Химическая физика, 2023, T. 42, № 6, стр. 3-20

I. 1. Конденсация ДНК

Дезоксирибонуклеиновая кислота – длинный, сильно заряженный гетерополимер. В разбавленном растворе ДНК бактерии E. coli образует стохастический клубок объемом около 500 мкм³ [2, 7, 8]. Бактерия E. coli – широко распространенная грамотрицательная бактерия, являющаяся одним из важнейших инструментов биологической науки [9]. В этом смысле она представляет собой аналог атома водорода для микробиологии. Бактериальная геномная ДНК и ассоциированные с ней белки (NAP) расположены в клетке в сильно конденсированной и функционально организованной форме в нуклеоиде [2]. Объем нуклеоида E. coli, где располагается ДНК в клетке, не превышает 1 мкм³. Для размещения в нуклеоиде ДНК должна быть сильно компактизованной [8]. Кроме того, конденсированная в нуклеоиде ДНК должна быть функциональной, способной осуществлять такие процессы, как репликация, рекомбинация, сегрегация и транскрипция. Структура бактериального нуклеоида с высоким разрешением еще не определена. Исследования, начавшиеся в 1971 г., показали, что конденсированная ДНК в нуклеоиде имеет иерархическую структуру и что конденсация ДНК имеет некоторое сходство с самоорганизацией (фолдингом) белка [8, 10–12]. Новые методы молекулярной биологии, сокращенно называемые 3C (chromosome conformation capture) и Hi-C (high-throughput technique to capture chromatin conformation) [13–15], применяемые для изучения структурной организации ДНК в клетке, позволили выделить три уровня структурной организации компактной бактериальной ДНК [2]. Низший уровень (малый масштаб ∼1 Кбайт пар оснований (п.о.)) обеспечивается взаимодействием ДНК с белками, связывающими ДНК. На промежуточном уровне (средний масштаб ∼10 Кбайт п.о.) ДНК образует сверхспиральные петли. На самом высоком уровне (мега масштаб ∼10⁶ п.о.) ДНК образует шесть пространственно организованных макродоменов с четкой территориальной организацией, на которые разделен бактериальный нуклеоид.

I. 2. Фрактальная (складчатая) глобула

Согласно изложенному в работе [16], коллапс длинного полимера из-за топологических ограничений происходит с образованием складок все увеличивающихся размеров. Авторы работы [17] продемонстрировали, что этот процесс должен приводить к образованию долгоживущего промежуточного состояния, которое они назвали складчатой глобулой (впоследствии ее стали называть фрактальной). Было предположено, что такая глобула характеризуется иерархией складок, образуя самоподобную структуру [17]. Экспериментальное исследование свойств пространственной организации хроматина в ядре клетки человека с использованием методов 3C и Hi-C привлекло внимание к фрактальной глобуле как к структурной модели хроматина на мегамасштабе ∼10 Мбайт [18].

Фрактальная глобула обладает несколькими важными свойствами, которые делают ее привлекательным способом организации хроматина. Перечислим два таких свойства.

1. У фрактальной глобулы нет узлов. Динамика раскрытия хроматина в незаузленной конформации фрактальной глобулы очень сильно отличается от динамики раскрытия ДНК в чрезвычайно запутанной конформации равновесной глобулы [19]. В силу того, что она практически не заузлена, любая область фрактальной глобулы может легко и быстро разворачиваться, становясь доступной для транскрипционных и других белковых механизмов клетки.

2. Фрактальная глобула имеет поразительную территориальную организацию цепочки, которая сильно контрастирует с перемешанной организацией цепочки, наблюдаемой в равновесной глобуле. Хромосомные контакты в клетках человека были охарактеризованы с помощью метода Hi-C. Сравнение с экспериментом показывает, что фрактальная глобула на качественном уровне описывает свойства хромосомы человека на мегамасштабах (3-м уровне структурной организации ДНК). Эти два свойства фрактальной глобулы позволили предложить ее в качестве модели сворачивания ДНК внутри клетки на мегамасштабе.

После “триумфального шествия” модели фрактальной глобулы как крупномасштабной упаковки ДНК в хроматине в 2011–2014 гг. стали появляться экспериментальные данные, ставящие под сомнение это утверждение. Выяснилось, что эксперименты по малоугловому рассеянию нейтронов (МУРН) способны подтвердить или опровергнуть справедливость той или иной модели, построенной для описания крупномасштабной структуры хроматина. [20]. Интенсивность рассеяния нейтронов на ядрах эритроцитов описывается степенной функцией. Эксперименты по МУРН на хроматине определяют показатель степени равным трем или близким к нему [20], что противоречит модели складчатой (фрактальной) глобулы и фактически отрицает ее как лучшую модель для описания крупномасштабной структуры хроматина в ядре клетки. Для складчатой глобулы показатель степени должен бы быть равен четырем.

