Коллоидный журнал, 2021, T. 83, № 1, стр. 114-122

ВВЕДЕНИЕ

Одним из активно развивающихся направлений современных исследований является синтез наночастиц (НЧ) благородных металлов в среде хитозана (ХТЗ) и его производных [1–6]. Хитозан – природный полиаминосахарид, обладающий уникальным комплексом физико-химических свойств, а также высокой антимикробной активностью и нетоксичностью по отношению к клеткам теплокровных.

Ранее нами [7] была показана возможность синтеза в водных растворах высокомолекулярного ХТЗ (М_w = 311 ± 54 кДа) относительно крупных (около 65 нм) серебряных НЧ с узким распределением по размеру. Частицы такого размера находят применение в медицине – в частности, в импульсной лазерной гипертермии [8–12]. Однако поскольку высокомолекулярный ХТЗ хорошо растворим лишь в кислых водных средах, в то время как восстановление ионов серебра происходит при pH > 7, формирование дисперсий серебра с достаточно узким распределением НЧ по размеру ограничивается диапазоном значений pH, соответствующим растворимости этого полимера.

Следует отметить, что в последние годы в исследованиях медицинского профиля значительное внимание уделяется олигохитозанам (ОХТ) – высшим олигомерам [13, 14] с М_w от 2 до 16 кДа. По сравнению с высокомолекулярными ХТЗ они обладают рядом преимуществ, среди которых повышенная растворимость в воде, меньшая вязкость растворов, а также более высокая антимикробная активность [15]. Это может способствовать расширению оптимального диапазона условий получения нанодисперсий серебра. В связи с этим, в настоящей работе проведено исследование процесса формирования НЧ серебра с узким распределением по размеру в присутствии ОХТ. Для этого проведена серия экспериментов по определению таких оптимальных условий синтеза НЧ серебра в растворах ОХТ, при которых ионы Ag⁺ уже начинают восстанавливаться, а ОХТ, выступающий в роли не только стабилизатора, но и восстановителя, еще не осаждается.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Для исследования были взяты олигохитозаны с разными значениями молекулярной массы и содержания остаточных ацетильных групп – степени ацетилирования (СА), приведенные в табл. 1: ОХТ-6/5, OXT-12/5 и OXT-12/24. В отличие от нативного хитозана ОХТ-12/24 остальные олигомеры представляли собой гидрохлориды. Все ОХТ синтезированы по методикам [16, 17] и соответствуют общей структурной формуле

где x > y.

В качестве прекурсора был использован нитрат серебра (99.9%, Aldrich). Растворы для синтеза, за исключением растворов ОХТ, готовили в день синтеза при 22 ± 2°С в свежеперегнанном водном бидистилляте, деионизированном на установке Milli-Q Synthesis (Mullipore Corp., США) и имевшем удельное сопротивление 18.4 мОм/см. Растворы ОХТ готовили таким же образом за сутки до синтеза.

Синтез осуществляли следующим образом: в объем бидистиллята, указанный в табл. 2, при перемешивании вводили определенный объем раствора ОХТ. Реакционную смесь интенсивно перемешивали магнитной мешалкой, нагревали до 75°С в течение 10 мин и добавляли последовательно через определенные интервалы времени растворы азотнокислого серебра и углекислого натрия в количествах, также указанных в табл. 2. Время реакции варьировали от 50 мин для реакционной смеси с pH 6 до 15 мин для систем с pH 7.8–8.1. За это время первоначально бесцветный раствор приобретал желтую окраску, после чего постепенно становился красновато-коричневым.

Средний размер НЧ серебра в полученных дисперсиях определяли методом динамического рассеяния света (ДРС) на приборе Zetasizer Nano ZS (Malvern, Великобритания). Данные ДРС, полученные после предварительного термостатирования образцов при 25°C, усредняли по пяти последовательным циклам измерений, каждый из которых, в свою очередь, был результатом автоматической обработки 10–15 “прогонов”. Обработку результатов и расчет среднего диаметра НЧ проводили с помощью программного обеспечения прибора (Zetasizer Software 6.20). Коэффициент вариации K_v, характеризующий разброс НЧ по размерам, рассчитывали по формуле [18]

где σ – среднеквадратичное отклонение, $\bar {X}$ – среднее арифметическое.

