Коллоидный журнал, 2019, T. 81, № 6, стр. 683-689

1. ВВЕДЕНИЕ

На сегодняшний день актуальным является использование экологичных мицеллярных систем для удаления продукта in situ с целью увеличения конверсии в процессах биокатализа и биотрансформации [1, 2]. Использование двухфазных водных систем, содержащих неионные поверхностно-активные вещества (НПАВ), позволяет проводить процесс в “мягких” условиях, что особенно важно при экстракции биомолекул, чувствительных к органическим средам и высокой температуре. Отсутствие органических растворителей также создает благоприятную среду для большинства биокатализаторов. Биокаталитические реакции в некоторых мицеллярных системах исследованы, и, в частности, Вангом c сотр. [3, 4] показана необходимость комплексного изучения фазового поведения мицеллярных систем, а также кинетики протекающих в них биокаталитических реакций. Определение структурных характеристик самоорганизующихся систем в присутствии добавок разной природы важно для улучшения предсказаний термодинамических моделей, таких как COSMOmic [5].

НПАВ, водные растворы которых в определенном концентрационно-температурном интервале характеризуются наличием области помутнения, широко применяются для экстракции и очистки сточных вод от ионов металлов, белков, биоматериалов, органических веществ, включая токсичные ароматические [6, 7], методом экстракции в точке помутнения (“cloud-point extraction”).

Весьма перспективными представителями обозначенного круга НПАВ являются этоксилированные Tergitol NP-7 и Triton X-114 (рис. 1). Двухфазные водные системы, содержащие указанные НПАВ, изучены в качестве сред для проведения модельной целевой биореакции ферментативного гидролиза пенициллина G (Pen G) [3] с образованием 6-аминопенициллановой и фенилуксусной кислот (APA и PAA соответственно, рис. 1).

Рис. 1.

Структурные формулы НПАВ Tergitol NP-7 (а) и Triton X-114 (б), а также веществ – участников биореакции: PAA (в), АРА (г) и Pen G (д).

Для оптимального проектирования промышленных процессов с участием названных НПАВ необходимы надежные экспериментальные данные об агрегативном и фазовом поведении их водных и водно-солевых (буферных) растворов при варьировании температуры и pH среды, а также в присутствии биодобавок разной природы.

Нами систематически исследованы структурно-термодинамические характеристики растворов Tergitol NP-7 и Triton X-114 в среде фосфатного буфера при температуре 25 и 37°C: определены значения критической концентрации мицеллообразования (ККМ) и числа агрегации (N_агр). Отметим, что температура 37°C, с одной стороны, является физиологической, а с другой – обеспечивает наибольшую скорость ферментативной реакции гидролиза Pen G. Таким образом, изучение биохимических объектов при данных условиях представляет практический интерес.

Определение характеристик агрегации проведено как для псевдобинарных систем НПАВ–растворитель, так и для более сложных смесей, содержащих добавки Pen G, а также органических кислот APA и PAA. Полученные новые данные о влиянии этих добавок на рассматриваемые характеристики сопоставлены с данными о температуре помутнения изучаемых растворов.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.2. Методы исследования

2.2.1. Метод тензиометрии. Для определения ККМ измеряли поверхностное натяжение σ серии растворов с различной концентрацией ПАВ с помощью тензиометра SIGMA 702 (KSV Instruments, Финляндия). Непосредственно определяемой в ходе эксперимента величиной является усилие в момент отрыва платинового кольца Дю Нуи от поверхности жидкости. Для каждой концентрационной точки проводили по три параллельных опыта, результаты которых усредняли. Относительная погрешность измерения не превышала 0.4%.

Полученные значения поверхностного натяжения строили в виде зависимости от натурального логарифма концентрации ПАВ [10]. В домицеллярной области увеличение концентрации ПАВ в растворе вызывает значительное уменьшение σ, по достижении ККМ значение σ практически не изменяется. Если данные о поверхностном натяжении в системе в областях ниже и выше ККМ аппроксимировать линейными зависимостями, то пересечение полученных прямых можно трактовать как величину, соответствующую ККМ. Погрешность определения ККМ методом тензиометрии составила ±5%.