Отметим еще одно очень важное свойство фрактальной глобулы. В этой модели структура конденсированной ДНК не отвечает глобальному минимуму энергии энергетического ландшафта сворачивания ДНК. Структура конденсированной ДНК соответствует долгоживущему промежуточному, частично равновесному состоянию, поэтому можно ожидать, что ДНК в различных клетках бактериальной колонии может конденсироваться различно. Структура ДНК в каждой клетке может отличаться от структуры ДНК в соседних клетках. Ансамбль клеток оказывается гетерогенным. Этот факт согласуется с известным в микробиологии утверждением, что для бактериальной многоклеточной системы характерна физиологическая и морфологическая гетерогенность входящих в нее клеток [4]. (О гетерогенности упаковки ДНК в различных клетках подробнее см. данные, приведенные в конце разд. II).

Поразительная территориальная организация и возможность любой области глобулы быстро и легко разворачиваться делает модели, устроенные по типу модели фрактальной глобулы, одними из самых привлекательных моделей крупномасштабной упаковки ДНК в клетке, к тому же качественно совпадающей со многими (но не со всеми) экспериментальными исследованиями.

II. 1. Бактериальный рост

Бактериальный рост – это деление клетки бактерии на две дочерние клетки. Дочерние клетки генетически идентичны исходной клетке. Динамику роста бактериальной популяции подразделяют на четыре фазы [21]. Первая фаза роста называется лаг-фазой, далее следует экспоненциальная фаза, во время которой происходит быстрый экспоненциальный рост популяции. В ходе экспоненциальной фазы питательные вещества потребляются с максимальной скоростью до тех пор, пока одно из необходимых соединений не закончится и не начнет подавлять рост. Третья фаза роста называется стационарной, она начинается при нехватке питательных веществ для быстрого роста. Скорость метаболизма падает, клетки начинают расщеплять белки, не являющиеся строго необходимыми. В этой фазе клетки начинают испытывать стресс голодания. В ответ на стресс голодания клетки микроорганизмов включают наследственные стратегии адаптации, позволяющие сохранить часть популяции и выжить в любых неблагоприятных условиях. Эти стратегии направлены на защиту генетического материала клетки (ДНК) [5]. Если стресс голодания сохраняется, то происходит либо образование покоящихся форм, характеризующихся практически полным отсутствием метаболизма (обмена с внешней средой), либо гибель клеток. Большинство клеток (до 99.98%) в голодающих долгое время популяциях гибнут. Остальные клетки (0.02%) развиваются в покоящиеся формы [4, 22].

II. 2. Смена модели упорядочения. Образование покоящихся клеток

В классическом труде “Что такое жизнь с точки зрения физики?” Э. Шредингер [23] пишет, что жизнь представляет собой непрерывную борьбу против стремления к состоянию термодинамического равновесия с максимальной энтропией, что тождественно равно смерти. Живые системы поддерживают упорядоченное, далекое от равновесия состояние, питаясь химическими соединениями. Метаболизм (обмен с внешней средой) – источник динамического порядка. Если прекращается метаболизм, то термодинамического равновесия избежать нельзя.

По мере перехода клеток в покоящееся состояние (практически полное отсутствие метаболизма) обычные биохимические способы защиты ДНК перестают работать. Клетки, адаптируясь к новым условиям, вынуждены использовать физические механизмы защиты ДНК (плотную упаковку ДНК, наноуровневую кристаллизацию ДНК с белками и т.д.). Эти адаптационные механизмы нужны для выживания клеток. При наступлении благоприятных условий выжившие клетки снова перейдут к нормальной жизни.

При стрессе голодания поддержание упорядоченности динамическим способом становится невозможным (клеточные процессы становятся неэффективными, метаболизм почти отсутствует); бактерии задействуют другой, энергонезависимый механизм поддержания упорядоченности и защиты жизненно важных структур (ДНК) – создание устойчивых молекулярных структур, как в неживой природе [6]. Выжившие с помощью физических механизмов защиты ДНК клетки становятся покоящимися.

Для покоящихся клеток можно ожидать совершенно новых структур (новой архитектуры ДНК) по сравнению с растущими клетками. Экспериментальному изучению структурной организации конденсированной ДНК в покоящихся клетках (стресс голодания) посвящены следующие разделы.