Показатель pH реакционных систем измеряли с помощью титратора МРТ-2, который является дополнительным модулем анализатора Zetasizer Nano ZS. Электрокинетический потенциал НЧ определяли с помощью того же прибора, используя метод M3-PALS. Обработку результатов проводили в программе Zetasizer Software 6.20.

ИК-спектры измеряли в режиме нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) на спектрометре Nicolet 6700 (Thermo Fisher Scientific, США), используя кристалл ZnSe, в диапазоне волновых чисел 550–4000 см^–1 с разрешением 4 см^–1 и усреднением 64 сканирований; эксперименты проводили на воздухе при 25°C. Для приготовления образцов в чашку Петри помещали необходимый объем нанодисперсии или раствора Na₂CO₃ и высушивали до постоянной массы (при анализе спектров учитывали возможное присутствие микропримесей воды, поглощающих на частотах 3500 и 1640 см^–1). Полученный осадок помещали на кристалл ZnSe, прижимали штатным прессом и проводили измерения. Спектры интерпретировали, используя литературные данные [19]; регистрируемый сигнал нормировали на интенсивность полос колебаний в области 2800–3000 см^–1, соответствующей валентным колебаниям С–Н (внутренний стандарт).

Спектры экстинкции нанодисперсий серебра в ультрафиолетовой и видимой областях спектра регистрировали с помощью спектрофотометра Evolution 300 (Thermo Electron Corp., США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Синтез НЧ серебра в водных растворах ОХТ оказался более сложной задачей, чем в растворах высокомолекулярного ХТЗ [7]. На этапе отработки синтеза НЧ в растворах высокомолекулярного ХТЗ, при строгом контроле всех параметров воспроизводились все эксперименты, однако синтез в растворах гидрохлоридов ОХТ-6/5 и ОХТ-12/5 воспроизводился недостаточно хорошо. Так, только в пяти–шести опытах из десяти был достигнут высокий выход НЧ с мономодальным распределением по размеру.

Для выяснения причин ограниченной воспроизводимости экспериментов были измерены ИК-фурье-спектры двух видов образцов: 1) исходных порошков ОХТ и 2) пленок, сформированных из растворов ОХТ, содержащих карбонат натрия, обеспечивающий требуемое значение рН при синтезе НЧ (рис. 1).

Ранее нами было показано [7], что при добавлении Na₂CO₃ в раствор высокомолекулярного ХТЗ на спектре не наблюдается значительных изменений по сравнению со спектром исходного раствора полимера. Однако при сравнении спектров порошка ОХТ-12/5 (рис. 1, кривая 1) и пленки из этого ОХТ, полученной в присутствии Na₂CO₃ (рис. 1, кривая 2), видны существенные различия. В ИК-спектре второго образца, по сравнению со спектром исходного ОХТ, в области 1750–1200 см^–1 зафиксирован не только сдвиг полос амид I и амид II [19] в область более высоких частот (1623 → 1653 см^–1, 1521 → 1595 см^–1), но и появление новых, достаточно интенсивных широких полос поглощения при 1452 и 1362 см^–1. Кроме того, появляется новая полоса и в низкочастотной области спектра (с максимумом вблизи 835 см^–1), а также заметное плечо при 1732 см^–1 на полосе амида I, соответствующее валентным колебаниям неионизированной карбоксильной группы. Все эти данные указывают на взаимодействие протонированных групп гидрохлорида ОХТ с Na₂CO₃. С высокой долей вероятности можно предположить, что при добавлении в водный раствор ОХТ карбоната натрия происходит частичное отщепление хлористого водорода с образованием свободного основания хитозана и неустойчивой угольной кислоты. Последняя может протонировать хитозан-основание с образованием гидрокарбоната хитозана. Находящиеся в растворе ионы натрия также могут взаимодействовать с угольной кислотой, образуя гидрокарбонат натрия. Соответствующие реакции приведены ниже.

Именно эти соли проявляются в спектре образца ОХТ–Na₂CO₃, и именно их присутствие способно повлиять на результаты синтеза НЧ серебра в растворах гидрохлоридов ОХТ.

