Кинетика и катализ, 2021, T. 62, № 6, стр. 678-691

ВВЕДЕНИЕ

Гидроксибензойные кислоты относятся к одной из наиболее многочисленных групп растительных фенольных соединений. Их важнейшими структурными элементами являются O–H-группа, соединенная с ароматическим циклом и ответственная за антиоксидантную активность вещества [1, 2], а также карбоксильная НООС-группа, способная в водных средах активировать фенольную группу за счет образования карбоксилат-ионов, более реакционноспособных, чем соответствующие молекулы [3, 4]. Из-за широкой распространенности этих соединений в пищевой, фармацевтической и парфюмерной продукции на растительной основе возникает необходимость в формировании модели для оценки и прогнозирования их активности. К факторам, способствующим развитию прогностических методологий, относятся как возможность “отсеивания” веществ с нежелательными свойствами на ранних этапах доклинических исследований, так и поиск новых антиоксидантов природного происхождения.

Ведущее место занимают полуэмпирические модели прогнозирования антирадикальной и антиоксидантной активностей веществ на основе качественной взаимосвязи “структура–реакционная способность” [5, 6] и количественной взаимосвязи “структура–реакционная способность” (QSAR, Quantitative Structure–Activity Relationships) [7, 8]. При прогнозировании свойств на качественном уровне проводится решение классификационной задачи (например, разделение на группы активных, малоактивных и неактивных антиоксидантов), тогда как при прогнозировании числовых значений свойств – решение регрессионной задачи. Для того чтобы найти соотношение между реакционной способностью (активностью) соединений и их строением, необходимо структурные особенности молекулы представлять в виде численных характеристик, которые получили название дескрипторов молекулярного строения (или просто дескрипторы) [9]. Тогда алгоритм QSAR дает возможность заменить поиск связей “структура–активность” анализом соотношений “дескрипторы–активность”. Подобный подход был реализован ранее в работе [10] применительно к растительным фенолам группы флавоноидов. Настоящее исследование является ее логическим продолжением, где на более многочисленной группе веществ были решены одновременно и регрессионная, и классификационная задачи прогнозирования.

Цель работы – создать новую регрессионно-классификационную модель прогнозирования антирадикальной активности (АРА) природных гидроксибензойных кислот на основе кинетической схемы их реакций с N- и O-центрированными радикалами в средах с физиологическим рН и системы двухфакторных регрессий “дескриптор–активность”.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В смешанном растворителе ДМСО–буфер в присутствии всех исследуемых НООСArOH (I–XX) происходит расходование DPPH^•, которое можно зафиксировать в приемлемом временном интервале при низком содержании буфера, до 20–25 об. %. Видно (рис. 1а), что при добавлении даже небольшого количества буфера в ДМСО, когда полярность среды изменяется незначительно, реакционная способность НООСArOH увеличивается.

Поскольку гидразильный радикал нерастворим в воде, а скорость исследуемой реакции при большом содержании буфера настолько велика, что не позволяет корректно оценить начальные участки кинетических кривых, то величину антирадикальной активности кислот в чистом буфере (${{k}_{{{\text{DPP}}{{{\text{H}}}^{ \bullet }}\left( {{\text{pH\;}}7} \right)}}}$) определяли из линейной зависимости (1) ln k_{ДМСО–буфер} от объемной доли буфера, вводимого в реакционную смесь:

где ω_ДМСО, (1 – ω_ДМСО) – доля ДМСО и буфера в смешанном растворителе.

Из углового параметра линейных регрессий (рис. 1б), полученных в координатах уравнения (1), рассчитывали константы скорости реакции ${{k}_{{{\text{DPP}}{{{\text{H}}}^{ \bullet }}\left( {{\text{pH\;}}7} \right)}}}$ в буфере с физиологическим рН. Отношение константы исследуемого вещества к константе для тролокса $\left( {\frac{{{{k}_{{{\text{DPP}}{{{\text{H}}}^{\centerdot }}\left( {{\text{pH\;}}\,7} \right)}}}}}{{k_{{{\text{DPP}}{{{\text{H}}}^{ \bullet }}\left( {{\text{pH\;}}\,7} \right)}}^{{{\text{Tx}}}}}}} \right)$ показывает, во сколько раз АРА изученного соединения выше активности реперного АО [25].