II. 3.1. Бактериальные штаммы, генетически модифицированные штаммы, реагенты

В наших экспериментах использовались следующие бактериальные штаммы E. coli: 1 – K-12 MG 1655, дикий штамм; 2 – K-12 MG1655 Δdps, мутант Dps-ноль; 3 – Top10, дикий штамм; 4 – Top10/pBAD-DPS, мутант с оверэкспрессией белка Dps (Dps – DNA-binding protein from starved cells, связывающий ДНК белок из голодающих клеток); 5 – BL21-Gold(DE3)/pET-DPS, мутант с оверэкспрессией белка Dps. Штаммы бактерий 1 и 2 получены в Институте биофизики клетки ФИЦ “Пущинский научный центр биологических наук РАН”, Россия. Штаммы бактерий 3–5 были предоставлены проф. В.Н. Лазаревым из Лабораториея генной инженерии ФНИКЦ физико-химической медицины ФМБА, Москва, Россия (подробнее о бактериальных штаммах см. оригинальные публикации [22, 24, 25]).

Все реагенты приобретены у компании Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури) или VWR (Солон, Огайо, США), если не указано иное (подробнее см. оригинальные публикации [22, 24]). Процедура получения генетически модифицированных штаммов бактерии E. coli подробно описана в работах [24, 25]. Процесс накопления рекомбинантного белка DPS подробно описан в работе [25].

II. 3.2. Приготовление покоящихся клеток E. coli для различных штаммов

К-12 MG1655. Бактерии выращивали в течение 24 ч при 28 °C и встряхивании (140 об/мин) в колбах объемом 250 мл, содержащих 50 мл модифицированной среды M9.

Top10, К-12 МГ1655 Δdps. Бактерии выращивали в течение 24 ч при 28 °C и встряхивании (140 об/мин) в колбах объемом 250 мл, содержащих 50 мл среды LB.

Top10/pBAD-DPS. Бактерии выращивали в течение 24 ч при 28 °C и встряхивании (140 об/мин) в колбах объемом 250 мл, содержащих 50 мл среды LB или модифицированной среды M9, дополненной ампициллином с концентрацией 150 мкг/мл.

BL21-Gold(DE3)/pET-DPS. Бактерии выращивали в течение 24 ч при 28 °C и встряхивании (140 об/мин) в колбах объемом 250 мл, содержащих 50 мл модифицированной среды M9, дополненной 150 мкг/мл ампициллина с пониженным содержанием аммонийного азота. Клетки всех штаммов выдерживались при температуре 21 °C.

II. 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ

II. 4.1. Дифракции синхротронного излучения

Рентгеноструктурный анализ (РСА) – самый дорогой и трудоемкий экспериментальный метод, применяемый в химической физике биологических систем. В качестве источника излучения в рентгеновском диапазоне часто применяют синхротронное излучение, особенно для изучения малых кристаллов (с размерами от мкм до нм) и неупорядоченных объектов, таких как вирусы и клетки. Для визуализации структуры неупорядоченных биологических объектов используются последние достижения в биологии, химии, физике и математике.

В проведенных экспериментах на станции ID23-1 синхротрона ESRF (Гренобль, Франция) пучок рентгеновского излучения имел длину волны λ = 1.6799 Å, ширину апертуры – 10 мкм; время экспозиции для каждой дифракционной картины составляло 5 с, плоский детектор PILATUS 6M располагался на расстоянии 95 см за образцом по ходу пучка. Измерения проводили при температуре 100 K.

Схема эксперимента аналогична схеме двумерной порошковой дифракции с плоским детектором. Образец представляет собой ансамбль клеток бактерий. Перед использованием препараты наносили на специальную криопетлю. Для простоты будем полагать, что под действием стресса в клетках бактерий происходит кристаллизация конденсированной ДНК, размеры нанокристаллов находятся в пределах 200–400 нм [6]. Нанокристаллы нуклеоида вместе с клетками бактерий располагаются под произвольными углами к падающему пучку. Рассеянное излучение собирается на плоском детекторе. Случайная ориентированность кристаллитов в образце приводит к образованию гладких дифракционных колец вокруг оси, образованной падающим пучком, в отличие от дискретных точек, наблюдаемых при рассеянии на монокристалле. Угол между осью, образованной падающим пучком и дифракционным кольцом, называется углом рассеяния и обозначается как 2θ. Вектор рассеяния q определяется следующим образом:

Соответственно, “период кристаллической структуры” или разрешение, отвечающее данному углу рассеяния, вычисляется как

Наличие в образце периодических структур с периодом d приводит в эксперименте к повышенной интенсивности рассеяния, соответствующей данному периоду кристаллической структуры. Таким образом, исследование картин рассеяния на бактериальных клетках, позволит определить характерные пространственные периоды упорядоченных структур, возникающих в исследуемой системе.

