Коллоидный журнал, 2020, T. 82, № 1, стр. 89-95

Изменения размеров и дзета-потенциала фосфатидилхолиновых липосом с включенными нутрицевтиками в процессе их инициированного окисления

Н. Н. Сажина 1*, И. Г. Плащина 1, М. Г. Семенова 1, Н. П. Пальмина 1

1 Институт биохимической физики им. Н.М. Эммануэля РАН
119334 Москва, ул. Косыгина, 4, Россия

* E-mail: Natnik48s@yandex.ru

Поступила в редакцию 21.03.2019
После доработки 04.07.2019
Принята к публикации 12.07.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

Липосомы из фосфатидилхолина (PC) широко используются как модель биомембран живых клеток для изучения в них различных биохимических процессов, в частности перекисного окисления липидов (ПОЛ), и воздействия на окисление различных веществ. В работе методом динамического рассеяния света исследована динамика изменения размеров и ζ-потенциала липосом из соевого PC в процессе их инициированного 2.2'-азобис(амидинопропан) дигидрохлоридом окисления при температуре 37°С. Изучено влияние на эти параметры включения в липосомы α-линоленовой кислоты и эфирного масла гвоздики, а также капсулирования липосом казеинатом натрия. Установлено, что в процессе окисления средний размер PC-липосом увеличивается на 6–7%, однако корреляции между их размером и накоплением продуктов ПОЛ не наблюдается. Абсолютное значение отрицательного ζ-потенциала возрастает к концу окисления в 3 раза. Включение в липосомы α-линоленовой кислоты значительно изменяет динамику изменения их размеров и ζ-потенциала. Присутствие в липосомах эфирного масла гвоздики снижает накопление диеновых конъюгатов в процессе окисления и стабилизирует размеры и ζ-потенциал к концу окисления и для исходных липосом, и для липосом с α-линоленовой кислотой. Капсулирование липосом казеинатом натрия приводит к стабильности размеров и ζ-потенциала образующихся комплексных структур в ходе окисления.

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время липосомы из фосфатидилхолина (PC) широко используются в качестве моделей биомембран для изучения в них различных биохимических процессов, в частности перекисного окисления липидов (ПОЛ), и воздействия на этот процесс различными субстанциями [1]. Процессы ПОЛ, при которых образуются свободные радикалы, пероксиды и другие промежуточные интермедиаты, влияют на многие свойства и функции мембраны клетки, поскольку изменяются состав и структурное состояние липидов мембран. Полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) фосфолипидов мембран подвергаются значительной модификации в процессе окисления, что приводит к деградации ацильных цепей фосфолипидов. Изменяются физико-химические свойства мембран (текучесть, проницаемость, активность протеинов и др.) и их важные функции, что приводит к старению клеток и появлению различных заболеваний [2, 3].

На кинетику ПОЛ в липосомах существенно влияет структура ее липидных компонентов и их способность к агрегированию, что может приводить к изменению размеров и дзета-потенциала (поверхностного заряда) липосом в процессе ПОЛ [4]. В свою очередь, изменения заряда липосом могут влиять на кинетику их окисления [5, 6]. Различные вещества, влияющие на ПОЛ, также могут изменять структуру, размеры и ζ-потенциал липосом. Поэтому, изучая кинетику инициированного окисления липосом по накоплению первичных продуктов окисления (диеновых конъюгатов – ДК), вводя в липосомы ингибирующие и усиливающие ПОЛ агенты, определяя одновременно их размеры и ζ-потенциал, можно определить эффективность действия этих агентов и их влияние на физико-химические параметры липосом в процессе окисления.

Была выполнена серия работ [711] по исследованию воздействия различных растительных антиоксидантов (AO) на автоокисление липосом из соевого PC, в том числе содержащих альфа-линоленовую кислоту (ALA), при температуре 25°C. Установлено, что наибольшую ингибирующую активность проявляет эфирное масло гвоздики (ЭМГ) [10]. Помимо АО для защиты PC-липосом от окисления использовали их капсулирование различными биополимерами, в частности казеинатом натрия (Cas-Na) [79], что не только предохраняет липосомы от окисления, но и повышает их функциональность и растворимость в водной среде. Методом динамического рассеяния света (ДРС) были определены размеры и ζ-потенциал липосом в присутствии указанных веществ при комнатной температуре.