Вычисленные значения ${{k}_{{{\text{DPP}}{{{\text{H}}}^{ \bullet }}\left( {{\text{pH\;}}7} \right)}}}$ (табл. 1) указывают на то, что в нейтральной среде наиболее активны с гидразильным радикалом соединения групп ди- и тригидроксибензойных кислот (VII, X, XV) с тролоксовым эквивалентом ${{Т}_{{{\text{Е}}({\text{DPP}}{{{\text{H}}}^{ \bullet }})}}}~$больше 10. Низкие константы характерны для гидроксибензойных кислот с одной гидроксигруппой или О–Н-группами в мета-положении, а также для эфиров кислот (III, V, VI, IX, XIII, XVIII, XIX).

Примечательно, что при переходе от ДМСО к буферному раствору величины констант в среднем возрастают на 1–2 порядка, что обусловлено усилением диссоциации НООСArOH в водной среде. Из распределения молекулярной и ионных форм фенолкарбоновых кислот и их эфиров (рис. 2), рассчитанных методом QSPR в программе Marvin 18.14 на основе величин рК_а (табл. 1), видно, что в буферном растворе с рН 7.35 все фенолкарбоновые кислоты присутствуют в виде активных карбоксилат- и фенолят-ионов (эфиры находятся только в молекулярной и моноионной формах), способных реагировать со свободными радикалами [25]:

Антирадикальная активность фенолокислот, установленная в реакции со стабильным N-центрированным радикалом, была подтверждена при взаимодействии с лабильными О-центрированными радикалами, имитирующими пероксильные радикалы органических субстратов.

Согласно классическим представлениям метода хемилюминесценции [15], в реакции рекомбинации пероксирадикалов (АРOO^•), генерируемых при распаде азосоединения (в настоящей работе гидрофильный ААРН), может возникать ХЛ, которая в случае необходимости усиливается активатором свечения Rd6G:

где ${\text{М*}}$ – электронно-возбужденное состояние карбонильного соединения; $h\nu $ – квант света (хемилюминесценция). Нумерация констант скоростей реакций соответствует принятым в работах [15, 18].

Если считать, что ХЛ возбуждается лишь в реакции рекомбинации ${\text{АРO}}{{{\text{O}}}^{\centerdot }}$, то ее интенсивность (I₀) должна быть пропорциональна квадрату концентрации перекисных радикалов: I₀ ~ [APOO^•]². При добавлении в систему НООСArOH как акцепторов пероксирадикалов наблюдается уменьшение интенсивности ХЛ-свечения (I) по реакции:

При этом ХЛ в присутствии АО не ослабляется до нуля. Это, вероятно, обусловлено возбуждением ХЛ в каких-либо нерадикальных (молекулярных) реакциях (I_мол), на которые перехватчик радикалов НООСArOH не влияет. В отдельной серии экспериментов было установлено, что появление молекулярной ХЛ связано с воздействием активатора свечения. Относительную интенсивность I_мол определяли, когда в реакционной смеси присутствовал только растворитель и активатор свечения, при этом ее величина не превышала 0.18.

Константы скорости реакции (III) ${{k}_{7}}$ находили в фосфатном буфере при рН 7.35 методом, предложенным в работе [15], при условии низких скоростей инициирования (${{W}_{{\text{i}}}}$) и достаточно высоких концентрациях антиоксиданта. Метод расчета констант ${{k}_{7}}$ позволяет исключить влияние на кинетику реакции продуктов превращения НООСArOH, а также не требует знания величины константы скорости ${{k}_{6}}$, определение которой возможно только после детального изучения ХЛ реакций самого инициатора и образующихся при его распаде радикалов.

