Коллоидный журнал, 2020, T. 82, № 6, стр. 715-724
Лазерная десорбция и ионизация тиосемикарбазидов
И. А. Полунина 1, К. Е. Полунин 1, А. К. Буряк 1, *
1 Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН
119071 Москва, Ленинский просп., 31, Россия
* E-mail: akburyak@mail.ru
Поступила в редакцию 08.06.2020
После доработки 15.06.2020
Принята к публикации 22.06.2020
Аннотация
Методом масс-спектрометрии исследованы ионизированные продукты десорбции тиосемикарбазидов с поверхности стальной мишени до и после нанесения на нее твердых растворов тиосемикарбазидов в органических матрицах (никотиновая кислота, α-циано-4-гидроксикоричная кислота, 2,5-дигидроксибензойная кислота, дитранол). Обнаружено, что в условиях матрично-активированной десорбции/ионизации 2,5-дигидроксибензойная кислота является универсальной матрицей для исследования синтезированных тиосемикарбазидов. По сравнению с α-циано-4-гидроксикоричной кислотой ее применение позволяет в 100 раз снизить предел обнаружения тиосемикарбазидов. Исследования процессов распада метастабильных протонированных молекул тиосемикарбазидов, ускоренных в ионном источнике, позволили предложить схемы их фрагментации и механизм ионизации.
ВВЕДЕНИЕ
Тиосемикарбазиды – биологически активные полифункциональные соединения, содержащие атомы азота и серы. Их использование в качестве дериватов алкилгидразинов оказалось весьма успешным при проведении хроматографического анализа микроколичеств этих токсикантов в объектах окружающей среды [1–4]. Для идентификации тиосемикарбазидов в водных и органических растворах были использованы методы спектрофотометрии, а в газовой фазе – масс-спектрометрии (МС). Многие S,N-производные гидразинов – малолетучие и термолабильные вещества, для их анализа необходимо применять методы более мягкой ионизации, чем ионизация электронами, обычно используемая в хромато-масс-спектрометрии [5].
В основе метода лазерной десорбции/ионизации (ЛДИ) лежит взаимодействие вещества с лазерным излучением с последующей десорбцией с поверхности мишени и ионизацией [6]. Метод ЛДИ позволяет анализировать смеси протонированных и катионированных молекул низкомолекулярных компонентов в присутствии буферов и примесных соединений. Для увеличения эффективности метода ЛДИ к целевым соединениям добавляют органические или неорганические матрицы (метод матрично-активированной ЛДИ, МАЛДИ) [7]. Основные требования к матрицам заключаются в их высокой способности поглощать лазерное излучение, кристаллизоваться, включая в свою структуру анализируемое вещество, переносить протоны в ходе процесса ионизации, инертности по отношению к анализируемому веществу, хорошей растворимости в используемых растворителях и низкой летучести в условиях вакуума. В качестве органических матриц хорошо зарекомендовали себя такие соединения, как коричная и никотиновая кислоты, 3-амино-4-гидроксибензойная кислота, α-циано-4-гидроксикоричная кислота, 2,5-дигидроксибензойная кислота, 6,7-дигидроксикумарин, 2-(4-гидроксифенилазо)бензойная кислота, 3-гидроксипиколиновая кислота, 2,4,6-тригидроксиацетофенон и многие другие [8]. Отмечено влияние кислотности матрицы на выход ионов анализируемого вещества [9]. Взаимодействие матриц с органическими веществами мало изучено, множество экспериментальных параметров, таких как длина волны и мощность лазерного излучения, различные способы нанесения матрицы, ее состав и концентрация влияют на выход ионов [7]. Как правило, вещества матрицы на несколько порядков больше, чем изучаемого вещества, а так как большинство соединений, используемых в качестве матриц, имеют молекулярную массу ниже 500 Да, ионы матрицы могут стать помехой в определении целевых соединений. Значительно снизить фоновый сигнал матрицы позволяет вариация соотношения матрица/анализируемое вещество, которое подбирается экспериментально для каждого нового образца. Поскольку фундаментальные процессы образования ионов в варианте ионизации методом МАЛДИ еще не до конца исследованы, накопление экспериментальных результатов и методов их интерпретации позволят создать новые подходы к разработке оригинальных теоретических положений.