Для предотвращения появления таких соединений, а также во избежание образования нерастворимого карбоната серебра протокол синтеза, разработанный в [7] для случая высокомолекулярного ХТЗ, потребовал изменений. Если в реакциях получения НЧ в растворах ХТЗ с М_w = = 311 кДа карбонат натрия вводили сразу после раствора прекурсора, то в случае ОХТ был выдержан экспериментально подобранный десятиминутный интервал между добавлением в реакционную смесь азотнокислого серебра и Na₂CO₃, чтобы дать время для образования промежуточных комплексов Ag⁺ с функциональными группами молекулы ОХТ. В этих условиях воспроизводились все эксперименты по синтезу НЧ серебра в водной среде, содержащей ОХТ-12/5 или ОХТ-6/5.

Образование НЧ серебра в растворах ОХТ было подтверждено методом ДРС. При этом получены мономодальные распределения числа частиц по размеру (рис. 2). В пользу образования именно НЧ серебра свидетельствует также наличие на спектре экстинкции (рис. 3) пика с максимумом вблизи 425 нм, характерного для плазмонного резонанса НЧ этого металла [20–22]. Согласно литературным данным [22, 23], наблюдаемый для полученной дисперсии максимум поглощения на длине волны λ = 428 нм соответствует плазмонному резонансу сферических НЧ Ag cо средним диаметром d около 50 нм, что находится в соответствии с данными ДРС.

Результаты экспериментов, выполненных при разных соотношениях реагентов, представлены в табл. 2, в которой приведены среднечисловые диаметры d_n частиц и соответствующие коэффициенты вариации именно для таких размеров. Кроме того, при анализе полученных дисперсий учитывали и характер распределений по интенсивности и объему. Таким образом, достаточно узкие мономодальные распределения НЧ по всем трем указанным параметрам имели следующие дисперсии: в случае ОХТ-6/5 – №№ 2 и 4, в случае ОХТ-12/5 – №№ 11, 12 и 13, а в случае ОХТ-12/24 – все, кроме образца № 15. Относительно воспроизводимости экспериментов стоит упомянуть, что отклонения результатов разных опытов от среднего находятся в пределах 10–15%.

Важными характеристиками нанодисперсий серебра являются их стабильность, средний размер НЧ и их разброс по размерам. Анализируя результаты табл. 2, можно выделить области концентраций реагентов, отвечающие формированию стабильных (электрокинетический потенциал НЧ – не менее 30 мВ) коллоидных растворов, содержащих практически монодисперсные НЧ серебра требуемого размера (45–90 нм).

Следует отметить, что результаты, полученные с использованием разных образцов ОХТ, несколько различаются. Для систем с гидрохлоридом ОХТ-6/5 (табл. 2) в образцах с низким содержанием прекурсора (№№ 1–3) при увеличении pH реакционной смеси от 6.6 до 8.1 наблюдается заметный рост d_n, от 59 до 72 нм. При этом образец № 2 (с 0.5 мл раствора Na₂CO₃) имеет самое узкое распределение НЧ по размеру – значение K_v, рассчитанного по формуле (1), составило всего 3.3%. Однако даже незначительное повышение pH реакционной системы (образец № 3) приводит к получению дисперсии с очень широким распределением НЧ по размерам: K_v = 18.3%. При увеличении концентрации прекурсора в два раза (образцы №№ 4–6) при подобном варьировании рН реакционной смеси наблюдается обратная тенденция к уменьшению среднего размера частиц от 72 до 43 нм. В данных опытах минимальный K_v (4.1%) наблюдается для образца с самым низким значением pH; по мере роста pH значение K_v также возрастает (до 6.7 и 8.1%), но не столь сильно, как для образца № 3. Повышение содержания ОХТ в системе в 2 раза по сравнению с предыдущим опытом приводит к очень незначительному увеличению среднего размера НЧ.

При получении НЧ серебра в среде, содержащей гидрохлорид ОХТ-12/5, наблюдаются две явно выраженные тенденции (табл. 2). Средний размер синтезируемых частиц уменьшается как при увеличении концентрации прекурсора, так и с ростом pH реакционной среды. При этом в случае образца с низким содержанием азотнокислого серебра и низким pH наблюдается самый большой средний размер частиц (107 нм), в то же время значения d_n НЧ в остальных образцах находятся в интервале 60–70 нм. Необходимо отметить, что уменьшение d_n при увеличении рН реакционной смеси имело место и в серии опытов с высокомолекулярным ХТЗ [7]. При этом повышение концентрации ОХТ в реакционной системе практически не влияет на размер НЧ (56 нм).