Расчет ${{k}_{7}}$ проводили в начальный момент времени, когда концентрация $^{ - }{\text{ООСAr}}{{{\text{O}}}^{\centerdot }}$ крайне мала и реакциями (VI), (V) можно пренебречь:

С учетом реакций (II), (III), (IV) изменение концентрации перекисных радикалов описывается дифференциальным уравнением:

В начальный момент, когда $\left[ {^{ - }{\text{ООСAr}}{{{\text{O}}}^{\centerdot }}} \right] \to 0$, последним членом в уравнении (2) можно пренебречь. Тогда его решение при условии ${{k}_{7}}{{\left[ {{\text{НООСArOH}}} \right]}_{0}} \gg \sqrt {{{k}_{6}}{{W}_{{\text{i}}}}} $ и после преобразований будет иметь вид [15]:

где ${{k}_{7}}{{\left[ {{\text{НООСArOH}}} \right]}_{0}} = k{\kern 1pt} '$ – угловой параметр линейной зависимости (3), равный константе скорости реакции первого порядка, с^‒1; ${{\left[ {{\text{НООСArOH}}} \right]}_{0}}$ – начальная концентрация гидроксибензойной кислоты, моль/л; $t$ – время, с.

Начальный участок ХЛ-кривой (рис. 3а) спрямляли (рис. 3б) в полулогарифмических координатах кинетического уравнения (3) первого порядка. С использованием линейного регрессионного анализа, проведенного в системе Statistica Demo 6.0 [26], из величины k' рассчитывали значения ${{k}_{7}}$, а затем по полученным в координатах уравнения (1) зависимостям вычисляли константы скорости реакции ${{k}_{{{\text{АРО}}{{{\text{О}}}^{ \bullet }}\left( {{\text{pH\;}}7} \right)}}}$ в буфере с физиологическим рН (рис. 3в).

В отличие от реакции с DPPH^•, АРА относительно тролокса ${{Т}_{{{\text{Е}}({\text{АРО}}{{{\text{О}}}^{ \bullet }})}}}$ всех исследованных веществ I–XX при взаимодействии с АPOO^• явно возрастает (табл. 1). Сравнительный анализ $\frac{{{{k}_{{{\text{DPP}}{{{\text{H}}}^{ \bullet }}\left( {{\text{pH\;}}7} \right)}}}}}{{k_{{{\text{DPP}}{{{\text{H}}}^{ \bullet }}\left( {{\text{pH\;}}7} \right)}}^{{{\text{Tx}}}}}}$ и $\frac{{{{k}_{{{\text{АРО}}{{{\text{О}}}^{ \bullet }}\left( {{\text{pH\;}}7} \right)}}}}}{{k_{{{\text{АРО}}{{{\text{О}}}^{ \bullet }}\left( {{\text{pH\;}}7} \right)}}^{{{\text{Tx}}}}}}$ свидетельствует о том, что модельная реакция с DPPH^• позволяет провести первичный отбор веществ с антирадикальными свойствами и выявить самые эффективные АО. Более чувствительна в этом плане реакция с цианоизопропанпероксилами, по величинам констант скоростей которой можно определить вещества с меньшей реакционной способностью. Так (табл. 1), с гидразильным радикалом активность выше или как у тролокса $\left( {\frac{{{{k}_{{{\text{DPP}}{{{\text{H}}}^{ \bullet }}\left( {{\text{pH\;}}7} \right)}}}}}{{k_{{{\text{DPP}}{{{\text{H}}}^{ \bullet }}\left( {{\text{pH\;}}7} \right)}}^{{{\text{Tx}}}}}} \geqslant 1} \right)$ проявили соединения I, II, VII, X, XV и XVII (эффективные антиоксиданты), а в реакции с АPOO^•$\left( {\frac{{{{k}_{{{\text{АРО}}{{{\text{О}}}^{ \bullet }}\left( {{\text{pH\;}}7} \right)}}}}}{{k_{{{\text{АРО}}{{{\text{О}}}^{ \bullet }}\left( {{\text{pH\;}}7} \right)}}^{{{\text{Tx}}}}}} \geqslant 1} \right)$ к указанным веществам добавились еще VIII и XVI (вещества со средней АРА). Для оставшихся фенолкарбоновых кислот в обоих случаях $\frac{{{{k}_{{{\text{DPP}}{{{\text{H}}}^{ \bullet }}\left( {{\text{pH\;}}7} \right)}}}}}{{k_{{{\text{DPP}}{{{\text{H}}}^{ \bullet }}\left( {{\text{pH\;}}7} \right)}}^{{{\text{Tx}}}}}}$ и $\frac{{{{k}_{{{\text{АРО}}{{{\text{О}}}^{ \bullet }}\left( {{\text{pH\;}}7} \right)}}}}}{{k_{{{\text{АРО}}{{{\text{О}}}^{ \bullet }}\left( {{\text{pH\;}}7} \right)}}^{{{\text{Tx}}}}}}$ меньше единицы (вещества с низкой АРА).