Цель работы – исследование лазерной десорбции и ионизации этил-, аллил- и фенилтиосемикарбазидов с поверхности стальной мишени до и после нанесения на нее твердых растворов органических матриц и исследуемых соединений, а также изучение механизма ионизации и фрагментации молекул тиосемикарбазидов, десорбирующихся с поверхностей разного типа.
ЭКПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Чистые 4-R-1,1-R1,R2-тиосемикарбазиды были получены по методике [2] в результате взаимодействия 1-метил-, 1,1-диметил- и 1,1-метилэтилгидразинов с этил-, аллил- и фенилизотиоцианатами RNCS (табл. 1).
Таблица 1.
Тиосемикарбазид | R | R1 | R2 | М, Да |
---|---|---|---|---|
1 | Et | Me | Me | 147 |
2 | All | Me | Me | 159 |
3 | Ph | Me | Me | 195 |
4 | All | H | Me | 145 |
5 | All | Me | Et | 173 |
6 | Ph | H | Me | 181 |
7 | Ph | Me | Et | 209 |
Экспериментальные исследования ЛДИ тиосемикарбазидов выполнены на масс-спектрометре Ultraflex II TOF (Bruker Daltonics, Германия) с азотным лазером (λ = 337 нм, энергия излучения 110 мкДж, частота импульса 20 Гц, количество импульсов для получения спектра 25–50, время между импульсами 1 мкс), времяпролетным масс-анализатором с рефлектроном и программным обеспечением FlexControl 3.4 и FlexAnalysis 3.4. (Bruker, Германия). Спектры получены в режиме регистрации положительных ионов. Ускоряющее напряжение и напряжение на рефлектроне – 25 и 26.5 кВ соответственно. Калибровку масс осуществляли по методам внешнего и внутреннего стандарта, используя значения масс пиков ионов матриц. При этом достигнута точность определения масс Δm ≤ 0.1 Да. Для изучения фрагментации исходных метастабильных протонированных молекул тиосемикарбазидов применяли режим распада за пределами ионного источника. Масс-спектры ионов-продуктов регистрировали с помощью метода FAST (Bruker Daltonics). Для повышения воспроизводимости результатов анализа каждый масс-спектр получали усреднением 5 масс-спектров. Относительное стандартное отклонение зарегистрированного суммарного ионного сигнала составило 8%.
В качестве матриц использовали следующие вещества: 2,5-дигидроксибензойную кислоту (DHBA) и α-циано-4-гидроксикоричную кислоту (CHCA) от Bruker Daltonics (Германия), никотиновую кислоту и дитранол от Acros Organics (Бельгия). Растворы матриц с концентрацией 1 мг/мл готовили в 80%-ном растворе метанола в воде. Использовалась деионизированная вода, полученная на установке Milli-Q (Millipore, США), и метанол (Sigma, США).
В качестве мишени использовали планшеты AnchorChip (Bruker, Германия), содержащие гидрофильные металлические участки строго заданного диаметра, равного 600 мкм. На поверхность мишени наносили 1 мкл раствора матрицы и после высушивания на воздухе добавляли 1 мкл анализируемого раствора. Во избежание образования крупных кристаллов проводили перекристаллизацию полученных “точек”, добавляя 1 мкл метанола.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Синтезированные тиосемикарбазиды (табл. 1) практически не поглощают излучения в области рабочей частоты азотного лазера масс-спектрометра (337 нм) [2], что затрудняет их ионизацию. Тем не менее, при облучении короткими лазерными импульсами тиосемикарбазидов, нанесенных на стальную мишень в количестве 5 нг, удалось наблюдать их десорбцию, т.е. переход анализируемого вещества с поверхности мишени в газовую фазу. В плотной высокотемпературной плазме над поверхностью образца наряду с протонированными молекулами тиосемикарбазидов [М + Н]+ обнаружены их катионированные молекулы, содержащие катионы стальной подложки, в частности ионы натрия и калия, обладающие наибольшей эффективностью ионизации (табл. 2). Абсолютная интенсивность образования ионов тиосемикарбазидов является невысокой, при этом относительная интенсивность пиков протонированных молекул существенно выше, чем интенсивность пиков их катионированных молекул. Высокие значения S/N – отношения интенсивности сигнала протонированных молекул к шуму, позволяют надежно их идентифицировать в масс-спектре.