II. 4.2. Просвечивающая электронная микроскопия

Ультратонкие срезы исследовали в просвечивающих электронных микроскопах JEM1011 и JEM-2100 фирмы Jeol (Japan) при ускоряющих напряжениях 80 и 200 кВ, соответственно, и увеличении 13000-21000×. Изображения регистрировали ПЗС-камерами (ПЗС – прибор с зарядовой связью) Ultrascan 1000XP и ES500W (Gatan, USA). Томограммы получали из полутолстых (300–400 нм) срезов с помощью программного обеспечения Jeol Tomography (Jeol, Japan). Угол наклона гониометра колеблется от –60° до +60° (с постоянным шагом в 1°). Серия изображений была совмещена с помощью Gatan Digital Micrograph (Gatan, USА), а затем восстановлена с помощью алгоритма обратной проекции в IMOD4.9. Трехмерные субтомограммы визуализировали в пакете UCSF Chimera. (Подробнее см. в [24].)

II. 4.3. Аналитическая электронная микроскопия

В этом методе использовали аналитический просвечивающий электронный микроскопе JEM-2100 (Jeol, Japan), оснащенный детектором светлого поля (SPEM) для сканирующей просвечивающей электронной микроскопии (Jeol, Japan), детектором темного поля (HAADF) с большим углом наклона (Gatan, USА), кремниевым дрейфовым детектором X-Max площадью 80 мм² (Oxford Instruments, Great Britan) и энергетическим фильтром GIF Quantum ER (Gatan, USА). Сбор спектров энергодисперсионного рентгеновского излучения (EDX) и элементный анализ проводили в программе INCA (Oxford Instruments, Great Britan). (Подробнее см. в [24].)

II. 5. Структурный ответ на стресс. Экспериментальные результаты

Одним из механизмов структурного ответа на стресс голодания является внутриклеточная кристаллизация ДНК со связывающим ДНК белком Dps с образованием нанокристаллов. Кристаллизация ДНК обеспечивает физическую защиту ДНК (благодаря плотной упаковке ДНК с белком в нанокристалле) от повреждений и потенциальную способность возобновления метаболической активности бактериальных клеток в свежей среде. Другие виды структурного ответа на стресс голодания изложены ниже в разд. II. 6.4.

II. 5.1. Дифракция синхротронного излучения

Эксперименты по измерению рассеяния синхротронного излучения на образцах, содержащих клетки бактерий E. сoli штамма BL21-Gold (DE3), трансформированного плазмидой pET-Dps и подвергнутого индукции повышенной экспрессии белка Dps [26, 27], показывают наличие дифракционных картин вида, изображенного на вставке рис. 1.

Рис. 1.

Зависимость интенсивности рассеяния от угла 2θ для образца штамма BL21-Gold(DE3) голодающих бактерий E. coli. На вставке изображена дифракционная картина для этого образца.

С целью детального анализа этих данных построены зависимости интенсивности рассеяния от угла рассеяния 2θ с помощью усреднения дифракционных 2D-картин по азимутальному углу. Обнаружены зоны повышенной интенсивности с периодами кристаллической структуры, равными приблизительно 90 и 45 Å, в отличие от контрольных образцов клеток, где областей повышенной интенсивности замечено не было (подробнее см. [26, 27]). Первый, широкий пик лежит в области d = 90–93 Å. Диаметр Dps додекамера равен ≈90 Å, поэтому этот пик может соответствовать расстоянию между слоями Dps. Второй пик при d = 45 Å может соответствовать второму порядку дифракции кристалла Dps–Dps или расстояниям между цепочками ДНК–ДНК в плотно упакованном ансамбле ДНК [27].

Приведенные на рис. 1 результаты дифракционных экспериментов свидетельствуют о наличии периодической упорядоченной организации (скорее всего, нанокристаллической) в нуклеоиде бактерий с указанными выше периодами.

II. 5.2. Просвечивающая электронная микроскопия

На рис. 2а показан срез томограммы клетки с нанокристаллической структурой. На вставке рис. 2а представлен результат фурье-анализа нанокристаллической области клетки, очерченной белой каймой. Результат фурье-анализа свидетельствует о наличии нанокристалла в этой области клетки [22]. Отфильтрованный кристалл ДНК–Dps изображен на рис. 2б. На вставке к этому рисунку изображен профиль интенсивности электронной плотности вдоль белой линии основного изображения. Черным цветом выделены плотности, видимо, соответствующие межслойным цепям ДНК [22]. Авторами работы [28] выдвинута гипотеза о том, что ДНК локализована между гексагонально упакованными слоями Dps в кристалле. Это означает, что характерное расстояние между цепочками ДНК–ДНК будет около 90 Å, а не 45 Å, как предполагалось в разд. II. 5.1. Вопрос о точной локализации и форме укладки ДНК в нанокристаллах в комплексе с Dps остается открытым. В электронно-микроскопических исследованиях ДНК напрямую не видна, поэтому предполагаемая конформация ДНК в нанокристаллах является гипотетической, к тому же она не подтверждается данными по дифракции (см. разд. II.5.1.).

