Кинетика и катализ, 2019, T. 60, № 3, стр. 281-288
Взаимодействие глутатиона с пероксидом водорода. Кинетическая модель
К. М. Зинатуллина 1, 2, *, О. Т. Касаикина 1, В. А. Кузьмин 2, Н. П. Храмеева 2
1 ФГБУН Институт химической физики им. Н.Н. Семенова Российской академии наук
119991 Москва, ул. Косыгина, 4, Россия
2 ФГБУН Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук
119991 Москва, ул. Косыгина, 4, Россия
* E-mail: karinazinat11@gmail.com
Поступила в редакцию 04.10.2018
После доработки 07.12.2018
Принята к публикации 22.01.2019
Аннотация
Исследованы кинетические закономерности взаимодействия глутатиона (GSH) c пероксидом водорода (H2O2). Показано, что скорость расходования GSH нелинейно зависит от концентраций реагентов, процесс сопровождается появлением радикалов с относительно небольшой скоростью, составляющей доли процента от скорости расходования GSH. На основании полученных экспериментальных и литературных данных о реакциях GSH с H2O2 и тиильных радикалов предложена кинетическая модель сложного процесса взаимодействия GSH и H2O2 в водной среде при 37°С. Модель включает 15 квазиэлементарных реакций с соответствующими константами скорости, в том числе, формирование промежуточного комплекса GSH–H2O2 и его последующие реакции с образованием конечных продуктов. Компьютерное моделирование на основе разработанной модели удовлетворительно описывает особенности кинетики процесса в широком диапазоне концентраций реагентов.
ВВЕДЕНИЕ
Тиолсодержащие соединения играют важную роль в защите биологических систем от окислительных повреждений [1, 2]. Глутатион (GSH) – самый распространенный цитозольный тиол, относится к эндогенным биоантиоксидантам, синтезируемым непосредственно в живых организмах. GSH взаимодействует с гидроксильными радикалами, восстанавливает пероксид водорода, гидропероксиды, дисульфидные связи –S–S– и предотвращает окисление протеинов [3–9]. Концентрация GSH в биологических тканях составляет 0.1–10 ммоль л–1, что значительно выше концентраций других потенциальных биоантиоксидантов. В клетках GSH присутствует преимущественно в восстановленной форме (GSH). Активными формами кислорода (АФК) GSH окисляется в дисульфид (GSSG). Соотношение восстановленной и окисленной форм глутатиона ([GSH]/[GSSG]) в клетке является одним из важнейших параметров, который показывает уровень окислительного стресса [10–12]. Окислительный стресс характеризуется повышенным содержанием АФК и отражает дисбаланс между скоростями образования АФК и их утилизацией [13–15].
В живых организмах восстановление гидропероксидов осуществляется глутатиoн-пероксидазами – ферментами, специфичными для органов и тканей, которые используют GSH в качестве субстрата и эффективно восстанавливают не только H2O2, но и органические гидропероксиды, включая гидропероксиды мембранных полиненасыщенных жирных кислот. GSH участвует во многих физиологических процессах. В живых организмах он регулирует конформации белков и экспрессию генов с помощью реакций тиол-дисульфидного обмена, влияет на лимфоциты и иммунные реакции [16–19]. Изучается взаимосвязь GSH с различными заболеваниями, включая рак, нейродегенеративные болезни, синдром приобретенного иммунодефицита, старение, инфаркт, инсульт [19–24].
В последние десятилетия активно исследуется роль GSH в биохимии раковых клеток. Предполагается, что GSH является ключевым элементом в их защите от свободных радикалов и электрофилов и определяет чувствительность клеток к радиации и медикаментозной цитотоксичности. Множественную лекарственную и лучевую резистентность опухолевых клеток по сравнению с нормальными тканями связывают с повышенным в них уровнем GSH [22–25]. В литературе редокс-пара GSH/GSSG и H2O2 занимают центральное место в определении окислительно-восстановительного гомеостаза и редокс-сигнализации [26–31].
