспективные лекарственные препараты для лечения болезни, и одним из наиболее интересных кандидатов является фавипиравир [2]. Следует отметить, что на момент написания статьи соответствующий препарат одобрен Минздравом РФ для лечения COVID-19.

На рис. 1 схематично показан механизм химических превращений в активном центре РНК-полимеразы. При депротонировании атома O³' рибозы концевого нуклеотида в цепи NB(i) (левая часть рис. 1) происходит нуклеофильная атака O³' на атом P^A свободного нуклеотида NB(i + 1) (центральная часть рис. 1), что приводит к разрыву связи P^A–O^3A, отщеплению пирофосфата и наращиванию цепи РНК (правая часть рис. 1). В качестве обобщенного основания (В) на стадии депротонирования может выступать аминокислотный остаток аспарагиновой кислоты. В активном центре присутствуют ионы металла ${\text{M}}_{{\text{A}}}^{{{\text{2}} + }},$ ${\text{M}}_{{\text{B}}}^{{{\text{2}} + }},$ где M – магний или марганец, координирующие отрицательно заряженные группы реактантов.

Рис. 1.

Механизм химических преобразований в активном центре РНК-полимеразы.

Нарушение функционирования этой молекулярной машины приводит к блокированию размножения вируса. На рис. 2 показана молекула фавипировира (в соединении с рибозатрифосфатом – FRTP), которая может конкурировать с нативными субстратами фермента в активном центре и остановить нежелательный синтез РНК-вируса.

Рис. 2.

Молекула фавипиравир-рибозатрифосфата (FRTP).

Данная работа направлена на исследование физико-химических аспектов биомолекулярных процессов, связанных с ингибированием важнейшего фермента RdRp вируса SARS-CoV-2. Мы используем средства молекулярного моделирования для построения и анализа активного центра РНК-полимеразы с включенной молекулой фавипиравира. Полученные в 2020 г. данные криоэлектронной микроскопии для апо-формы RdRp [3], а также известные результаты по кристаллической структуре RdRp вируса гепатита C [4] предоставляют начальную структурную информацию, на основе которой возможно довести моделирование до анализа молекулярных групп в конфигурации фермента с кофактором (фавипиравиром в форме рибозатрифосфата), имитирующей фермент-субстратный комплекс. Сведения о механизме химической реакции в РНК-полимеразе [5], а также опыт моделирования катализируемых ферментами реакций преобразования нуклеозидтрифосфатов методами квантовой механики/молекулярной механики [6, 7] позволяют объяснить ингибирующее действие фавипиравира.

МОДЕЛИ И МЕТОДЫ

Как и все коронавирусы, SARS-CoV-2 использует многодоменную архитектуру молекулярной машины для репликации и транскрипции своей РНК. После расщепления вирусных полипротеинов образуется набор неструктурированных белков (nsp), три из которых входят в минимальную конфигурацию, обеспечивающую функционирование комплекса, а именно, nsp12 (RdRp), nsp7 и nsp8. В работе [3] сообщается о структуре комплекса nsp12–nsp7–nsp8 без цепей РНК и кофакторов с разрешением в 2.9 Å (PDB ID: 6M71). В качестве дополнительного источника структурных данных мы использовали результаты рентгеноструктурного анализа [4] для фермента RdRp вируса гепатита C. Соответствующая структура PDB ID: 4WTG наряду с комплексом nsp12–nsp7–nsp8 содержит цепочки РНК, кофакторы (ионы Mn²⁺), а также соединение софосбувир (в форме рибозадифосфата). Использование процедуры выравнивания позволило провести сравнение начальной структуры PDB ID: 6M71 и активного центра фермента в структуре PDB ID: 4WTG. Далее ионы Mn²⁺ были заменены на Mg²⁺, а софосбувир – на FRTP (см. рис. 2); боковые цепи ряда остатков активного сайта были повернуты в соответствии с положением их аналогов в структуре PDB ID: 4WTG.

Полученная модельная система была полностью сольватирована молекулами воды; были добавлены ионы натрия и хлора для нейтрализации заряда и обеспечения физиологической концентрации NaCl: 0.15 моль/л. Молекулярно-динамические расчеты проводились с помощью программы NAMD [8], анализ траекторий – в программе VMD [9]. Использовались условия ансамбля NTP с периодическими граничными условиями; шаг интегрирования составлял 2 фс, при этом все связи тяжелых атомов с атомами водорода были фиксированы (алгоритмы SHAKE/SETTLE). Потенциалы взаимодействия соответствовали силовому полю CHARMM36 [10]. Нестандартная топология и параметры остатка FRTP были описаны параметрами CGenFF [11]. Длина траекторий составляла не менее 40 нс, кадры траектории записывались через 200 пс.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На рис. 3 показан комплекс без сольватирующих оболочек молекул воды. Белки nsp7 и nsp8 важны для поддержания конструкции, но не участвуют в химических преобразованиях.