Таким образом, исследование кинетики реакции НООСArOH с N- и О-центрированными радикалами позволило сформировать кинетическую схему (реакции (I), (III)), позволяющую классифицировать природные фенолы на группы веществ с высокой, средней и низкой антирадикальной активностью.

Следующий этап разработки прогностической модели был направлен на выбор неэмпирической составляющей, то есть молекулярных дескрипторов фенолов, связанных с лимитирующей стадией механизма реакции.

Рассматривая гидроксибензойные как АО с фенольной функциональной группой, можно выделить несколько известных механизмов их антирадикального действия. В водных средах имеет место последовательный перенос электрона и протона. Если потеря протона предшествует лимитирующей стадии переноса электрона, то механизм именуется SPLET (Sequential Proton Loss–Electron Transfer) [25, 27 ], и в реакции непосредственно участвует ионизированная форма антиоксиданта ($^{ - }{\text{ООСAr}}{{{\text{O}}}^{ - }}$). Это характерно для щелочных сред c рН ≥ 7. Если потеря протона следует за медленной стадией переноса электрона, то имеет место механизм ET–PT (Electron Transfer–Proton Transfer) (также упоминается как SET–PT или SEPT) [27]. Тогда в реакции с радикалом принимает участие молекулярная форма фенольного антиоксиданта (НООСArOH и $^{ - }{\text{ООСArOH}}$), что характерно для водных сред с низким значением рН ≤ 3. В нейтральных средах, где присутствуют и молекулярная, и ионная формы антиоксиданта, будут реализовываться оба механизма, на что указывают исследования, проводимые в области изучения механизмов действия фенольных антиоксидантов [27, 28].

ET–PT- и SPLET-зависимым дескриптором является, как правило, потенциал ионизации молекулярной и ионной форм фенольного антиоксиданта соответственно [27, 28]. Поиск и расчет дескрипторов осуществляли путем комбинирования двух методов. Вначале методом QSPR в программе Marvin 18.14 определяли ионы, доля которых в системе при заданном рН достаточно велика, чтобы влиять на скорость лимитирующей стадии. Затем для выбранных ионов методом DFT рассчитывали значения потенциалов ионизации карбоксилат- ($P{{I}_{{^{ - }{\text{OOCArOH}}}}}$) и фенолят-ионов ($P{{I}_{{^{ - }{\text{OOCAr}}{{{\text{O}}}^{ - }}}}}$) кислот.

Между вычисленными SPLЕT- и ЕТ–РТ-зависимыми дескрипторами (табл. 1) и экспериментальными константами скоростей (${{k}_{{{\text{DPP}}{{{\text{H}}}^{ \bullet }}\left( {{\text{pH\;}}7} \right)~}}}$ и ${{k}_{{{\text{APO}}{{{\text{O}}}^{ \bullet }}\left( {{\text{pH\;}}7} \right)~}}}$) устанавливали одно- и двухфакторные линейные регрессионные зависимости (уравнения (4)–(7)), по коэффициентам корреляции которых видно, что влияние ${\text{\;}}P{{I}_{{^{ - }{\text{OOCArOH}}}}}$ (как ЕТ–РТ-зависимого дескриптора) соизмеримо с $P{{I}_{{^{ - }{\text{OOCAr}}{{{\text{O}}}^{ - }}}}}{\text{\;}}$ (как SPLЕT-зависимого дескриптора), а значит, в системе перенос электрона с фенолкарбоновой кислоты на радикал, вероятно, представляет собой комбинацию SPLET- и ЕТ–РТ-механизмов:

где n – число опытов; $\tilde {r}$ – полный парный коэффициент корреляции; F – критерий Фишера проверки значимости линейной регрессии; p – уровень значимости, при котором может быть принята нуль-гипотеза (о равенстве нулю истинного углового коэффициента уравнения регрессии). S_est – стандартная ошибка оценки (или стандартное отклонение ошибок предсказания) – является мерой точности величин, предсказанных по предложенной линейной модели.