В [12] в продолжение этих работ были исследованы кинетика инициированного 2.2'-азобис(амидинопропан) дигидрохлоридом (AAPH) окисления липосом из соевого PC, в том числе в присутствии ALA, при температуре 37 и 60°C и ингибирование окисления этих липосом включением в них ЭМГ и путем капсулирования с помощью Cas-Na. В процессе окисления также определяли средний размер и ζ-потенциал липосом. Целесообразно было установить взаимосвязь между изменениями этих параметров и увеличением концентрации ДК в ходе окисления, а также изучить влияние на этот процесс веществ, ингибирующих и усиливающих окисление.

Аналогичное исследование изменения размеров и ζ-потенциала липосом из соевого лецитина при их инициированном AAPH окислении при T = 40°C в течение 28 ч было выполнено в работе [13] при изучении влияния состава липосом на ПОЛ. В качестве добавок в липосомы использовали холестерин, стеарат холестерина и их смесь. Параллельно наблюдали за размерами и ζ-потенциалом липосом, не подвергавшихся окислению (хранившихся при 40°C). В течение времени наблюдения размеры и ζ-потенциал таких “контрольных” липосом изменялись незначительно (в пределах ошибки измерений), в то время как окисляющихся липосом разного состава – достаточно сильно. При этом если изменение размеров зависело от ингибирующего действия добавок, то существенное (до 10 раз) увеличение отрицательных значений ζ-потенциала к концу окисления наблюдалось для всех липосомальных композиций. По мнению авторов [13], это обусловлено изменениями при окислении конфигурации отрицательно заряженных полярных головных групп молекул фосфолипида и, как следствие, их ориентации вблизи поверхности бислойной мембраны. Корреляцию изменения размеров и ζ-потенциала липосом с накоплением продуктов ПОЛ в этой работе не отслеживали.

В настоящей работе измерены размеры и ζ-потенциал липосом из соевого PC в процессе их AAPH-инициированного окисления при 37°C с целью установления корреляции этих параметров с концентрацией продуктов ПОЛ (ДК). Другой целью было исследование влияния присутствия ALA и ЭМГ и капсулирования липосом с помощью Cas-Na на динамику изменения их размеров и ζ-потенциала в процессе окисления.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Для приготовления липосом использовали суспензию соевого PC марки Lipoid S100 (Lipoid GmbH, Германия) в фосфатном буфере с рН 7.2 и ионной силой 1 мМ. Содержание фосфолипидов в Lipoid S100 по данным производителя следующее (г/100 г): PC – 94.0, N-ацилфосфатидилэтаноламин – 0.5, фосфатидилэтаноламин – 0.1, фосфатидилинозитол – 0.1, лизофосфатидилхолин – 3.0. Кроме того, он содержит неполярные липиды в количестве (г/100 г): триглицериды – 2.0, свободные жирные кислоты – 0.5, α-токоферол – 0.15. Состав жирных кислот (в % от общего их количества): пальмитиновая – 12–17, стеариновая – 2–5, олеиновая – 11–15, линолевая – 59–70, линоленовая – 3–7.

Дисперсию липосом с концентрацией 1 мг/мл готовили из суспензии PC, добавляя в нее, если необходимо, ЭМГ (4.0 мас. % от PC) или ALA в пропорции PC : ALA = 1 : 0.59 для достижения в липосомах соотношения α-линоленовой и линолевой кислот (ω-3 : ω-6), равного 1 : 1 с учетом жирнокислотного состава PC Lipoid S100. Липосомы формировали c помощью ультразвукового гомогенизатора VCX-130 (Sonics & Materials, США), охлаждая их смесью воды со льдом для предотвращения окисления, после чего пропускали через мембранный фильтр с диаметром пор 100 нм, используя экструдер (Avanti Polar Lipids, США).