Рис. 2.

а – Томограммы клетки (на вставке представлен результат фурье анализа нанокристаллической области клетки, очерченной белой каймой); б – отфильтрованный кристалл ДНК–Dps.

II. 5.3. Конденсация ДНК in vitro. Модельные системы

Экспериментальные данные, полученные с помощью методов дифракции синхротронного излучения и ПЭМ, не полностью согласованы друг с другом и не дают ответа на вопрос о конформации ДНК в нанокристаллических областях клетки. Для того чтобы найти ответ на этот вопрос, было решено действовать следующим образом. Мы предположили, что комплексы ДНК–Dps легко образуют кристаллы in vitro и что конформация ДНК в этих кристаллах идентична конформации ДНК во внутриклеточных кристаллах. Для изучения конформации ДНК в кристаллах in vitro были выбраны две методики: рентгеновская кристаллография, в которой в качестве источника используется синхротронное излучение [29], и электронная микроскопия [30].

Кратко опишем результаты, полученные методом макромолекулярной кристаллографии. Несмотря на малость размеров монокристаллов, низкую симметрию, относительно большие параметры решетки и слабые рефлексы, программные комплексы Mesh & Collect и ccCluster позволили определить структуру белка Dps [29] (оказалось, что ДНК, видимо, не образует упорядочные структуры в комплексе ДНК–Dps, и поэтому не видна (подробно см. ниже)). Структура депонирована в Protein Data Bank как 6QVX [29].

Для электронно-микроскопических исследований in vitro были выращены тонкие монокристаллические комплексы из небольшой ДНК (длиной 165 п.о.) с белком Dps. Были изучены проекционные структуры кристаллов Dps–Dps и Dps–ДНК [30]. Электронно-микроскопические исследования позволяют увидеть следы ДНК в тонких (2D) кристаллах ДНК–Dps. Чтобы объяснить противоречие с данными рентгеновской дифракции на массивных кристаллах, мы предположили, что тонкие 2D-кристаллы ДНК–Dps имеют увеличенную по сравнению с массивным кристаллом постоянную решетки, поэтому в тонких кристаллах есть пространство для ДНК.

Было проведено молекулярно-динамическое моделирование, с помощью которого изучались многослойные кристаллы белка Dps [30–33] и конденсация ДНК в трехмерных (3D) кристаллах. В многослойных 3D-кристаллах белка Dps за счет шарообразной формы его молекул формируются многочисленные каналы. Предположительно, в эти каналы может укладываться ДНК. Скорее всего, кристалл ДНК–Dps образуется постепенно, поэтому ДНК внутри кристалла располагается нелинейно, изгибаясь и проходя через каналы различных направлений. Для проверки этой гипотезы была построена модель участка геномной ДНК бактерии E. coli (513 п.о., ген dps). На основании проведенных молекулярно-динамических расчетов показано, что кристаллы белка Dps остаются стабильными в присутствии ДНК (рис. 3).

Рис. 3.

3D-кристаллы белка Dps бактерии E. coli. Участок 3D-кристалла Dps с изогнутой нитью ДНК внутри каналов – слева; конформация ДНК внутри кристалла – справа.

Образование изгибов ДНК внутри кристаллов ДНК–DPs не нарушает структуру ДНК. Это означает, что ДНК в кристаллах Dps может располагаться неупорядоченно, а не только так, как предложено в работ [28].

Таким образом, изучение кристаллов in vitro не оправдало ожиданий. Четкого ответа о конформации ДНК в монокристаллах ДНК–Dps получить не удалось. Остаются лишь гипотетические, к тому же несамосогласованные модели. Данные РСА и ПЭМ пока дают противоречивые, на первый взгляд, результаты. Возможно, что ДНК в кристаллах Dps располагается неупорядоченно.

II. 5.4. Альтернативные виды конденсации ДНК в покоящихся клетках

Рассмотрим другие конденсированные состояния ДНК в клетке в дополнение к внутриклеточной кристаллизации ДНК с Dps. Нами обнаружены в покоящихся клетках бактерии E. сoli три типа новых (по сравнению с растущими клетками) конденсированных структур ДНК–Dps Это нанокристаллические структуры ДНК (см. разд. II.5.1. и II.5.2.), жидкокристаллические структуры ДНК и свернутые нуклеосомоподобные структуры ДНК (см. рис. 4а, б и в соответственно).

Рис. 4.