Таблица 2.
Тиосемикарбазид | Кластерные ионы | m/z | Относительная интенсивность, % | S/N |
---|---|---|---|---|
1 | [M + H]+ | 147.990 | 100 | 27 |
[M + Na]+ | 169.976 | 27 | 11 | |
[M + K]+ | 185.952 | 17 | 6 | |
2 | [M + H]+ | 160.005 | 65* | 245 |
[M + Na]+ | 181.996 | 6.6 | 29 | |
[M + K]+ | 197.984 | 7 | 31 | |
3 | [M + H]+ | 195.992 | 100 | 114 |
[M + Na]+ | 217.957 | 40 | 46 | |
[M + K]+ | 233.920 | 59 | 67 |
Причиной наблюдаемой ионизации тиосемикарбазидов в условиях ЛДИ может быть либо образование ионизирующих фотоэлектронов при взаимодействии лазерного излучения с поверхностью мишени [6], либо образование в результате таутомерного превращения алкилгидразинов HS-кислоты, которая, вероятно, протонирует тиосемикарбазиды по наиболее оснóвной аминогруппе (схема 1 ). Второй вариант ионизации более вероятен, иначе в масс-спектрах ЛДИ тиосемикарбазидов доминировали бы кластерные ионы, образовавшиеся за счет эмиссии катионов с поверхности стальной мишени.
Схема 1 . Образование протонированных молекул тиосемикарбазидов в условиях ЛДИ.
Нанесение матрицы на мишень должно облегчить десорбцию и ионизацию исследуемых соединений и повысить чувствительность их анализа [7]. Универсальных матриц, одинаково хорошо подходящих для ионизации всех классов соединений, пока не обнаружено, поэтому подбор оптимальной матрицы осуществляется экспериментальным путем. В табл. 3 приведены физико-химические характеристики исследованных матриц.
Таблица 3.
Матрица | Структурная формула | Максимум поглощения λ, нм | М, Да |
---|---|---|---|
3-Пиридин-карбоновая (никотиновая) кислота | 266 | 123.11 | |
2,5-Дигидрокси-бензойная кислота (DHBA) | 337 и 353 | 154.22 | |
α-Циано-4-гидрокси-коричная кислота (CHCA) | 337 и 353 | 189.16 | |
1,8-Дигидрокси-9-антрон (дитранол) | 337 | 226.23 |
Применение никотиновой кислоты в качестве матрицы не позволило зарегистрировать протонированные молекулы этил- и фенилтиосемикарбазидов 1 и 3 при содержании этих соединений на мишени ниже 100 нг. Это связано с плохой совместимостью данных веществ с матрицей, в результате чего молекулы тиосемикарбазидов неравномерно распределяются по поверхности быстро образующихся кристаллов матрицы, и сигналы кластерных ионов плохо воспроизводятся. Протонированные молекулы аллилтиосемикарбазида 2 [M + H]+ с m/z 160 и его катионированные молекулы [M + Na]+ с m/z 182 и [M + K]+ с m/z 198 удалось зарегистрировать лишь при 1000-кратном превышении доли матрицы над долей тиосемикарбазида 2 (мольное соотношение матрица/аналит Mt/A = 1000). В этом случае сокристаллизация матрицы с соединением 2 была удовлетворительной, однако наблюдался сильный фоновый сигнал матрицы, а масс-спектр 2 характеризовался крайне низкой интенсивностью и плохой воспроизводимостью.
Использование дитранола (m/z 226), в качестве матрицы позволило зарегистрировать протонированные молекулы этил- и аллилтиосемикарбазидов 1 и 2 (с m/z 148 и 160 соответственно) только при их содержании на мишени более 1 мкг. Ионизация тиосемикарбазидов с дитранолом наблюдалась при значении Mt/A = 1000. Предел обнаружения тиосемикарбазидов 1 и 2 с дитранолом составил всего 10 мг/л.
В результате проведенных экспериментов установлено, что эффективность ионизации синтезированных тиосемикарбазидов в режиме МАЛДИ при использовании никотиновой кислоты и дитранола в качестве матриц оказалась неудовлетворительной.