Капсулирование PC-липосом с помощью Cas-Na (Sigma, Новая Зеландия) осуществляли согласно методике [8, 9] при весовом соотношении Cas-Na : PC = 10 : 1 и концентрации PC 1 мг/мл. Природный биополимер Cas-Na является мицеллообразующей натриевой формой основного белка молока, в состав которого входят такие индивидуальные белки как αS1-, αS2-, β- и κ-казеины. Cas-Na растворяли в том же фосфатном буфере (pH 7.2, ионная сила 1 мM) на магнитной мешалке, затем раствор центрифугировали (30 мин, 4000 об./мин) для удаления примесей. Низкая ионная сила буфера была выбрана для того, чтобы при капсулировании задействовать электростатические взаимодействия между противоположно заряженными функциональными группами белка и липидов [8, 9]. Концентрацию белка в растворе определяли методом дифференциальной рефрактометрии по известному значению его инкремента показателя преломления. Растворы Cas-Na и PC-липосом в фосфатном буфере смешивали в шейкере (GFL 3032, Германия) в течение 1 ч при 40°С.

Окисление липосом инициировали водорастворимым азоинициатором ААРН; его концентрация в дисперсии липосом составляла 2 мМ. Окисление проводили в пробирках, помещенных в термостат, при температуре 37°С, из которых периодически отбирали пробы дисперсии для измерения размеров и ζ-потенциала липосом. Степень развития ПОЛ во времени оценивали по УФ-спектрам поглощения ДК при λ = 233 нм на спектрофотометре Lambda-25 (Perkin Elmer). Ошибка измерения оптической плотности (A) составляла не более 3%. Погрешность определения разности AA0 (A0 – значение A в момент времени t = 0) не превышала ±10%.

Для определения размеров липосом использовали метод ДРС. В этом методе проводится расчет гидродинамического диаметра (Dh) сфер, которые двигались бы в жидкости с той же скоростью, что и исследуемые частицы. Измерения Dh проводили на приборе Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Великобритания) по оценке корреляционной функции флуктуаций интенсивности лазерного излучения с λ = 633 нм, рассеянного на липосомах под углом 173°. Концентрация PC-липосом составляла 1 мг/мл, температура 25°C, индекс полидисперсности (PdI) липосом изменялся в пределах 0.1–0.3. Для каждого размера Dh регистрировали 5–10 распределений интенсивности по размерам частиц с 15 накоплениями при каждом измерении; усреднение проводилось по размерам частиц с максимальной интенсивностью рассеяния. Так как каждый опыт по окислению повторяли 3 раза, то учитывались также ошибки при повторных измерениях Dh. Суммарная погрешность не превышала ±5%. На рис. 1 приведен пример распределений интенсивности рассеянного излучения (I) по размерам липосом состава PC + ALA в разные моменты времени окисления.

Рис. 1.

Изменения распределений интенсивности светорассеяния (I) по размерам липосом (Dh) для смеси PC + ALA в процессе инициированного окисления: 1 – без AAPH (PdI = 0.197), 2 – в присутствии AAPH при t = 0 мин (PdI = 0.170), 3t = 30 мин (PdI = 0.113), t = 360 мин (PdI = 0.123).

Для измерения ζ-потенциала липосом этот же прибор использовался в режиме регистрации электрофоретической подвижности частиц. Калибровку проводили по стандартной дисперсии полистирольного латекса с погрешностью ±5%. Для всех изученных образцов липосомальных дисперсий спектр подвижности содержал только одну полосу. Усреднение максимальных значений ζ осуществлялось по результатам трех измерений, воспроизводимость для идентичных образцов различалась в разные моменты времени окисления, но была в пределах 10%. С учетом погрешности калибровки прибора, суммарная ошибка измерений ζ не превышала ±12%.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Как уже упоминалось выше, в [12] проведено детальное исследование инициированного AAPH окисления липосом соевого PC с некоторыми нутрицевтиками при разной температуре и даны оценки кинетических параметров окисления. В настоящей работе мы приводим данные по изменению значений Dh и ζ в процессе окисления при температуре 37°C 5-ти видов липосом: исходных PC-липосом, а также содержащих ЭМГ, ALA или их смесь и липосом, капсулированных Cas-Na. Для объяснения динамики изменений Dh и ζ липосом в процессе окисления и влияния на этот процесс накопления ДК и присутствия указанных добавок, на рис. 2 приведены соответствующие кинетические кривые изменения оптической плотности ДК в процессе окисления, взятые из [12]. Как было показано в этой работе, при автоокислении PC-липосом при 37°C период индукции составил порядка 300 мин, и вплоть до 600 мин отмечалось лишь незначительное повышение уровня ДК (менее 10% по сравнению с уровнем ДК для инициированного окисления при этой температуре). Поэтому измерения размера и ζ-потенциала липосом в процессе автоокисления в этот период времени мы не проводили, считая, что изменения этих параметров будут незначительными.