Три типа конденсированных структур ДНК–Dps, обнаруженных в покоящихся клетках E. coli, голодающих в течение 7 мес: а – нанокристаллический; б – жидкокристаллический, в – свернутый нуклеосомоподобный тип; г – спектры ЭДС из выбранных областей (отмеченных цветными рамками на рис. a–в). Звездочкой отмечены положения пика S.

Энергодисперсионная спектроскопия (EDS) использовалась для обнаружения и позиционирования нужных элементов в выбранных областях клетки. Например, пик K_α (2.307 кэВ) серы отражает существование связывающего ДНК белка Dps (каждый белок Dps содержит 48 метионинов), а пик K_α (2.013 кэВ) соответствует фосфору в ДНК. Одновременное присутствие обоих пиков на спектрах структуры показывают образование комплекса ДНК–Dps.

Репрезентативные EDS-спектры представлены на рис. 4г. Относительный атомный состав различных областей образцов пропорционален интенсивности пиков EDS.

Примечательно, что жидкокристаллические структуры (рис. 5) были обнаружены в покоящихся бактериальных клетках E. coli [22] во всех их популяциях: как с геном dps, так и без него (Dps-null), т.е. в отсутствие белка Dps в клетке.

Рис. 5.

Жидкокристаллический ансамбль ДНК–Dps в покоящейся клетке E. Coli, штамма Top10/pBAD-DPS. На правом рисунке изображена схема расположения ДНК в клетке.

В некоторых клетках структура конденсированной ДНК напоминает холестерический жидкий кристалл [22]. Плотная упаковка ДНК в жидкокристаллической фазе снижает доступность молекул ДНК к различным повреждающим факторам, включая облучение, окислители и нуклеазы [6]. Отметим, что жидкокристаллический тип конденсации ДНК – это единственный случай (кроме тороидов ДНК), когда легко напрямую увидеть молекулы ДНК в конденсированной структуре.

Особый интерес представляет третий тип упорядоченной структуры, обнаруженный впервые в работе [22] в покоящихся клетках E. сoli: свернутая нуклеосомоподобная структура (см. рис. 6). Во всех изученных популяциях (кроме мутанта Dps-null), как с избыточной продукцией Dps, так и без нее, цитоплазма от 5 до 25% клеток наполнена множеством сферических структур (рис. 4в, рис. 6) со средним диаметром, равным 30 нм. Томографические исследования (рис. 6) продемонстрировали, что эти структуры не являются тороидами, описанными ранее [6, 34, 35], но представляют собой почти сферические образования. По аналогии с укладкой ДНК в эукариотах данный тип конденсации ДНК был назван нами “свернутой нуклеосомоподобной” структурой [22].

Рис. 6.

Морфология свернутой нуклеосомоподобной структуры ДНК–Dps в покоящихся клетках E. coli: а – изображение клетки; б – срез томограммы, выявляющий сферические ассоциаты Dps; в – 3D-модель сферических ассоциатов.

Элементный анализ показывает (рис. 4), что в спектре сферических агрегатов действительно присутствуют пики серы и фосфора, указывающие на присутствие ассоциатов ДНК–Dps [22]. В бактериальных клетках сферические образования молекул Dps (см. рис. 7) могут действовать аналогично гистонам, на которые накручивается ДНК (гистоноподобное поведение).

Рис. 7.

Схематическое образование свернутой нуклеосомоподобной структуры.

Макромолекулы ДНК могут также проходить сквозь сферические образования бусинок Dps, образуя “бусинки на нитке” (рис. 7). Для противодействия внешним стрессовым факторам эти образования должны располагаться на бактериальной ДНК достаточно плотно. Кроме того, как и в случае эукариотических клеток, где нуклеосомы сворачиваются, чтобы образовать фибриллы, которые, складываясь дальше, образуют хроматин хромосомы, бусинки на нити могут, путем множественного складывания образовывать компактную структуру, похожую на складчатую глобулу. Схематическое изображение образования свернутой нуклеосомоподобной структуры можно увидеть на рис. 7. Внешние молекулы Dps могут налипать на глобулу и дополнительно защищать ДНК [22, 36].