Согласно [2, 6, 32–35] взаимодействие GSH и H2O2 протекает стехиометрически в соответствии с уравнением:
Однако в ряде работ отмечается, что, несмотря на общую стехиометрию, соответствующую вышеуказанному уравнению, скорость процесса имеет первый порядок по концентрации GSH [2, 31, 36] и зависит от соотношения концентраций GSH и H2O2 [36]. Недавно [37, 38] мы обнаружили, что взаимодействие GSH и H2O2 сопровождается генерированием радикалов, скорость которого составляет доли процента от скорости расходования GSH, однако ее оказалось достаточно для инициирования цепной реакции GSH с ненасыщенными фенолами ресвератролом и кофейной кислотой [39, 40]. Скорости образования радикалов (Wi) были измерены методом ингибиторов с применением анионного полиметинового красителя А (пиридиновая соль 3,3'-ди-γ-сульфопропил-9-метилтиакарбо-цианинбетаина) в качестве акцептора. Этот водорастворимый краситель инертен по отношению к тиолам и пероксиду водорода, но активно и стехиометрически реагирует со свободными радикалами [41]. По расходованию А, используя метод конкурирующих реакций, можно проводить оценку антирадикальной активности антиоксидантов. В частности, так было получено значение krO2 = 0.84 × × 105 М–1 с–1 для константы скорости реакции GSH с пероксильным радикалом из ААРН (2,2'-азобис(2-амидинопропан) гидрохлорид) в водной среде при 37°С [38, 40].
В настоящей работе экспериментально исследованы концентрационные зависимости скорости расходования GSH и скорости образования радикалов в реакции GSH с H2O2. С помощью компьютерного моделирования с учетом полученных экспериментальных и имеющихся литературных данных о реакциях GSH, H2O2 и тиильных радикалов проведен анализ возможных путей неферментативного превращения GSH в GSSG. Построена кинетическая модель сложного процесса взаимодействия GSH и H2O2 (в водной среде при 37°С), которая хорошо описывает особенности кинетики процесса в широком диапазоне концентраций реагентов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глутатион (GSH), реактив Эллмана (5,5'-дитиобис-(2-нитробензойная кислота (DTNB), “Sigma-Aldrich”), пероксид водорода (“Усольхимпром”) применяли без предварительной очистки. Акцептором радикалов (А) служил анионный полиметиновый краситель (пиридиновая соль 3,3'-ди-γ-сульфопропил-9-метилтиакарбо-цианинбетаина, “Госниихимфотопроект”) [39]. В качестве реакционной среды использовали бидистиллированную и деионизированную воду (Direct-Q UV Millipore, 18 МОм см).
Реакции проводили при температуре 37°С в стеклянной термостатируемой ячейке, снабженной магнитной мешалкой. По ходу реакции из реакционного сосуда отбирали аликвоты (15 мкл), в которых анализировали содержание GSH методом Эллмана [42]. Для этого аликвоту добавляли к 3 мл натрий-фосфатного буферного раствора (PBS, рН 7.4), содержащего 0.1 мМ DTNB, и спектрофотометрически определяли содержание 2-нитро-5-тиобензойной кислоты (λmax = 412 нм, ε = 0.14 × 105 М–1 см–1), которая образуется при взаимодействии GSH с DTNB. Концентрацию базовых растворов H2O2 в отсутствие GSH контролировали йодометрическим методом.
Скорость генерирования радикалов (WA) измеряли методом ингибиторов по расходованию акцептора А, изменение концентрации которого регистрировали спектрофотометрически (ε = 0.77 × × 105 М–1 см–1 при λmax = 543 нм) непосредственно в термостатируемых кварцевых кюветах (1 см) спектрофотометра Ultraspec1100Pro (“Amersham plc”, США).
Погрешность определения концентраций реагентов и скоростей реакций не превышала 15%.