α-Циано-4-гидроксикоричная кислота (CHCA) и 2,5-дигидроксибензойная кислота (DHBA) широко используются в качестве матриц для анализа низкомолекулярных соединений в условиях ЛДИ. В масс-спектре CНCA-матрицы (рис. 1а) наблюдаются ее протонированные молекулы [Mt + Н]+ с m/z 190, кластерные ионы [Mt + Na]+ с m/z 212 и [Mt + К]+ с m/z 228, а также ион [2Mt + Н]+ с m/z 379. В масс-спектре DHBA-матрицы (рис. 1б) наблюдаются ее протонированные молекулы [Mt + Н]+ с m/z 155 и катионированные молекулы [Mt + Na]+ с m/z 177 и [Mt + K]+ с m/z 193.
Масс-спектры МАЛДИ тиосемикарбазидов 1 (m/z 148) и 3 (m/z 196) в присутствии матриц из DHBA и CHCA приведены на рис. 2. Наряду с указанными выше пиками кластерных ионов в масс-спектрах наблюдаются пики молекулярных ассоциатов тиосемикарбазидов с матрицей.
На рис. 3 приведены результаты исследования зависимости интенсивности пика протонированных молекул тиосемикарбазида 2 (m/z 160) от его концентрации на мишени. Обнаружено, что при увеличении концентрации соединения 2 в 100 раз (при постоянной концентрации CHCA-матрицы) выход ионов тиосемикарбазида увеличивается всего в 2 раза.
Экспериментально установлено, что для анализа тиосемикарбазида 1 подходит только DHBA-матрица, поскольку использование в этом качестве CHCA осложняется наличием значительного числа ее фрагментных ионов, перекрывающих пики анализируемого соединения. Пик протонированной молекулы 1 (m/z 148.091) маскируют пики основного и изотопного ионов [MtCHCA + H – CO2]+ с m/z 146.061 и 148.066 соответственно. Предел обнаружения тиосемикарбазида 2 практически одинаков при использовании обеих матриц (1 мг/л). Предел обнаружения тиосемикарбазида 3 с DHBA-матрицей составляет 0.01 мг/л, что в 100 раз лучше, чем с CHCA-матрицей. Таким образом, для анализа синтезированных тиосемикарбазидов методом МАЛДИ-МС наиболее универсальной матрицей является DHBA.
Исследование влияния концентрации DHBA-матрицы на выход ионов различных тиосемикарбазидов позволило обнаружить, что максимальная интенсивность пиков протонированной молекулы тиосемикарбазида 1 достигается применением 100-кратного избытка вещества матрицы (Mt/A = 100), для тиосемикарбазида 2 эффективное соотношение Mt/A = 1, для соединения 3 Mt/A = 1000 (рис. 4). При этом тиосемикарбазид 3 может быть обнаружен в количестве 10–12 г. Причиной влияния концентрации DHBA-матрицы на эффективность ионизации этил-, аллил- и фенилтиосемикарбазидов 1–3, по-видимому, является различие в электронной конфигурации и основных свойствах этих молекул, отличающихся природой заместителя R.
Таким образом, обнаружено, что для исследования тиосемикарбазидов в условиях ЛДИ наибольшая эффективность ионизации и наиболее низкий предел обнаружения вещества достигаются при использовании в качестве матрицы DHBA, которая обладает наибольшей кислотностью по Бренстеду.
Исследование процессов распада метастабильных протонированных молекул тиосемикарбазидов, ускоренных в ионном источнике, позволило предложить схемы их фрагментации и ионизации. В табл. 4 приведены значения m/z обнаруженных кластерных ионов и протонированных молекул.
Таблица 4.