Рис. 2.

Изменение оптической плотности ДК в процессе инициированного окисления липосом разного состава: 1 – PC-липосомы, 2 – с ЭМГ (PC : ЭМГ = 1 : : 0.04), 3 – с ALA (PC : ALA = 1 : 0.59), 4 – с ALA и ЭМГ (PC : ALA : ЭМГ = 1 : 0.59 : 0.04), 5 – с Cas-Na (PC : Cas-Na = 1 : 10). [PC] = [PC + ЭМГ] = [PC + ALA] = [PC + + ALA + ЭМГ] = 1 мг/мл, [AAPH] = 2 мМ, T = 37°C. A – оптическая плотность ДК при λ = 233 нм, A0 – то же при t = 0.

При инициированном окислении PC-липосом имеет место заметная задержка начала этого процесса (рис. 2, кривая 1). Период индукции (примерно 30 мин) обусловлен не только кинетикой развития процесса накопления ДК [5], но и ингибирующим действием α-токоферола в используемом PC. При введении в липосомы 4 мас. % ЭМГ (кривая 2) в течение 180 мин имеет место полное торможение окисления PC, а в момент максимального накопления ДК его концентрация в присутствии ЭМГ меньше примерно в 8 раз (на 87.5%). Такое сильное ингибирование окисления ПНЖК в липосомах происходит, главным образом, благодаря высокому (до 85%) содержанию в ЭМГ эвгенола (4-аллил-2-метоксифенола) – очень активного жирорастворимого АО [12]. Окисление липосом, содержащих примерно 37% ALA (кривая 3), идет c большим ускорением на начальной стадии процесса (в первые 30–40 мин) и без периода индукции. Далее накопление ДК происходит медленнее, в соответствии с относительным содержанием PC в исходных и включающих ALA липосомах. Введение ЭМГ в окисляемую смесь PC + ALA повышает эффективность ингибирования окисления (кривая 4) практически в 4 раза (на 73%) и в 2 раза уменьшает период индукции, вероятно, за счет очень активного окисления ALA. Использование Cas-Na в качестве оболочки для PC-липосом снижает максимальный уровень ДК примерно в 3.5 раза (на 70%) (сравните кривые 5 и 1), слабо влияя на период индукции.

В табл. 1 приведены значения Dh, PdI и ζ для липосом различного состава, измеренные до их окисления. Видно, что введение в липосомы добавок или их капсулирование Cas-Na изменяет Dh липосом и их заряд. В случае ЭМГ, по-видимому, молекулы липофильного эвгенола и других компонентов встраиваются в липидные области бислоев, нарушая их регулярную упаковку, что может приводить к небольшому увеличению Dh. Подобный эффект наблюдали [14, 15] для ресвератрола и серотонина. При встраивании в липосомы молекул ALA, карбоксильные группы которых заряжены отрицательно и обращены к водной фазе, существенно увеличиваются абсолютная величина ζ (отрицательный поверхностный заряд) липосом и их средний размер. Эти данные можно сравнить с полученными ранее [8, 9] результатами измерения среднего гидродинамического радиуса Rh PC-липосом (65 нм) и (PC + + ALA)-липосом (58 нм). Для ζ-потенциала соответствующие значения составили соответственно –24 и –40 мВ. Отличие размеров указанных липосом от приведенных в табл. 1 связано, вероятно, с разными условиями приготовления и хранения дисперсий липосом и режимами их “озвучивания” [8, 12]. Значения ζ для них отличаются от табличных величин незначительно. Добавление в (PC + ALA)-липосомы ЭМГ приводит к небольшому увеличению их Dh и уменьшению абсолютного значения ζ. При капсулировании PC-липосом Cas-Na, естественно, увеличивается размер образующихся частиц. При этом абсолютное значение их отрицательного ζ-потенциала уменьшается по сравнению с ζ-потенциалом исходных PC-липосом, по-видимому, за счет компенсации отрицательного заряда ближайшими к липосоме положительно заряженными группами белковой оболочки.