Анализ кинетических особенностей взаимодействия GSH с H2O2 и компьютерное моделирование кинетических кривых расходования реагентов осуществляли с использованием программы [43].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 1 представлены зависимости начальной скорости расходования GSH (WGSH) от концентраций GSH и H2O2 при разных соотношениях их концентраций (0.1 < [GSH]0/[[H2O2]0 < 2.5). Линейные анаморфозы этих зависимостей в логарифмических координатах (рис. 1б) свидетельствуют о дробных порядках скорости расходования GSH по концентрациям реагентов:
(1)
${{W}_{{{\text{GSH}}}}} \cong {\text{const}}\left[ {{\text{GSH}}} \right]_{0}^{{0.3}}\left[ {{{{\text{H}}}_{2}}{{{\text{O}}}_{2}}} \right]_{0}^{{1.2}},$Скорость инициирования радикалов измеряли методом ингибиторов по расходованию акцептора радикалов (А). На рис. 2а представлено изменение спектров поглощения А, зарегистрированных с интервалом 1 мин после введения акцептора в реакционную смесь. Из рис. 2б следует, что акцептор А не реагирует с GSH и H2O2, взятыми по отдельности, и расходуется только в реакции с радикалами, генерируемыми при их взаимодействии (кривая 3).
В табл. 1 представлены экспериментальные значения скоростей образования радикалов (WA) при разных концентрациях Н2О2 и GSH. Видно, что скорости образования радикалов на 2 порядка ниже WGSH. Зависимости WA от концентраций GSH и H2O2 также нелинейные, как и WGSH, и имеют дробные порядки по концентрациям реагентов, отличные от порядков в уравнении (1) для WGSH:
(2)
${{W}_{{\text{A}}}} \cong {\text{const }}{{\left[ {{\text{GSH}}} \right]}^{{{\text{0}}{\text{.75}}}}}{{\left[ {{{{\text{H}}}_{{\text{2}}}}{{{\text{O}}}_{{\text{2}}}}} \right]}^{{{\text{0}}{\text{.75}}}}}{\text{,}}$Таблица 1.
[GSH] = 5 мM; [A] = 7.2 мкМ | [H2O2] = 8.6 мM; [A] = 7.2 мкМ | ||||
---|---|---|---|---|---|
[H2O2], мM | WA × 109, М/с | [GSH], мМ | WA × 109, М/с | ||
эксперимент | расчетные данные | эксперимент | расчетные данные | ||
0.45 | 1 ± 0.1 | 0.88 | 1.0 | 1.3 ± 0.15 | 2.4 |
0.9 | 1.7 ± 0.2 | 1.62 | 2.5 | 3.8 ± 0.4 | 3.5 |
1 | 2.0 ± 0.2 | 1.8 | 5.0 | 6.2 ± 0.6 | 5.5 |
1.75 | 2.5 ± 0.25 | 2.52 | 6.9 | 7.3 ± 0.7 | 7.8 |
2 | 2.8 ± 0.3 | 2.8 | 8.0 | 9.85 ± 1.0 | 9.6 |
3.5 | 4.5 ± 0.45 | 4.25 | 10.0 | 10.0 ± 1.0 | 10.3 |
4.4 | 4.9 ± 0.5 | 4.95 | |||
8.8 | 5.6 ± 0.6 | 5.25 |
Дробные порядки по концентрациям основных реагентов, как правило, свидетельствуют о сложном многостадийном механизме процесса.
Для анализа кинетических особенностей взаимодействия GSH и Н2О2 мы использовали компьютерное моделирование по программе [43]. Кинетическую схему – совокупность квазиэлементарных реакций (табл. 2) – конструировали поэтапно с учетом следующих особенностей процесса: 1) относительное увеличение WGSH при [H2O2]0 > [GSH]0 и относительное уменьшение WGSH при [GSH]0 > [Н2О2] (рис. 1); 2) образование радикалов и нелинейные зависимости начальной скорости расходования А от начальных концентраций GSH и Н2О2; 3) основными продуктами превращения GSH и Н2О2 являются GSSG и H2O; 4) кинетическая схема с оптимизированными константами скорости должна описывать экспериментальные кривые расходования GSH и введенного в реакционную смесь акцептора А.
Таблица 2.