2.2.2. Спектрофлуориметрический метод определения ККМ. С целью проверки надежности данных о ККМ, получаемых методом тензиометрии, для некоторых из рассматриваемых систем значения ККМ были независимо определены методом флуоресцентного зонда [11, 12]. В качестве такового был выбран пирен, который эффективно солюбилизируется в ядрах мицелл. Готовили серию растворов с различной концентрацией НПАВ и постоянной, гораздо меньшей, концентрацией пирена. В ходе эксперимента измеряли спектры флуоресценции пирена для каждого из растворов и анализировали соотношение интенсивностей пиков 1 и 3 в спектре (рис. 2), характеризующее микрополярность среды, в которой находится зонд. Погрешность определения ККМ составила ±10%.

Рис. 2.

Пример зависимости соотношения пиков 1 и 3 в спектре флуоресценции пирена от концентрации Triton X-114 при температуре 37°C.

2.2.3. Спектрофлуориметрический метод определения чисел агрегации. Для определения чисел агрегации (N_агр) НПАВ в изучаемых системах также использовалась общепринятая разновидность флуоресцентной спектроскопии [11, 12]. Основа методики заключается в изучении закономерности тушения люминесценции вещества-люминофора вводимым в систему соединением – тушителем люминесценции. В качестве люминофора также был взят пирен, а в роли тушителя выступал CPyrBr.

Данный метод позволяет успешно определять N_агр, только если выполняются следующие условия: 1) люминофор и тушитель эффективно солюбилизируются мицеллами, 2) скорость поглощения люминесцентного излучения тушителем значительно выше той, с которой происходит затухание люминесценции, 3) известно распределение молекул люминофора и тушителя по мицеллам (на практике пользуются распределением Пуассона). Выбранные нами люминофор и тушитель удовлетворяют перечисленным условиям.

Исследуемая система содержит мицеллы (M), люминофор и тушитель (Q). При выполнении третьего из указанных выше условий для соотношения интенсивностей люминесценции в присутствии Q и в его отсутствие (I/I₀) можно записать:

(1)

${I \mathord{\left/ {\vphantom {I {{{I}_{0}}}}} \right. \kern-0em} {{{I}_{0}}}} = {\text{exp}}\left( {--{{\left[ {\text{Q}} \right]} \mathord{\left/ {\vphantom {{\left[ {\text{Q}} \right]} {\left[ {\text{M}} \right]}}} \right. \kern-0em} {\left[ {\text{M}} \right]}}} \right).$

Простота этого выражения определяется допущением, что люминесцируют только те молекулы зонда, которые находятся в свободных от тушителя мицеллах.

Концентрация мицелл [M] связана с концентрацией ПАВ [ПАВ] и средним числом агрегации, N_агр, следующим образом:

(2)

$\left[ {\text{M}} \right] = {{\left( {\left[ {{\text{ПАВ}}} \right] - \left[ {{\text{свободный мономер}}} \right]} \right)} \mathord{\left/ {\vphantom {{\left( {\left[ {{\text{ПАВ}}} \right] - \left[ {{\text{свободный мономер}}} \right]} \right)} {{{N}_{{{\text{агр}}}}}}}} \right. \kern-0em} {{{N}_{{{\text{агр}}}}}}},$

где концентрация свободных мономеров ПАВ, находящихся в равновесии с мицеллярными агрегатами, приблизительно равна ККМ. Комбинируя выражения (1) и (2), получаем

(3)

$\ln ({{{{I}_{0}}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{I}_{0}}} I}} \right. \kern-0em} I}){\text{ }} = {\text{ }}[{\text{Q}}]{{{{N}_{{{\text{агр}}}}}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{N}_{{{\text{агр}}}}}} {\left( {\left[ {{\text{ПАВ}}} \right]--{\text{ККМ}}} \right)}}} \right. \kern-0em} {\left( {\left[ {{\text{ПАВ}}} \right]--{\text{ККМ}}} \right)}}.$

Примеры спектров флуоресценции пирена в зависимости от концентрации тушителя представлены на рис. 3.