Тиосемикарбазид | m/z кластерных ионов |
---|---|
1 | 46, 61, 78, 103, 114, 146, 148 |
2 | 46, 58, 61, 78, 103, 115, 126, 158, 160 |
3 | 46, 61, 78, 103, 152, 162, 192, 194, 196 |
4 | 47, 58, 89, 144, 146 |
5 | 58, 60, 73, 75, 92, 117, 170, 172, 174 |
6 | 47, 89, 165, 182 |
7 | 58, 60, 73, 75, 92, 94, 117, 151, 176, 206, 208, 210 |
Анализ фрагментов метастабильных протонированных молекул тиосемикарбазидов, позволяет предположить, что их распад происходит в результате разрыва химических связей, ближайших к атому азота с присоединенным протоном (схема 2 ). Распад молекул тиосемикарбазидов 1–3 приводит к элиминированию нейтральных аминосоединений (этиламина, аллиламина, анилина и диметилгидразина), а также молекулы сероводорода.
Схема 2 . Распад метастабильных протонированных молекул тиосемикарбазидов 1–3, ускоренных в ионном источнике.
Соединения, указанные на схеме 2 , регистрируются масс-спектрометром в виде соответствующих протонированных молекул. Это полностью соответствует данным [10] об основных схемах фрагментации аминов в процессе ЛДИ в растворах и газовой фазе.
МАЛДИ масс-спектры фрагментации метастабильных протонированных молекул 5 и 7 (производные 1,1-метилэтилгидразина) близки к масс-спектрам соединений 1–3 (производные 1,1-диметилгидразина) и отличаются на гомологическую разность 14 Да. Масс-спектры фрагментации метастабильных протонированных молекул 4 и 6 (производные 1-метилгидразина) содержат ионы метилгидразиния с m/z 47 и протонированного 1-метиламиноизотиоцианата с m/z 89. Распад всех аллилтиосемикарбазидов (2, 4, 5) сопровождается образованием ионов аллиламмония с m/z 58, а фрагментация всех фенилтиосемикарбазидов (3, 6, 7) строго индивидуальна и зависит от природы радикалов R1 и R2 (табл. 1 и 4).
Кроме того, в МАЛДИ масс-спектрах фрагментации большинства тиосемикарбазидов (табл. 4) присутствуют пики кластерных ионов [M + H – 2]+ и [M + H – 4]+. Вероятно, их образование обусловлено протекающими в условиях МАЛДИ процессами дегидрирования протонированных молекул аминов, которые впервые были описаны в [10]. Экспериментально установлено, что интенсивность образования дегидрированных ионов тиосемикарбазидов зависит от природы вещества и матрицы, концентрации аналита на мишени и мощности лазерного излучения. В частности, при энергии лазера 35% (в линейном режиме) и соотношении A/MtDHBA = = 1 доля дегидрированных ионов [M + H – 4]+ относительно ионов [M + H]+ у этилтиосемикарбазида 1 составляет 12%, у фенилтиосемикарбазида 3 – 45%, у аллилтиосемикарбазида 2 она не определяется, т.к. пик его дегидрированного иона [M + H – 4]+ маскируется изотопным пиком матрицы [MtDHBA + Н]+ с m/z 156. Для соединения 3 увеличение энергии лазера с 35 до 40% приводит к увеличению доли дегидрированных ионов [M + H – 4]+ с 45 до 82.5% (рис. 5).
Депротонирование тиосемикарбазидов 1 и 3 при использовании в качестве матрицы CHCA характеризуется низкой воспроизводимостью отношения [M + H – 4]+/[M + H]+ как от точки к точке на мишени при постоянном соотношении A/MtCHCA, так и при изменении этого соотношения. При уменьшении концентрации вещества на мишени в 1000 раз (от A/MtCHCA = 1 до A/MtCHCA = = 0.001) доля дегидрированных ионов [M + H – 4]+ относительно ионов [M + H]+ у фенилтиосемикарбазида 3 снижается с 72 до 34%, а у этилтиосемикарбазида 1 – с 52 до 30%.
Образование ионов [M + H – 4]+ тиосемикарбазида 3 при использовании дитранола в качестве матрицы отчетливо наблюдается при содержании вещества на мишени свыше 5 мкг, при этом пики ионов матрицы практически отсутствуют в спектрах, в отличие от матриц из DHBA и CHCA, протонированные молекулы которых подвергались фрагментации в ионном источнике. При увеличении содержания соединения 3 на мишени с 5 до 50 мкг доля ионов [M + H – 4]+ относительно [M + H]+ увеличивается с 6 до 80%.