Реакции | Лит. ссылка* | Константы скорости | Значение ki, М–1 с–1 | |
H2O2 + GSH → К | (I) | [36] | k1 | 1.2 × 10–1 |
К → H2O2 + GSH | (II) | [36] | k2 | **1 × 10–6 |
К + GSH → GSSG + 2H2O | (III) | [36] | k3 | 4 × 10–3 |
К + GSH → GS• + GS• + 2H2O | (IV) | Настоящ. работа | k4 | 7 × 10–4 |
К → GSOH + H2O | (V) | Настоящ. работа | k5 | **2 × 10–3 |
GSOH + GSH → GSSG + H2O | (VI) | [2, 44] | k6 | 8 × 10–1 |
GSH + GSH → С | (VII) | [32] | k7 | 1.3 |
С → GSH + GSH | (VIII) | [32] | k8 | **9 × 10–4 |
GSH + H2O2→ GS• + OH• + H2O | (IX) | Настоящ. работа | k9 | 4 × 10–4 |
OH• + GSH → H2O + GS• | (X) | Настоящ. работа | k10 | 1 × 108 |
К + К → GSSG + 2H2O +H2O2 | (XI) | [36] | k11 | 9 × 10–2 |
С + H2O2 → GSSG + 2H2O | (XII) | Настоящ. работа | k12 | 1 × 10–3 |
GS• + GS• → GSSG | (XIII) | [45] | k13 | 1 × 109 |
GS• + A → B• | (XIV) | Настоящ. работа | k15 | 6 × 105 |
B• + B• → продукты | (XV) | Настоящ. работа | k16 | 2 × 108 |
Примечание. К – комплекс GSH–H2О2; С – комплекс GSH–GSH.
* Ссылки на работы, в которых упоминается соответствующая реакция. Оценка констант скоростей проведена только в [36], но для взаимодействия GSH с Н2О2 в фосфатном буфере.
Анализ литературных данных по кинетике взаимодействия GSH и Н2О2 показал следующее. В работах [2, 6, 31, 44] было предположено, что начальным продуктом реакции между тиолом и H2O2 является сульфеновая кислота (–SOH), которая далее быстро взаимодействует с тиолом с образованием дисульфида:
В [2] представлены кинетические характеристики реакции GSH и нескольких других тиолов с H2O2 в фосфатном буфере при 37оС и рН 7.4. Из экспоненциальных кинетических кривых расходования Н2О2 в избытке GSH была определена эффективная константа скорости, из зависимости которой от концентрации GSH (∼ мМ) получено значение бимолекулярной константы скорости реакции GSH и Н2О2, равное 0.9 М–1 с–1. В работе [36] была тщательно исследована кинетика расходования GSH и Н2О2 при их взаимодействии в нейтральном водном растворе при концентрациях порядка мМ и соотношении [GSH]0/[H2О2]0 в интервале от 0.2 до 2. На основании наблюдаемых дифференциальных спектров поглощения реакционной смеси в специально сконструированных кюветах и наблюдаемых особенностях расходования H2О2 авторы [36] предположили формирование промежуточного комплекса GSH–H2О2, в котором тиоловая группа –SH реагирует с реактивом Эллмана так же, как в свободном GSH, а H2О2 не определяется используемым в [36] титан-сульфатным методом. Мы не нашли в литературе данных об образовании радикалов при взаимодействии GSH и H2О2 и в нашей первой публикации по этому вопросу [37] предложили относительно простую схему, учитывающую предположение [36] о формировании комплекса GSH–H2О2:
Схема 1 .
В табл. 2 этой схеме соответствуют реакции (I)–(IV) (К – комплекс GSH–H2О2). Реакция (XIII) (k13 = 109 М–1 с–1 [45]) характеризует быструю рекомбинацию тиильных радикалов, а взаимодействию акцептора А с тиильными радикалами соответствуют реакции (XIV) и (XV). Но моделирование показало, что совокупности реакций (I)–(IV) и (XIII)–(XV) соответствуют линейные зависимости WGSH от начальных концентраций реагентов даже при вариации констант скоростей k1–k4 в довольно широком интервале значений. C учетом литературных данных о промежуточном образовании сульфеновой кислоты (GSOH) введены реакции (V) и (VI). Реакции (VII) и (VIII) – формирование димера глутатиона GSH + GSH $ \rightleftarrows $ $ \rightleftarrows $ GSH–GSH (C), в котором тиоловые группы определяются методом Эллмана, введены в модель для того, чтобы относительно уменьшить WGSH и WА в избытке GSH. Необходимо отметить, что в работе [32] при исследовании масс-спектров GSH методом электроспрея отрицательных ионов было показано, что в водном растворе наряду с ионами GSH обнаруживаются ионы димера, тогда как в фосфатном буферном растворе (0.1 М, рН ∼ 7) димер не регистрируется. Для того чтобы WGSH относительно увеличивалась в избытке Н2О2 (рис. 1, кривая 2), добавлена реакция (XII). Реакции (IV), (IX) и (X), в которых образуются тиильные радикалы, увеличивают скорость расходования акцептора (WA) и практически не влияют на WGSH.