Рис. 3.

Общий вид модельной системы без сольватных оболочек.

В центре рис. 3 видны показанные стержнями фосфатные группы молекулы FRTP. Стрелками обозначены цепочки РНК, содержащие гуаниновый (Gua), адениновый (Ade) и урациловый (Ura) нуклеотиды.

Рисунок 4 показывает, насколько стабильна модельная система вдоль молекулярно-динамической траектории. После начального участка (примерно 10 нс) вся конструкция довольно устойчива (рис. 4а). Анализ показывает, что наиболее подвижные участки в nsp12 относятся к петлям вдали от активного центра фермента.

Рис. 4.

Среднеквадратичные отклонения координат (RMSD) тяжелых атомов белка (а) и молекулы FRTP (б).

Для уравновешивания положения FRTP требуется больше времени – примерно 20 нс. Это объясняется тем, что молекула FRTP не является нативным субстратом фермента, а также особенностями начального этапа конструирования модельной системы, а именно: группы FRTP замещали другое соединение в кристаллической структуре PDB ID: 4WTG.

На рис. 5 показано, что молекула фавипиравира достаточно удачно входит в комплекс. “Голова” FRTP структурно похожа на аденин и образует пару с ближайшим основанием Gua. На рис. 6 представлена структура активного центра фермента RdRp.

Рис. 5.

Цепочки РНК и фавипиравир в комплексе.

Рис. 6.

Молекулярные группы в активном центре РНК-полимеразы с фавипиравиром.

Присоединение фавипиравира к концевому нуклеотиду Ura происходит по химической реакции, показанной на рис. 1. На первом этапе депротонируется группа O³'H³' рибозы урацила, причем очевидным обобщенным основанием является боковая цепь Asp760 – расстояние между атомом кислорода O³' и атомом кислорода карбоксильной группы аспарагиновой кислоты составляет 2.8 Å, обеспечивая эффективный перенос протона. Расстояние от O³' до атома фосфора P^A, равное 3.3 Å, также благоприятствует нуклеофильной атаке с образованием связи O³'–P^A и разрывом связи P^A–O^3A. На рис. 6 не показаны боковые цепи аминокислотных остатков Asp761 и Asp618, входящих в координационные сферы ионов магния, а также положительно заряженные остатки Arg553, Arg555 и Lys551, которые связывают и ориентируют трифосфатный участок молекулы FRTP.

Настоящая работа подтверждает современные достижения компьютерного моделирования биомолекулярных процессов [12, 13]. В данном случае построенный активный центр фермента полностью согласуется с представлениями о каталитических процессах с участием нуклеозидтрифосфатов. Похожий активный центр формируется в случае фермента аденилатциклазы, катализирующего реакцию преобразования аденозинтрифосфата в циклический аденозинмонофосфат. Элементарные стадии этого процесса также включают депротонирование O³'H³'-группы рибозы, нуклеофильную атаку O³' на атом фосфора P^A α-фосфатной группы нуклеозидтрифосфата и разрыв связи P^A–O^3A. Недавние расчеты комбинированным методом квантовой механики/молекулярной механики [6] показали, что энергетический профиль этой реакции имеет барьер для лимитирующей стадии порядка 16 ккал/моль. Мы ожидаем, что в случае реакции РНК-полимеразы SARS-CoV-2 с FRTP энергетический профиль будет аналогичным, что согласуется с эффективным встраиванием фавипиравира в цепочку РНК. Блокада синтеза РНК после захвата этого соединения, по всей видимости, связана с нарушением структуры формирующейся цепочки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Построенная методами молекулярного моделирования модель многодоменного комплекса РНК-полимеразы коронавируса SARS-CoV-2 объясняет механизм воздействия фавипиравира на процесс репликации. Анализ полученной структуры и активного центра фермента показывает, что фавипиравир в форме рибозатрифосфата может встраиваться в комплекс nsp12–nsp7–nsp8 с цепочками РНК и конкурировать с природными нуклеотидами в реакции наращивания цепи.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российским фондом фундаментальных исследований (проект № 19-03-00076) с использованием оборудования Межведомственного суперкомпьютерного центра РАН и Центра коллективного пользования сверхвысокопроизводительными вычислительными ресурсами МГУ им. М.В. Ломоносова.