Таблица 1.  

Гидродинамический диаметр (Dh), индекс полидисперсности (PdI) и дзета-потенциал (ζ) липосом до окисления (перед введением инициатора ААРН)

Состав липосом Dh, нм PdI ζ, мВ
PC 150.7 ± 4.9 0.227 ± 0.012 –23.1 ± 2.2
PC + ЭМГ 153.2 ± 1.8 0.247 ± 0.009 –14.8 ± 1.4
PC + ALA 187.2 ± 4.2 0.197 ± 0.005 –38.6 ± 3.5
PC + ALA + ЭМГ 201.3 ± 3.6 0.201 ± 0.009 –32.8 ± 3.2
PC + Сas-Na 204.4 ± 6.3 0.270 ± 0.014 –15.4 ± 0.8

На рис. 3 и 4 приведены кривые, характеризующие изменения соответственно среднего размера и ζ-потенциала исходных PC-липосом (1), содержащих добавки (24) и капсулированных с помощью Cas-Na (5) в процессе их инициированного окисления. Сразу после введения инициатора AAPH в дисперсию липосом (при t = 0), значения их Dh и ζ изменяются. Так как молекулы ААРН (RN=NR) заряжены положительно [16], то, попадая в липосомы, они частично нейтрализуют их поверхностный отрицательный заряд, поэтому абсолютная величина ζ для всех изученных липосом уменьшается. Вследствие этого, вероятно, происходит перестройка фосфолипидов в бислое, и размер липосом уменьшается (рис. 3, t = 0). Особенно это выражено для липосом состава PC + ALA (кривые 3, 4 на рис. 3, t = 0).

Рис. 3.

Динамика изменения среднего гидродинамического диаметра (Dh) липосом разного состава в процессе их инициированного окисления. Состав липосом и условия их окисления смотрите в подписи к рис. 2.

Рис. 4.

Изменение ζ-потенциала липосом разного состава в процессе их инициированного окисления. Состав липосом и условия их окисления смотрите в подписи к рис. 2.

При термораспаде азоинициатора, генерации свободных радикалов (R) и быстрого образования пероксильных радикалов ROO инициатора, происходит окисление ПНЖК в липосомах, их частичная трансформация из cis в trans-cis и trans-trans изомерные первичные гидропероксидные продукты окисления (ДК) [17, 18]. Авторы обзора [17], анализируя данные разных работ, сделали вывод, что в процессе ПОЛ в липосомах из яичного лецитина образуются, в основном, trans-trans, а не trans-cis гидроперекиси. Эти трансформации конфигурации жирнокислотных цепей фосфолипидов приводят к важным изменениям в структуре липосомальной мембраны и, как следствие, размера и ζ-потенциала липосом. Для PC-липосом Dh увеличивается примерно на 6–7% после 100–120 мин окисления (рис. 3, кривая 1). К этому времени ζ возрастает по абсолютной величине с –5 до –12 мВ, достигая концу окисления –16 мВ (рис. 4, кривая 1), подобно росту отрицательного ζ-потенциала, наблюдавшемуся в [13]. Отметим, что ход кривой 1 на рис. 4 напоминает зеркальное отображение хода кривой 1 на рис. 2, т.е. изменение ζ-потенциала коррелирует с изменением содержания ДК.

Так как взаимодействие фосфолипидных молекул в бислое липосом изменяется в процессе окисления, изменяется и ориентация их полярных головных групп [13]. Окисленные ненасыщенные жирнокислотные цепи фосфолипидов изгибаются, и их OOH-группы приближаются к поверхности липосомы [21]. Происходящие структурные изменения могут способствовать диссоциации этих групп, что является основной причиной увеличения отрицательного заряда на поверхности липосом. При этом при таких концентрациях ДК общий объем трансформированных окисленных фосфолипидов увеличивается мало, и средний размер липосом остается практически постоянным. Это свидетельствует о том, что при физиологической температуре при таких уровнях ДК в процессе окисления размеры липосом изменяются незначительно и зависимости (корреляции) размера от концентрации ДК не наблюдается.