Рис. 3.

Спектры флуоресценции пирена в водных растворах Triton X-114 в отсутствие тушителя (1) и по мере увеличении его концентрации (2–5) при 25°C.

Для нахождения N_агр строят зависимость ln(I₀/I) от [Q]/([ПАВ] – ККМ), характерный пример которой представлен на рис. 4. Тангенс угла наклона полученной линейной зависимости соответствует числу агрегации ПАВ в исследуемой системе, что следует из уравнения (3).

Рис. 4.

Зависимость отношения интенсивностей флуоресценции пирена без тушителя (I₀) и в его присутствии (I) от приведенной концентрации тушителя (C_CPyBr/(С_ПАВ – ККМ)) в водных растворах Triton X‑114 при 37°С.

Спектрофлуориметрические эксперименты по определению ККМ и чисел агрегации выполнены с использованием спектрофлуориметра FLU-ORAT-02 PANORAMA (Люмэкс, Россия).

2.2.4. Определение температуры помутнения растворов. Температуру помутнения (CP) определяли визуальным политермическим методом в ячейке, снабженной магнитной мешалкой и термостатируемой с помощью водяного циркуляционного термостата LOIP LT-400 (ЛОИП, Россия), обеспечивающего точность поддержания температуры ±0.01°C с погрешностью не более ±0.02°С.

Приготовленные растворы медленно нагревали (0.1 град/мин); за CP принимали температуру, при которой исследуемый раствор становился непрозрачным. Эксперимент повторяли трижды для каждого раствора. Погрешность определения CP составила 0.1°С.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние биоорганических добавок (PAA, APA, Pen G) на температуру помутнения растворов Triton X-114 в воде и в 50 мМ буферном растворе KH₂PO₄/K₂HPO₄ с pH 4.3 изучали при концентрации этого НПАВ, равной 4 мас. %. Концентрация добавленного вещества составляла 10 и 50 мМ в случае PAA и Pen G и 10 мМ – в случае APA (табл. 1). Значения CP растворов без/с изучаемыми добавками определяли также при значениях pH 2.7 и 6.8 (табл. 2).

При рассмотрении влияния природы добавок (PAA, APA или Pen G) на CP водных растворов Triton X-114 при pH 4.3 (табл. 1) отмечены следующие эффекты: значение CP в присутствии гидрофильной добавки APA (pI = 4.3) не изменяется (22.5°C), тогда как при добавлении Pen G имеет место существенное повышение CP. При этом увеличение концентрации Pen G усиливает данный эффект. Повышение CP водных растворов Triton X-114 в присутствии Pen G показано в работе [4] для некоторого интервала концентрации этого НПАВ. Как известно, изменения CP растворов НПАВ существенно зависят от природы и концентрации добавок в силу специфики роли последних (от со-ПАВ до сорастворителя) [13].

Присутствие 10 мМ PAA (pK_a 4.3) иначе влияет на CP растворов Triton X-114 – наблюдается значительное понижение CP как водного, так и буферного раствора с pH 4.3 (“высаливающее” действие) (табл. 1, 2). При этом в фосфатном буферном растворе (pH 6.8) высаливающее действие диссоциированной формы PAA не обнаружено. Значения CP растворов, содержащих 50 мМ PAA, – ниже 14°C для всех исследуемых систем.

Важно отметить аналогичное влияние изучаемых биоорганических добавок на CP водного раствора Triton X-114 (табл. 2). Кроме того, та же картина наблюдается для водных растворов, содержащих 4 мас. % Tergitol NP-7 [14].

В работе [14] получены данные о значительном влиянии pH на коэффициент распределения PAA (важнейшую характеристику эффективности биоэкстракции этого компонента) между жидкими фазами водной двухфазной системы, содержащей Tergitol NP-7, при 37°C. Авторами показано, что коэффициенты распределения растворенных биокомпонентов APA и Pen G слабо возрастают при увеличении pH. В связи с этим интерес представляет изучение агрегативных характеристик Tergitol NP-7 при “предельных” значениях pH 2.7 и 6.8.