При использовании всех матриц обнаруженные пики ионов [M + H – 2]+ были гораздо менее интенсивны, чем пики ионов [M + H – 4]+ (рис. 5).
Анализ литературных данных [7–10] и полученных экспериментальных результатов позволяет предположить, что распад метастабильных протонированных молекул тиосемикарбазидов, ускоренных в ионном источнике, сопровождается элиминированием нейтральной молекулы водорода и циклизацией кластерных ионов в ионы [M + H – H2]+ гидро-1,3,4-тиадиазолов, часть которых после элиминирования второй молекулы водорода трансформируется в катионы 1,3,4-тиадиазолия [M + H – 2H2]+ (схема 3 ). Интенсивность образования дегидрированных кластерных ионов зависит от химического состава вещества и матрицы, их соотношения на мишени и интенсивности лазерного излучения.
Схема 3 . Механизм образования дегидрированных кластерных ионов тиосемикарбазидов в результате распада их метастабильных протонированных молекул, ускоренных в ионном источнике.
Природа взаимодействия органических матриц с тиосемикарбазидами, как и другими соединениями, пока недостаточно изучена, но накопление новых экспериментальных данных в дальнейшем позволит уточнить предложенные схемы ионизации и фрагментации анализируемых соединений в режиме МАЛДИ.
ВЫВОДЫ
Методом ЛДИ исследованы ионизированные продукты десорбции полифункциональных тиосемикарбазидов с поверхности стальной мишени. Использование 2,5-дигидрооксибензойной кислоты (DHBA) и α-циано-4-гидроксикоричной кислоты (CHCA) в качестве органических матриц позволило увеличить интенсивность образования протонированных и катионированных молекул тиосемикарбазидов. По сравнению с CHCA применение DHBA снижает в 100 раз предел обнаружения тиосемикарбазидов. К тому же использование матрицы из CHCA осложняется наличием значительного числа ее фрагментных ионов, маскирующих пики анализируемых соединений.
Исследования процессов распада метастабильных протонированных молекул тиосемикарбазидов, протекающих после ускорения в ионном источнике, позволили предложить схемы их фрагментации. Обнаружено, что распад молекул этил-, аллил- и фенилтиосемикарбазидов приводит к элиминированию нейтральных молекул аминосоединений и сероводорода. Кроме того, процесс распада сопровождается дегидрированием исходных метастабильных протонированных молекул и образованием кластерных ионов-продуктов [M + H – 2]+ и [M + H – 4]+. Интенсивность их образования зависит от природы тиосемикарбазида и матрицы, их соотношения на мишени и интенсивности лазерного излучения. Предложен механизм образования дегидрированных фрагментных ионов тиосемикарбазидов в присутствии матриц.
Список литературы
Парамонов С.А., Ульянов А.В., Буряк А.К. // Изв. АН. Сер. хим. 2010. Т. 59. С. 517.
Полунин К.Е., Матюшин Д.Д., Ульянов А.В., Полунина И.А., Буряк А.К. // Коллоид. журн. 2019. Т. 81. С. 493.
Полунин К.Е., Матюшин Д.Д., Ульянов А.В., Полунина И.А., Буряк А.К. // Коллоид. журн. 2019. Т. 81. С. 634.
Полунин К.Е., Матюшин Д.Д., Ульянов А.В., Полунина И.А., Буряк А.К. // Коллоид. журн. 2019. Т. 81. С. 788.
Лебедев А.Т. Масс-спектрометрия в органической химии. М.: Бином, 2003.
Алимпиев С.С., Гречников А.А., Никифоров С.М. // Успехи физ. наук. 2015. Т. 185. С. 207.
Karas M., Krüger R. // Chem. Rev. 2003. V. 103. P. 427.
Meier M.A.R., Adams N., Schubert Ul.S. // Anal. Chem. 2007. V. 79. P. 863.
Gimon-Kiusel H., Preston-Schaffter L.M., Kinsel G.R., Russell D.H. // J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 2534.
Lou X., Spiering A.J.H., de Waal B.F.M., van Dongen J.L.J., Vekemans J.A.J.M., Meijer E.W. // J. Mass Spectrom. 2008. V. 43. P. 1110.
Дополнительные материалы отсутствуют.
Инструменты
Коллоидный журнал