Дополнительные наши эксперименты показали, что при температуре 60°C, когда содержание ДК увеличилось в 3 раза к концу наблюдения по сравнению с окислением при 37°C [12], средний размер липосом немонотонно повышался и достиг 260 ± 60 нм, что примерно на 30% выше исходного значения; ζ-потенциал при этом составил –27 ± 2 мВ. Это может свидетельствовать об образовании в процессе окисления при таких условиях, кроме ДК, липидных конгломератов различного размера.

Присутствие в PC-липосомах ЭМГ (рис. 4, кривая 2) существенно замедляет рост абсолютной величины отрицательного ζ-потенциала липосом в течение примерно 120 мин окисления, после чего она возрастает, не достигая, однако, значения, характерного для исходных липосом. При этом размер липосом в течение всего времени окисления практически не изменяется (рис. 3, кривая 2).

Размер липосом состава PC + ALA в течение первых 30–40 мин окисления уменьшается с 170 до 150 нм, а абсолютное значение ζ-потенциала с –15 до –10 мВ (кривые 3 на рис. 3, 4). Это время практически совпадает со временем полного окисления ALA, а далее продолжается окисление ПНЖК в оставшемся PC. В процессе дальнейшего окисления липосом происходит значительное (до 220 нм) увеличение их размера, вероятно, не только из-за постепенного накопления ДК, но и за счет образования конгломератов ДК с остатками окисленных молекул ALA. При этом ζ-потенциал практически не изменяется.

Присутствие в (PC + ALA)-липосомах ЭМГ сильно ингибирует окисление ALA в течение примерно 100 мин, а значения Dh и ζ почти не изменяются в процессе дальнейшего окисления липосом (кривые 4 на рис. 3, 4).

Как уже упоминалось ранее, при окислении липосом и наработке гидроперекисей в гидрофобных жирнокислотных цепях PC появляются гидрофильные перекисные группы, что приводит к перестройке структуры бислоя [18, 19].

В работе [18] методом малоуглового рентгеновского рассеяния проведена оценка изменений толщины и структуры бислоя больших моноламелярных везикул и места локализации гидропероксидных и карбоксильных групп при различных соотношениях в бислое фосфолипида POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) и двух его окисленных форм – POPC-OOH и Paze-PC (1-palmitoyl-2-azelaoyl-sn-glycero-3-phosphocoline). Было установлено, что 95% гидроперекисных групп находятся в полярной области бислойной мембраны, вблизи карбонильных групп практически при всех соотношениях этих фосфолипидов. Средняя площадь в расчете на молекулу постепенно увеличивается от 65 Å2 для бислоев POPC до 78 Å2 для бислоев POPC-OOH, в то время как толщина окисленной мембраны становится меньше, чем неокисленной.

Авторы работы [19] с использованием пирена в качестве флуоресцентного зонда и методом ДРС наблюдали фазовые изменения и агрегацию липидов в смесях DPPC (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) и DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) с окисленным PGPC (1-palmitoyl-2-glutaryl-sn-glycero-3-phosphocholine) при T = 5–60°C. Полученные результаты свидетельствуют о том, что PGPC формируют крупные агрегаты из мелких мицелл, а жидкофазный DPPC при T = 50–60°C образует везикулы – индивидуальные и содержащие PGPC. Размер этих везикул зависит от соотношения PGPC/DPPC и температуры. DOPC и PGPC не смешиваются в жидком бислое ни в каких соотношениях, но смеси DOPC, DPPC и PGPC при некоторых их соотношениях могут формировать агрегаты DOPC + + PGPC [19] в гелевой фазе. Таким образом, в нашем случае при окислении смеси PC + ALA при сложном составе РС возможно образование различных, изменяющихся во времени агрегатов из смеси окисленных и не окисленных молекул РС, остатков ALA и интермедиатов, приводящее к увеличению среднего размера липосом, уменьшению и стабилизации абсолютной величины их отрицательного ζ-потенциала.