Поскольку линейная связь между значениями потенциалов ионизации карбоксилат- и фенолят-ионов (табл. 1) не превышает 0.9 ($\tilde {r}{\text{\;}}$= 0.868), то разрешить сложившуюся двойственную ситуацию можно путем установления двухфакторных линейных регрессионных зависимостей АРА фенолов в реакции с DPPH^• и АРОО^• одновременно со SPLЕT- и ЕТ–РТ-зависимыми дескрипторами:

где r_part – частный коэффициент корреляции.

Как видно (уравнения (8), (9)) из значений множественного коэффициента корреляции ($\tilde {r}{\text{\;}}$ = = 0.984 и 0.978 ) и детерминации (${{\tilde {r}}^{2}}$ = 0.969 и 0.957), выбранная линейная модель с двумя факторами $P{{I}_{{{\text{ArOH}}\left( {^{ - }{\text{OOCArOH}}} \right)}}}$ и $P{{I}_{{{\text{Ar}}{{{\text{O}}}^{ - }}\left( {^{ - }{\text{OOCAr}}{{{\text{O}}}^{ - }}} \right)}}}$ более адекватно описывает экспериментальные данные в отличие от однофакторных регрессий, и вариация ${\text{ln\;}}{{k}_{{{\text{DPP}}{{{\text{H}}}^{ \bullet }}\left( {{\text{рН\;}}7} \right)}}}$ на 96.9 и 95.7% может быть обусловлена вариацией независимых переменных. Критерий Фишера F проверки значимости линейной модели регрессии высокий при уровне значимости p < 0.0000.

Обязательным элементом многофакторного анализа является вычисление частных коэффициентов корреляции ${{r}_{{{\text{part}}}}}$, отражающих степень линейной взаимосвязи между двумя переменными (зависимой и независимой), рассчитанную после устранения влияния всех других независимых переменных [26]. Установлено, что частный коэффициент корреляции уменьшается по сравнению с полным парным коэффициентом корреляции (уравнения (4), (5), (8) и (6), (7), (9)), а следовательно, один аргумент, который исключили из регрессии, не маскирует истинную взаимосвязь между функцией и вторым аргументом, оставшимся в линейной зависимости. Для выбранной и статистически аргументированной модели построен трехмерный график зависимости между параметром АРА фенолов и их квантово-химическими дескрипторами (рис. 4).

На этапе формирования прогностической модели двухфакторные регрессии объединяли в систему уравнений, связанную с кинетической схемой, которая реализуется в заданной реакционной среде. Полученная комплексная взаимосвязь в общем виде представлена на схеме 1 :

Схема 1 . Алгоритм скрининга природных фенольных антиоксидантов в средах с физиологическим рН на основе прогностической регрессионно-классификационной модели “дескриптор–активность”.

Такой подход в области исследования природных фенольных антиоксидантов был реализован впервые и позволил сформировать новую регрессионно-классификационную модель скрининга фенолкарбоновых кислот по АРА.

Рассмотрим принцип отбора антиоксидантов в рамках предложенной регрессионно-классификационной модели. Вначале проводят неэмпирический расчет химической структуры фенольного антиоксиданта в нейтральной водной среде. Затем по вычисленному механизм-зависимому дескриптору с помощью уравнений регрессии прогнозируют константу скорости реакции с различными радикалами. На первом этапе оценки применяют уравнение для расчета константы скорости реакции фенолов с радикалом ${\text{DPP}}{{{\text{H}}}^{ \bullet }}$. Если прогнозируемая величина константы больше, чем у эталонного АО тролокса, то исследуемое соединение относится к группе веществ с высокой активностью. На втором этапе антирадикальные свойства оставшихся соединений проверяют с О-центрированным радикалом ${\text{АРО}}{{{\text{О}}}^{\centerdot }}$ и по результатам сравнения с тролоксом фенолы разбивают еще на две группы – вещества со средней и низкой АРА.