Реакции (I)–(XIII) характеризуют механизм взаимодействия GSH с Н2О2. Реакции (XIV) и (XV) имеют место при добавках акцептора радикалов и вместе с остальными реакциями моделируют кинетические кривые расходования акцептора.
Представленная кинетическая модель с оптимизированными константами скоростей вполне удовлетворительно описывает экспериментальные концентрационные зависимости для WA и WGSH (рис. 1 и табл. 1), а также экспериментальные кинетические кривые расходования GSH и А в реакции GSH с Н2О2 (рис. 2 и 3).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
На основании экспериментально полученных концентрационных зависимостей скорости расходования GSH и скорости образования радикалов в реакции GSH с H2O2 (в водной среде при 37°С) разработана кинетическая модель взаимодействия GSH с H2O2, включающая 15 реакций с соответствующими оптимизированными для условий эксперимента значениями констант скоростей. Модель предусматривает образование комплексов GSH–H2O2 и GSH–GSH, что позволяет описать нетривиальные концентрационные зависимости скорости расходования глутатиона при избыточных концентрациях компонентов и относительно простой брутто-стехиометрии реакции, согласно которой дисульфид GSSG составляет не менее 95% прореагировавшего глутатиона.
Показано, что кинетическая модель удовлетворительно отображает не только концентрационные зависимости скоростей WGSH и WA, но и экспериментальные кинетические кривые. Окисление глутатиона сопровождается образованием радикалов, выход которых хотя и небольшой, но достаточный для инициирования радикально-цепных процессов.
Список литературы
Poole L.B. // Free Radical Biology and Medicine. 2015. V. 80. P. 148.
Winterbourn C.C., Metodiewa D. // Free Radic. Biol. Med. 1999. V. 27. P. 322.
Kheirabadi R., Izadyar M. // J. Phys. Chem. A. 2016. V. 51. № 120. P. 10108. https://doi.org/10.1021/acs.jpca.6b11437
Kritzinger E.C., Bauer F.F., du Toit W.J. // J. Agric. Food Chem. 2013. V. 2. № 61. P. 269. dx.doi.org/https://doi.org/10.1021/jf303665z
Saito S., Kawabata J. // J. Agric. Food Chem. 2004. V. 26. № 52. P. 8163.
Winterbourn C.C., Metodieva D. // Methods Enzymol. 1995. № 251. P. 81.
Gambuti A., Han G., Peterson A.L., Waterhouse A.L. // Am. J. Enol. Vitic. 2015. № 66. P. 411.
Wang Y., Qiao M., Mieyal J.J., Asmis L.M., Asmis R. // Free Radic. Biol. Med. 2006. № 41. P.775.
Schafer F.Q., Buettner G.R. // Free Radic. Biol. Med. 2001. V. 11. № 30. P. 1191.
Anderson M.E. // Chem. Biol. Interact. 1998. № 112. P. 1.
Penninckx M.J. // Enzyme Microb. Technol. 2000. № 26. P. 737.
Messens J., Collet J.F. // Antioxidants & Redox Signaling. 2013. V. 18. № 13. P. 1205. https://doi.org/ https://doi.org/10.1089/ars.2012.5156
Sies H. Oxidative Stress. L.: Academic Press. 1985. P. 1.
Sies H., Jones D.P. Encyclopedia of Stress. San Diego, CA.: Elsevier. 2007. V. 3. P. 45.
Reuter S., Gupta S.C., Chaturvedi M.M., Aggarwal B.B. // Free Radic. Biol Med. 2010. V. 49. № 11. P. 1603.
Hopkins F.G., Morgan E.J. // Biochem. J. 1936. V. 8. № 30. P. 1446.
Hopkins F.G., Morgan E.J. // Biochem. J. 1938. V. 3. № 32. P. 611.
Kroemer G., Reed J.C. // Nat. Med. 2000. V. 5. № 6. P. 513.