II. 5.5. О гетерогенности конденсации ДНК в покоящихся клетках E. coli

Существует давнее противоречие между представлениями о бактериальной многоклеточной системе как о совокупности одинаковых одноклеточных бактерий, идентичных друг другу и не взаимодействующих друг с другом, и о бактериальной культуре, рассматривающей микробную популяцию как многоклеточный организм. В последнем случае все клетки неидентичны друг другу, для них характерна физиологическая и морфологическая гетерогенность. Клетки взаимодействуют друг с другом в пределах организма. (Подробнее см. в работах [4, 37, 38].) Обнаруженные нами различные типы конденсированного состояния ДНК (см. табл. 1 в работе [11].) в изучаемых покоящихся клетках E. coli (или гетерогенность конденсации ДНК) дают дополнительные аргументы в пользу концепции, рассматривающей микробную популяцию как многоклеточный организм. Кроме того, данное наблюдение говорит в пользу вывода о том, что структура конденсированной ДНК соответствует долгоживущему промежуточному, частично (не полностью) равновесному состоянию. Данное наблюдение также свидетельствует в пользу того, что конденсация ДНК происходит в клетке по механизму, близкому к механизму образования складчатой (фрактальной) глобулы.

Таким образом, мы ожидали обнаружить новые структуры конденсированной ДНК в покоящихся клетках при стрессе голодания по сравнению с активно растущими клетками. Новые структуры конденсированной ДНК были действительно обнаружены. Это нанокристаллическая, жидкокристаллическая и свернутая нуклеосомоподобная структура конденсированной ДНК в покоящихся клетках E. coli.

III. 1. Приготовление анабиотических покоящихся клеток и микромуммий

Клетки E. coli штаммов Top10/pBAD-DPS и BL21-Gold(DE3)/pET-DPS выращивали, как описано выше [25], до стационарной фазы роста. Для получения анабиотических клеток в стационарной фазе через 7.5 ч после начала культивирования в клетки вносили спиртовой раствор 4-ГР до конечной концентрации 10^–4 М (концентрация этилового спирта составила 1%). В аналогичных условиях получали мумифицированные клетки, но при внесении спиртового раствора 4-ГР до конечной концентрации 10^–3 М. Клетки инкубировали в статическом режиме при температуре 23 °С в течение 1–3 сут, и готовили затем образцы для их изучения методами дифракции синхротронного излучения или электронно-микроскопических исследований.

III. 2. Исследование структурного ответа на действие 4-гексилрезорцина методом дифракции синхротронного излучения

III. 2.1. Изучение структуры анабиотических и мумифицированных клеток E. coli

На рис. 8 приведены кривые рассеяния синхротронного излучения для клеток, подверженных действию 4-ГР в концентрации 2 · 10^–4 М (кривая 1, синяя) и 10^–3 М (кривая 2, красная).

Рис. 8.

Зависимость интенсивности рассеяния от угла 2θ для клеток E. coli штамма BL21Gold (DE3). В стационарной фазе роста добавлялся 4-ГР в концентрации 2 · 10^–4 М – анабиотическое состояние клетки (кривая 1, синяя) и в концентрации 10^–3 М – мумифицированное состояние (кривая 2, красная). Кривая 3 (зеленая) – фаза активного роста. На вставках изображены дифракционные картины для анабиотического (вверху) и мумифицированного (внизу) состояний клеток.

Кривая рассеяния, полученная от растущей популяции клеток, в нашем случае бралась как реперная (контрольная) кривая, относительно которой рассматривались все наблюдаемые дифракционные эффекты, изображена на этом и ниже на рис. 9 зеленым цветом (кривые 3).

Рис. 9.

Динамика активации и прорастания анабиотических форм клеток E. coli, полученных под действием 4-ГР: а – кривая 3 (зеленая) – растущие клетки, кривая 1 (синяя) – клетки под действием 4-ГР в концентрации 10^–4 M (стационарная фаза роста); б – выдержка в течение 1.5 ч в питательной среде, в – 14 ч в питательной среде, г – 96 ч в питательной среде (стресс голодания); подробнее см. в тексте.

Интенсивность рассеяния от клеток E. coli в стационарной фазе роста, находящихся под воздействием 4-ГР в концентрации 2 · 10^–4 М (кривая 1 на рис. 8), по форме идентична кривой, полученной от клеток при стрессе голодания. На кривой видны пики, соответствующие разрешению в 44 и 22 Å, и широкий пик с максимумом интенсивности при разрешении 90 Å. Такое совпадение кривых наводит на мысль об идентичности структуры конденсированной ДНК внутри анабиотической и покоящейся (стресс голодания) клетки, и на то, что в образовании защитных кристаллических структур участвуют одни и те же белки.

При увеличении концентрации 4-ГР до 10^–3 М воздействие на клетки оказывается существенно отличным от ранее наблюдаемых. Такая концентрация 4-ГР приводит к образованию из клетки микромумии [39]. Кривая рассеяния от таких клеток (кривая 2 на рис. 8) имеет небольшой широкий пик с максимумом интенсивности, соответствующим разрешению в 77 Å. Пиков, соответствующих нанокристаллическим структурам, обнаруженным для анабиотического покоящегося состояния, на кривых рассеяния от мумифицированных клеток E. coli под воздействием 4-ГР при его концентрации 10^–3 М не наблюдается.