Прогностическую способность предложенной модели проверяли на контрольной группе веществ, коими являются гидроксиацетофеноны – растительные фенолы, которые имеют близкую с фенолкарбоновыми кислотами структуру, не относятся к известным антиоксидантам и не входят в исследованную ранее группу веществ.

Следуя логике алгоритма (схема 1 ), по рассчитанным SPLET- и ET–PT-зависимым дескрипторам с помощью двухфакторного уравнения (8) были вычислены константы $k_{{{\text{DPP}}{{{\text{H}}}^{ \bullet }}\left( {{\text{pH\;}}7} \right)}}^{{{\text{расч}}}}$ скорости реакции AcArOH с ${\text{DPP}}{{{\text{H}}}^{ \bullet }}$ (табл. 2).

Для всех изученных AcArOH значения констант $k_{{{\text{DPP}}{{{\text{H}}}^{ \bullet }}\left( {{\text{pH\;}}7} \right)}}^{{{\text{расч}}}}$ низкие, они менее активны, чем эталонный антиоксидант – тролокс $\left( {{{{\left( {\frac{{{{k}_{{{\text{DPP}}{{{\text{H}}}^{ \bullet }}\left( {{\text{pH\;}}7} \right)}}}}}{{k_{{{\text{DPP}}{{{\text{H}}}^{ \bullet }}\left( {{\text{pH\;}}7} \right)}}^{{{\text{Tx}}}}}}} \right)}}_{{{\text{расч}}}}} < 1} \right)$, а значит, среди них нет фенолов с высокой АРА.

Тогда, согласно предложенной модели, исследуемая выборка в полном объеме переходит на второй этап скрининга в реакции с ${\text{АРO}}{{{\text{O}}}^{ \bullet }}$ (табл. 2). В этом случае прогнозируемая константа $k_{{{\text{АРО}}{{{\text{О}}}^{ \bullet }}\left( {{\text{pH\;}}7} \right)}}^{{{\text{расч}}}}$ значительно возрастает по сравнению с константой для гидразильного радикала $k_{{{\text{DPP}}{{{\text{H}}}^{ \bullet }}\left( {{\text{pH\;}}7} \right)}}^{{{\text{расч}}}}$, но по-прежнему ни один из представленных AcArOH по своей АРА не превышает таковую у тролокса. Только одно соединение XXV (2,5-гидроксиацетофенон) потенциально может проявить активность в два раза ниже, чем у тролокса. Результаты прогноза таковы, что с большой долей вероятности в средах с физиологическим рН гидроксиацетофеноны будут обладать низкой активностью в реакции со свободными радикалами. Примечательно, что прогностическая (табл. 2) и эмпирическая (табл. 1) оценки совпадают. Хорошие сходимости предсказанных и экспериментальных констант, а также низкие погрешности аппроксимации, не выше 10–12%, подтверждают высокую прогностическую способность предложенной регрессионно-классификационной модели.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе путем комбинирования методов DFT и QSPR предложены алгоритмы поиска и расчета механизм-зависимых дескрипторов молекулярных и ионных форм фенолкарбоновых кислот. Эмпирический параметр активности вещества, то есть константы скоростей реакций фенолов с радикалами, определяли по специально выбранным методологиям, повышающим точность измеряемых величин. Впервые получены готовые системы полуэмпирических уравнений, связанные с кинетическими схемами и позволяющие одновременно количественно оценить АРА природных фенолов и разделить их на группы веществ с разной реакционной способностью. При создании новой регрессионно-классификационной модели с высокой прогностической способностью использовали комплексный подход “среда–механизм–дескриптор–активность”, что позволяет решить одну из главных проблем методологии QSAR – учет данных о механизме проявления активности вещества, а также найти новые направления в области традиционного моделирования “структура–активность” и улучшить прогностическую способность получаемых моделей.