Для дисперсий серебра, получаемых в среде ОХТ-12/24 с большей степенью ацетилирования, но с той же молекулярной массой, что и у ОХТ-12/5, при наименьших концентрациях прекурсора c повышением pH реакционной среды наблюдается уменьшение среднего размера частиц: d_n равен 119, 90 и 77 нм (табл. 2). Аналогичная тенденция имела место и при использовании ОХТ-12/5: d_n = 107, 65 и 70 нм. Однако при повышении концентрации прекурсора в этих системах в два раза заметной зависимости размера частиц от pH реакционной смеси уже не наблюдалось (d_n = 74, 68 и 77 нм соответственно). Интересно, что увеличение концентрации этого ОХТ в реакционной смеси приводит, в отличие от двух предыдущих серий экспериментов, к заметному увеличению размеров НЧ (до 82 нм).

Таким образом, мономодальные распределения НЧ серебра в исследованных системах зафиксированы в достаточно узких диапазонах концентраций реагентов. Дисперсии с наиболее узкими распределениями НЧ по размеру получены при мольном соотношении ОХТ : AgNO₃ : Na₂CO₃, равном 1 : 48 : 29 в случае использования ОХТ-6/5 и 1 : 192 : 58 в случае ОХТ-12/5 и ОХТ-12/24 (образцы №№ 2, 12 и 19 соответственно). При этом нанодисперсии на основе ОХТ-12/24 характеризуются меньшими коэффициентами вариации, чем образцы на основе других ОХТ (табл. 2), и более высокими (по модулю) значениями электрокинетического потенциала. Так, в случае ОХТ-12/24 K_v составляет от 1 до 4%, тогда как для систем с ОХТ-12/5 и ОХТ-6/5 – от 4.5 до 8% и от 3.3 до 18% соответственно. Визуальные наблюдения показали, что нанодисперсии на основе ОХТ-12/24 устойчивы в течение не менее 6 месяцев, в то время как в некоторых образцах на основе гидрохлоридов ОХТ за это время образуется осадок.

Выявленные зависимости размера НЧ серебра и K_v от состава и рН реакционных систем, вероятно, связаны с молекулярной структурой (содержанием ацилированных аминогрупп) и надмолекулярной организацией ОХТ в растворах. В связи с этим нами были исследованы методом ДРС растворы двух образцов ОХТ с одинаковой молекулярной массой (М_w = 12 кДа) – OXT-12/5 и OXT-12/24. Концентрации этих растворов ОХТ и значения их pH соответствовали параметрам соответствующих дисперсий серебра. В результате были получены растворы с мономодальным распределением числа полимерных частиц по размеру (рис. 4).

Несмотря на то, что за последние десятилетия накоплен значительный объем экспериментальных и теоретических данных о свойствах растворов ХТЗ (см., например, [24–26]), вопросу о его надмолекулярной организации в растворах уделяется большое внимание [27]. Так, известно, что в разбавленных растворах высокомолекулярного ХТЗ его макромолекулы находятся в виде агрегатов, размеры и плотность упаковки которых зависят как от рН и ионной силы раствора, так и от степени деацетилирования полимера [28–32]. Вместе с тем, сведения о надмолекулярной организации олигомерных ХТЗ в растворах отсутствуют. Можно предположить, что регистрируемые методом ДРС рассеивающие свет частицы также представляют собой агрегаты макромолекул ОХТ.

Из приведенных на рис. 4 данных следует, что средний размер частиц в растворе ОХТ-12/24 (примерно 350 нм) существенно больше, чем в растворе ОХТ-12/5 (250–270 нм). Такое отличие, вероятно, связано с тем, что молекулы ОХТ-12/24, содержащие большее число достаточно объемных ацетильных групп, склонны к образованию более рыхлых агрегатов в растворе, чем молекулы ОХТ-12/5. При этом различие в размерах агрегатов хитозана и образующихся в его растворе НЧ серебра может быть обусловлено изменением конформации молекул ОХТ в процессе синтеза НЧ.

Ранее [7] нами было показано, что при формировании нанодисперсий серебра в растворах высокомолекулярного ХТЗ этот полимер выполняет функции как восстановителя ионов серебра, так и стабилизатора образующихся НЧ. При этом главную роль играют амино- и гидроксильные группы высокомолекулярного ХТЗ. В настоящей работе, для выявления особенностей поведения ОХТ, были проведены аналогичные исследования методом ИК-спектроскопии.