Размер PC-липосом, капсулированных с помощью Cas-Na, остается практически на начальном уровне (190 нм) в течение всего процесса окисления (рис. 3, кривая 5) за счет эффективного ингибирования окисления белковой оболочкой, несмотря на накопление некоторого количества ДК (рис. 2, кривая 5). Величина ζ таких “капсул” немного уменьшается в начале окисления, а далее остается на уровне –10 мВ до конца окисления (рис. 4, кривая 5). Таким образом, белковая оболочка из Cas-Na не только заметно предохраняет ПНЖК фосфолипидов липосомы от окисления, но и стабилизирует размер и ζ-потенциал этой липосомно-белковой структуры.

В работе [20] методом калориметрии смешения был установлен преобладающий вклад электростатического взаимодействия между Cas-Na и PC-липосомами в формировании ими комплексных частиц в нейтральной области рН. На основании данных о таких структурных параметрах как молекулярная масса, размер, форма и плотность [9, 11], был сделан вывод, что “комплексы” Cas-Na с PC-липосомами представляют собой супрамолекулярные частицы с плотной структурой. Формирование таких частиц, по-видимому, существенно препятствует диффузии кислорода к ненасыщенным углеродным связям ПНЖК в липосомах и, как следствие, их окислению. Это и приводит к стабилизации размеров и ζ-потенциала комплексных частиц в процессе окисления.

В недавно вышедшей работе [21] исследована роль различных форм окисленных фосфолипидов в образовании рафтов (микродоменов) при тщательном контроле состава мембран. Авторы использовали флуоресцентную микроскопию гигантских моноламелярных везикул, позволяющую визуализировать воздействие гидропероксидов на структуру липидов мембран. При окислении липосом в гидрофобных жирнокислотных “хвостах” PC появляются гидрофильные перекисные группы, которые переориентируются в пространстве, что приводит к изменению конфигурации молекул фосфолипидов, увеличению их молекулярного объема и, как следствие, к изменению размера и заряда липосом. В [21] приведены схемы, наглядно иллюстрирующие изменения формы и занимаемого объема для молекул POPC и двух его окисленных видов: POPCOOH и PazePC. Если молекулы POPC и POPCOOH имеют форму цилиндра, правда, разного диаметра и разной длины, что способствует формированию рафтов, то молекула PazePC имеет форму конуса, что приводит к разупорядочению двумерной структуры липосомальной мембраны. Таким образом, изменения структуры бислоя мембраны в процессе окисления могут прояснить сложные процессы, протекающие в биомембранах in vivo.

ВЫВОДЫ

Изучена динамика изменения размеров и ζ-потенциала липосом из соевого PC в процессе их инициированного 2.2'-азобис(амидинопропан) дигидрохлоридом окисления при температуре 37°С. Исследовано влияние на эти параметры введения в липосомы ALA и ЭМГ, а также капсулирования их Cas-Na.

Установлено, что в процессе окисления размер PC-липосом увеличивается на 6–7% и не коррелирует с изменением уровня диеновых конъюгатов. Абсолютное значение отрицательного ζ-потенциала липосом увеличивается к концу окисления примерно в 3 раза в соответствии с увеличением содержания ДК.

Введение в липосомы ALA значительно влияет на динамику изменения их размеров и ζ-потенциала: средний диаметр увеличивается примерно на 30% к концу окисления, а абсолютные значения отрицательного ζ-потенциала уменьшаются. Присутствие в липосомах ЭМГ изменяет эти закономерности и стабилизирует размеры и ζ-потенциал при окислении и исходных, и содержащих ALA PC-липосом. Капсулирование PC-липосом с помощью Cas-Na существенно снижает накопление ДК в процессе окисления, и, как следствие, размер и ζ-потенциал таких супрамолекулярных структур практически не изменяются.

Можно сделать вывод, что вариации ζ-потенциала и размеров липосом при окислении определяются, главным образом, изменением конфигурации жирнокислотных цепей фосфолипида и перегруппировкой полярных головных групп его молекул. Ингибирующие окисление агенты препятствуют изменениям этих параметров в процессе окисления.