На рис. 5 представлены результаты измерения поверхностного натяжения растворов Tergitol NP-7 при 37°C в фосфатном буфере (C = 50 мМ) при pH 2.7 и 6.8.

Рис. 5.

Данные о поверхностном натяжении растворов Tergitol NP-7 в буфере с pH 2.7 (a) и с pH 6.8 (б) при 37°C.

На рис. 6 приведены данные о поверхностном натяжении растворов Triton X-114 при 37°C в фосфатном буфере (C = 50 мМ) при pH 4.3 в присутствии различных добавок.

Рис. 6.

Данные о поверхностном натяжении растворов Triton X-114 при 37°C и pH 4.3 в отсутствие добавок (a) и в присутствии 10 мМ APA (б), PAA (в) или Pen G (г).

Определенные в настоящей работе значения ККМ и числа агрегации НПАВ в растворах на основe Triton X-114 и Tergitol NP-7 представлены в табл. 1 и 3 соответственно. Значения ККМ, полученные методом флуориметрии, несколько больше определенных методом тензиометрии, но сопоставимы с ними. Последний метод, благодаря большей точности, позволяет выявить небольшие по величине температурные эффекты, а также тенденции влияния солевого фона и значения pH среды на величину ККМ.

Для систем, содержащих Tergitol NP-7, с понижением pH величина ККМ уменьшается, что можно объяснить усилением гидрофобного эффекта с ростом полярности среды (табл. 3). Повышение температуры, напротив, способствует увеличению ККМ, что характерно для многих этоксилированных НПАВ. При 37°C влияние электролита менее выражено, чем при 25°С.

Добавка APA способствует небольшому повышению ККМ Triton X-114 в фосфатном буфере с pH 4.3 (табл. 1). Поскольку APA характеризуется изоэлектрической точкой pI = 4.3, полярность среды в ее присутствии практически не изменяется, что и приводит к слабо выраженному эффекту увеличения ККМ.

В присутствии PAA (pK_a = 4.3) или Pen G (pK_a = = 2.5) ионная сила и полярность среды являются наиболее высокими (в пределах круга систем, рассматриваемых в работе), в результате чего наблюдается более значительное снижение ККМ Triton X-114, особенно, при больших концентрациях этих добавок. Так, в присутствии 50 мМ PAA получено самое низкое значение ККМ. Большее влияние PAA по сравнению с Pen G обусловлено, в силу достаточной гидрофобности этой кислоты (коэффициент распределения октанол/вода lg P ^ow = = 1.41), более глубоким проникновением ее молекул в мицеллы НПАВ [15].

В целом, влияние биоорганических добавок на ККМ аналогично их влиянию на температуру помутнения исследуемых растворов − имеет место значительное изменение рассматриваемых характеристик в присутствии PAA или Pen G и минимальный эффект при добавлении APA.

Другую важную характеристику агрегации, N_агр, определяли при фиксированной концентрации ПАВ, равной 2.5 ККМ (табл. 1, 3).

Для Tergitol NP-7 число агрегации значительно меньше (его значения составляют от 7 до 9) и не зависят от pH и температуры (табл. 3). Полученные невысокие значения N_агр Tergitol NP-7 характеризуют указанное НПАВ как менее перспективное для эффективной экстракции в точке помутнения [14].

Полученные значения N_агр Triton X-114 в исследованных системах лежат в диапазоне от 30 до 60 (табл. 1). В присутствии 50 мМ PAA и Pen G определить N_агр не удалось из-за тушения люминесценции пирена.

В работе [12] приводятся данные о числе агрегации Triton X-114, полученные в интервале концентрации этого НПАВ 2.5–40 мМ, и показано, что значение N_агр в таких разбавленных растворах не зависит от концентрации Triton X-114. Данные нашей работы о числе агрегации Triton X-114 в воде находятся в хорошем согласии с литературными данными (значения N_агр составляют 71 и 68 соответственно). В буферном растворе при pH 4.3 число агрегации Triton X-114 составило 43 ± 4, а в присутствии 10 мМ РАА – 31 ± 3. Влияние других биоорганических добавок на значение N_агр незначительно.