На рис. 5 и 6 приведены спектры пленок, сформированных из растворов ОХТ-12/5 и ОХТ-12/24 (кривые 1) и из полученных в этих растворах нанодисперсий серебра (кривые 2). Видно, что спектры таких нанодисперсий значительно отличаются от спектров исходных ОХТ, причем изменение полос колебаний гидроксильных групп в спектрах обоих образцов практически одинаково. Так, на обеих кривых 2 составная полоса валентных колебаний гидроксильных и аминогрупп (согласно [19]) с максимумами при 3338 cм^–1 (ОХТ-12/5) и 3279 см^–1 (ОХТ-12/24) становится менее интенсивной и сдвигается в сторону бóльших значений длин волн. Интенсивность полос поглощений, относящихся к ν(С–О) гидроксильных групп, также сильно уменьшается. Отношение интенсивностей полосы деформационных колебаний С–О гидроксильных групп и полосы валентных колебаний С–Н (I₁₀₅₈/I₂₈₆₇), являющейся внутренним стандартом, в спектре ОХТ-12/5 равно 8.5, в спектре ОХТ-12/24 – 10, а в спектрах дисперсий серебра на их основе оно составляет соответственно 4.5 и 5.0. Другими словами, концентрация гидроксильных групп ОХТ в нанодисперсиях серебра становится примерно в два раза ниже, чем в исходном ОХТ. Это однозначно свидетельствует об участии ОН-групп обоих олигохитозанов в формировании НЧ.

Что касается проявлений колебаний амидных и аминных групп в спектрах, то здесь ситуация более сложная. В спектре гидрохлорида ОХТ присутствуют две полосы поглощения – при 1623 и 1521 см^–1. Необходимо помнить, что у этого ОХТ CА = 5%, т.е. амидных групп в молекуле очень мало. Если первая полоса однозначно относится к колебаниям С=О амидной группы [19], то вторая, более интенсивная, несомненно, является суммой колебаний NH аминных и амидных групп. В спектре системы НЧ–гидрохлорид ОХТ в этой области наблюдается лишь одна достаточно размытая полоса низкой интенсивности. Последнее обстоятельство свидетельствует не только об участии групп NH₂ в формировании НЧ серебра в растворе ОХТ, но и о серьезных изменениях конфигурации ацетамидных групп в молекулах олигохитозана в процессе синтеза НЧ в его растворе.

В спектре исходного ОХТ-12/24 в области 1700–1500 см^–1 также присутствуют полоса амид I (1635 см^–1) и сложная полоса с максимумом на 1519 см^–1 и плечом при 1568 см^–1, которая относится к колебаниям как NH амидной группы, так и аминных групп ОХТ. В спектре дисперсии Ag, полученной с использованием ОХТ-12/24, в отличие от предыдущего образца, видны 2 четкие полосы поглощения, причем положение полосы, отвечающей колебаниям С=О амидной группы полимера, практически не изменяется (1635 → → 1634 см^–1). Плечо на полосе 1519 см^–1 ОХТ становится максимумом полосы поглощения в случае дисперсии НЧ, а полоса 1519 см^–1 исчезает. Подобные эффекты были отмечены нами ранее [7] и могут быть связаны с комплексообразованием между первичными аминогруппами ХТЗ и катионами серебра, а также с образованием ионных пар этими аминогруппами и анионами ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ прекурсора. Так как СА данного ОХТ-12/24 составляет 24%, т.е. ацетамидных групп в молекуле ОХТ много, то большая их часть остается практически в неизмененной конфигурации.

Таким образом, согласно полученным результатам, в восстановлении ионов серебра из нитрата и стабилизации НЧ как в случае высокомолекулярного ХТЗ [7], так и в олигохитозанах, участвуют и аминогруппы, и гидроксильные группы молекул.

Проведенные эксперименты показали возможность синтеза достаточно крупных монодисперсных НЧ серебра. Предложен протокол, позволяющий получать (в определенных узких диапазонах значений pH и температуры) устойчивые дисперсии серебра с мономодальным распределением НЧ по размеру при их среднем размере от 45 до 90 нм.