Список литературы

  1. Thomas A.H., Catala A., Vignoni M. // Biochim. Biophys. Acta. 2016. V. 1858. P. 139.

  2. Poon H.F., Calabrese V., Scapagnini G., Butterfield D.A. // J. Gerontol. A. Biol. Med. Sci. 2004. V. 59. P. 478.

  3. Spiteller G. // Med. Hypotheses. 2003. V. 60. P. 69.

  4. Soto-Arriaza M.A., Sotomayor C.P., Lissi E.A. // J. Colloid Interface Sci. 2008. V. 323. P. 79.

  5. Pinchuk I., Lichtenberg D. // Chem. Phys. Lipids. 2014. V. 178. P. 63.

  6. Gal S., Pinchuk I., Lichtenberg D. // Chem. Phys. Lipids. 2003. V. 126. P. 95.

  7. Semenova M.G., Antipova A.S., Belyakova L.E., Polikarpov Yu.N., Anokhina M.S., Grigorovich N.V., Moiseenko D.V. // Food Hydrocoll. 2014. V. 42. P. 149.

  8. Semenova M.G., Antipova A.S., Zelikina D.V., Martirosova E.I., Plashchina I.G., Palmina N.P., Binyukov V.I., Bogdanova N.G., Kasparov V.V., Shumilina E.A., Ozerova N. // Food Res. Int. 2016. V. 88. P. 70.

  9. Semenova M.G., Zelikina D.V., Antipova A.S., Martirosova E.I., Grigorovich N.V., Obushaeva R.A., Shumilina E.A., Ozerova N.S., Palmina N.P., Maltseva E.L., Kasparov V.V., Bogdanova N.G., Krivandin F.V. // Food Hydrocoll. 2016. V. 52. P. 144.

  10. Semenova M.G., Antipova A.S., Misharina T.A., Alinkina E.S., Zelikina D.V., Martirosova E.I., Palmina N.P., Binyukov V.I., Maltseva E.L., Kasparov V.V., Ozerova N.S., Shumilina E.A., Baeva K.A., Bogdanova N.G. // Gums and Stabilisers for the Food Industry 18: Hydrocolloid Functionality for Affordable and Sustainable Global Food Solutions. Ed. by Williams P.A. and Phillips G. Cambridge: Royal Soc. Chem., 2016. P. 182.

  11. Semenova M.G. // Food Hydrocoll. 2017. V. 68. P. 114.

  12. Sazhina N.N., Antipova A.S., Semenova M.G., Palmina N.P. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2019. V. 45. P. 34.

  13. Mosca M., Cerlie A., Ambrosone L. // Chem. Phys. Lipids. 2011. V. 164. P. 158.

  14. Neves A.R., Nunes C., Amenitsch H., Reis S. // Soft Matter. 2016. V. 12. P. 2118.

  15. Azouzi S., Santuz H., Vorandat S., Pereira C., Cote F., Hermine O., Kirat K.E., Colin Y., Kim C., Etchebest C., Amereault P. // Biophys. J. 2017. V. 112. P. 1863.

  16. Werber J., Wang Y.J., Milligan M., Li X., Ji J.A // J. Pharm. Sci. 2011. V. 100. P. 3307.

  17. Schnitzer E., Pinchuk I., Lichtenberg D. // Eur. Biophys. J. 2007. V. 36. P. 499.

  18. De Rosa R., Spinozzi F., Itri R. // Biochim. Biophys. Acta. 2018. V. 1860. P. 2299.

  19. Singh J., Ranganathan R. // Biochim. Biophys. Acta – Biomembr. 2015. V. 1848. P. 1472.

  20. Istarova T.A., Semenova M.G., Sorokoumova G.M., Selishcheva A.A., Belyakova L.E., Polikarpov Yu.N., Anokhina M.S. // Food Hydrocoll. 2005. V. 19. P. 429.

  21. Tsubone T.M., Junqueira H.C., Baptista M.S., Itri R. // Biochem. Biophys. Acta – Biomembr. 2019. V. 1861. P. 660.

Дополнительные материалы отсутствуют.