Wu G., Fang Y.Z., Yang S., Lupton J.R., Turner N.D. // J. Nutr. 2004. № 134. P. 489.
Conway J.G., Neptun D.A., Garvey L.K., Popp J.A. // Carcinogenesis. 1987. № 8. P. 999.
Townsend D.M., Tew K.D., Tapiero H. // Biomed. Pharmacother. 2003. V. 57. P. 145.
Estrela J.M., Ortega A., Obrador E. // Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 2006. V. 43. № 2. P. 143. https://doi.org/10.1080/10408360500523878
Toyokuni S. // Frontiers in pharmacology. 2014. V. 5. № 200. P. 1. https://doi.org/10.3389/fphar.2014.00200
Stavrovskaya A.A. // Biochemistry (Mosc). 2000. V. 1. № 65. P. 95.
Guo R., Yang G., Feng Z., Zhu Y., Yang P., Song H., Wang W., Huang P., Zhang J. // Biomater. Sci. V. 6. № 5. P. 1238. https://doi.org/10.1039/c8bm00094h
Albrecht S.C., Barata A., Großhans J., Teleman A.A., Dick T.P. // Cell Metabolism. 2011. № 14. P. 819. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2011.10.010
Weschawalit S., Thongthip S., Phutrakool P., Asawanonda P. // Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. 2017. № 10. P. 147.
Altıntaşa A., Davidsena K., Gardea C., Mortensena U.H., Brasen J.C., Sams T., Workman C.T. // Free Radical Biol. Med. 2016. № 101. P. 143.
Marinho H.S., Real C., Cyrne L., Soares H., Antunes F. // Redox Biol. 2014. № 2. P. 535.
Sies H. // Redox Biol. 2017. № 11. P. 613.
Winterbourn C.C., Hampton M.B. // Free Radic. Biol. Med. 2008. V. 5. № 45. P. 549.
Deutsch J.C., Santhosh-Kumar C.R., Kolhouse J.F. // J. Chromatogr. A. 1999. № 862. P. 161.
Petzolda H., Sadler P.J. // Chem. Commun. 2008. P. 4413. https://doi.org/10.1039/b805358h
Singh B., Das R.S., Banerjee R., Mukhopadhyay S. // Inorganica. Chimica. Acta. 2014. № 418. P. 51.
Chatgilialoglu C., Bowry V.W. // J. Org. Chem. 2018. V. 83. № 16. P. 9178. https://doi.org/10.1021/acs.joc.8b01216
Abedinzadeh Z., Gardes-Albert M., Ferradini C. // Can. J. Chem. 1989. № 67. P. 1247.
Зинатуллина K.М., Касаикина О.Т., Кузьмин В.А., Храмеева Н.П., Шапиро Б.И. // Изв. АН. Серия химич. 2017. № 7. С. 1300.
Зинатуллина К.М., Храмеева Н.П., Касаикина О.Т., Кузьмин В.А. // Изв. АН. Серия химич. 2018. № 4. С. 726. https://doi.org/10.1007/s11172-018-2129-0
Зинатуллина К.М., Храмеева Н.П., Касаикина О.Т., Шапиро Б.И., Кузьмин В.А. // Изв. АН. Серия химич. 2017. № 11. P. 2145. https://doi.org/10.1007/s11172-017-1995-1
Zinatullina K.M., Khrameeva N.P., Kasaikina O.T. // Bulg. Chem. Comm. 2018. V. 50. Special Issue C. P. 25.
Зинатуллина K.М., Касаикина О.Т., Кузьмин В.А., Храмеева Н.П., Шапиро Б.И. // Изв. АН. Серия химич. 2016. № 12. P. 2825.
Ellman G.L. // Arch. Biochem. Biophys. 1959. № 82. P. 70.
Sirick A.V., Pliss R.E., Rusakov A.I., Pliss E.M. // Oxidation Commun. 2014. V. 37. № 1. P. 37.
Nagy P., Ashby M.T. // J. Am. Chem. Soc. 2007. V. 129. № 45.P. 14082.
Hellwege K.-H., Madelung O., Martienssen W., Landolt-Bornstein // Springer-Verlag. 1983. № 13. P. 308.
Дополнительные материалы отсутствуют.
Инструменты
Кинетика и катализ