III. 2.2. Изучение динамики активации и прорастания анабиотических форм E. coli

На рис. 9а изображены кривые рассеяния от клеток E. coli штамма BL21-Gold, подверженных стрессу воздействия 4-ГР в концентрации 2 · 10^–4 M, и контрольной популяции того же штамма, находящейся в экспоненциальной стадии роста. Кривая рассеяния от клеток, подвергнутых стрессу воздействия 4-ГР, содержит острые брэгговские пики при разрешении 44 и 22 Å, кратные друг другу, и размытый широкий пик с максимумом интенсивности, соответствующий межплоскостному расстоянию в 88 Å. Для контрольной популяции наблюдается плавный монотонный спад интенсивности рассеяния при увеличении угла 2θ.

Следующий шаг эксперимента заключался в помещении анабиотических клеток E. coli в питательную среду. Рисунок 9б демонстрирует почти точное совпадения кривых рассеяния от контрольной популяции и от анабиотических клеток, помещенных в питательную среду и культивируемых в ней на протяжение 1.5 ч.

Далее проросшие клетки были выдержаны в течение 14 ч, и на рис. 9в уже начинает проявляться разница между кривыми рассеяния от контрольной популяции и от проросшей колонии. Сравнение кривых рассеяния от контрольной популяции и от проросшей колонии из анабиотических клеток возрастом 96 ч приведены на рис. 9г.

По прошествии 96 ч с момента помещения анабиотических клеток в питательную среду вновь появляются кристаллические образования, пики интенсивности рассеяния которых по положению оказываются идентичны пикам, полученным от клеток, соответствующих стрессу воздействия 4-ГР в концентрации 10^–4 M. Этот факт позволяет сделать вывод о том, что с точки зрения дифракционного эксперимента покоящееся анабиотическое состояние и покоящееся состояние, образующееся при стрессе голодания, идентичны по структуре.

Обратимость структурных изменений, происходящих внутри клетки под действием стресса воздействия 4-ГР в концентрации 10^–4 M указывают на то, что кристаллические образования, брэгговские пики которых мы наблюдаем на разрешении 88, 44 и 22 Å, участвуют в защите клеточного нуклеоида и сохраняют его в состоянии, пригодном для последующей регенерации.

III. 3. Исследование структурного ответа на действие 4-гексилрезорцина методом просвечивающей электронной микроскопии

На рис. 10 представлены данные, полученные методом ПЭМ, для клетки E. coli после внесения в культуру 4-ГР в концентрации 2 · 10^–4 M. Слева на вставке приведены данные фурье-преобразования для области с предполагаемым нанокристаллом, которые действительно показывают наличие нанокристаллического образования в выделенной области.

Рис. 10.

Морфология нанокристаллов ДНК–Dps в клетках E. coli под действием 4-ГР. Штамм E. coli Top10/pBAD-DPS, растущий на среде LB со сверэкспрессией Dps в фазе линейного роста, находящийся под действием 4-ГР в концентрации 10^–4 М на стационарной фазе роста. На вставке – фурье-преобразование от области с кристаллом. Справа – увеличенное изображение.

На рис. 11 представлены аналогичные рис. 10 данные, но после внесения в культуру 4-ГР в концентрации 10^–3 M) соответствующей состоянию микромумии.

Рис. 11.

Штамм E. coli Top10/pBAD-DPS, растущий на среде LB без сверхэкспрессии Dps в фазе линейного роста, находящийся под действием 4-ГР в концентрации 10^–3 М на стационарной фазе роста.

Данные ПЭМ не позволяют визуализировать какое-либо упорядоченное состояние в микромумиях. Этот результат находится в согласии с данными по дифракции синхротронного излучения (см. рис. 8).

Таким образом, оригинальные экспериментальные исследования позволяют сделать вывод о том, что:

1) 4-ГР является инициатором перехода клетки в анабиотическое и мумифицированное состояния;

2) покоящееся анабиотическое состояние по структуре сильно напоминает покоящееся состояние, полученное в результате голодания;

3) мумифицированное состояние (полное отсутствие метаболизма, но при сохранении формы клетки) сильно отличается по структуре от анабиотического. В мумифицированном состоянии не наблюдаются внутриклеточные нанокристаллические структуры, характерные для анабиотического покоящегося состояния;

4) требуются дальнейшие исследования обнаруженных эффектов как с помощью дифракции синхротронного излучения, так и с помощью ПЭМ для визуализации наличия упорядоченных структур в анабиотических покоящихся клетках и отсутствия этих структур в мумифицированном состоянии клеток.