Коллоидный журнал, 2023, T. 85, № 3, стр. 376-389

ВВЕДЕНИЕ

Силикатные (кремнеземные, SiO₂) наночастицы представляют значительный интерес для множества приложений, включая фотонику [1], биомедицину [2], биосенсинг [3], катализ [4] и многие другие [5, 6], благодаря простоте синтеза, возможности получать частицы в широком диапазоне размеров, биоинертности и высокой химической стабильности. Следует отметить, что для ряда перспективных приложений требуется строгий контроль размеров и полидисперсности образцов. Например, для получения плотноупакованных двумерных коллоидных кристаллов, которые используются в качестве компонентов детекторов газа [7] или фотонных устройств [8], подходят только коллоиды с полидисперсностью менее 5%, а положения максимума отражения света в таком кристалле определяется размером частиц согласно закону Брэгга [9]. Отмечалось также, что полидисперсность частиц является существенным препятствием для получения высококачественных синтетических опалов [10] и золотых нанооболочек на кремнеземных ядрах [11].

В 1968 г. Штобер и соавторы опубликовали метод получения силикатных наночастиц путем гидролитической конденсации силикатных прекурсоров в среде одноатомного спирта с использованием аммиака в качестве катализатора [12]. Метод заключался в простом смешивании реагентов при комнатной температуре и реакции в течение 2–3 ч при постоянном перемешивании. Размер частиц в оригинальной работе составлял от десятков до сотен нанометров и контролировался путем изменения концентрации аммиака, вида спирта (метанол, этанол, изопропанол), а также вида силанового прекурсора. Метод Штобера оказался настолько прост, что за последующие пятьдесят лет тысячи научных коллективов успешно применили его модификации для синтеза SiO₂ наночастиц в своих лабораториях, а оригинальная статья имеет более двенадцати тысяч цитирований. На сегодняшний день есть консенсус, что наиболее простой и воспроизводимой является модификация метода с использованием этанола в качестве растворителя и тетраэтилортосиликата в качестве прекурсора [13]. Контроль размера здесь осуществляется путем варьирования концентрации тетраэтилортосиликата, аммиака и воды. Двухстадийная реакция гидролитической конденсации имеет вид:

Несмотря на простоту и воспроизводимость реакции, метод Штобера имеет ряд ограничений. Во-первых, с помощью него невозможно получить коллоиды с диаметром частиц менее 50 нм (некоторые авторы указывают нижний порог 70 нм [14]). Следует отметить, что для синтеза таких малых частиц чаще используют другие методики, такие как синтез в мицеллах и микроэмульсиях [15, 16] или гидролиз в присутствии аминокислот в водной среде [17, 18], распространен также синтез пористых силикатных наночастиц с добавлением ПАВ [19]. Однако эти подходы уступают в простоте и воспроизводимости методу Штобера. Во-вторых, сравнительно монодисперсные коллоиды (<5%) получаются только для размеров частиц 120–500 нм [20, 21], в то время как для меньших и больших частиц полидисперсность достигает 20% [20]. Это обусловлено тем, что при синтезе происходит непрерывное образование и рост зародышевых частиц, а добавление в реакционную смесь слишком малого или слишком большого количества тетраэтилортосиликата нарушает баланс между скоростью гидролиза и конденсации. За последние 50 лет было предпринято множество попыток построить кинетические кривые реакции и получить оптимальные соотношения компонентов для получения монодисперсных коллоидов. Были исследованы множество различных параметров, включая концентрации реагентов, скорость и порядок их добавления, температуру реакции, скорость перемешивания и многие другие [5]. Особенно следует отметить работу Богуша и Жуковски [22], в которой предлагался процесс многоступенчатого доращивания частиц, состоящий в разделении общего требуемого количества ТЭОС на порции и постадийного их добавления в реакционную среду после завершения предыдущей стадии роста. В дальнейшем метод многостадийного доращивания частиц для получения частиц заданного размера широко использовался многими исследователями [20, 23]. Несмотря на это, до настоящего времени нет единого универсального подхода, позволяющего получать монодисперсные коллоиды в широком диапазоне размеров.

Одним из возможных решений проблемы полидисперсности может стать использование многостадийного протокола, при котором частицы, полученные на определенной стадии, используются как центры конденсации (“зародыши”) для роста более крупных частиц. Основными задачами на пути реализации этого подхода являются получение малых (менее 50 нм) монодисперсных зародышевых частиц для первой стадии доращивания и дальнейший контроль отсутствия образования вторичных зародышей. Данная идеология применялась ранее для получения силикатных наночастиц с диаметрами от 20 до 200 нм путем гидролиза тетраэтилортосиликата в водной среде в присутствии l-аргинина [21]. Ранее авторы работы [21] и мы в работе [24] показали, что эти частицы могут использоваться в качестве зародышей для доращивания в более крупные частицы модифицированным методом Штобера. В настоящей работе мы демонстрируем, что методика многостадийного доращивания может быть использована для получения силикатных наночастиц с контролируемым размером в диапазоне 50–3000 нм и полидисперсностью менее 5%. Дополнительными преимуществами разработанной методики постадийного доращивания являются отсутствие необходимости использовать абсолютизированный этанол и возможность включать в состав силикатной матрицы функциональные молекулы и наночастицы, например, флуорофоры или репортеры гигантского комбинационного рассеяния (ГКР).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для синтеза силикатных “зародышевых” частиц с размерами в диапазоне 30–50 нм мы использовали модифицированный метод Штобера с добавлением в реакционную смесь полиакриловой кислоты (ПАК). В присутствии аммиака происходит агломерация молекул ПАК с образованием нерастворимого в этаноле комплекса ПАК-NH₃ [27]. Данный комплекс служит затравкой для дальнейшего синтеза кремнезема. Это, совместно с постепенным добавлением тетраэтилортосиликата в течение 4 ч, приводит к отсутствию вторичного “зародышеобразования” и синтезу монодисперсного коллоида. Следует отметить, что важность постепенного добавления ТЭОС для получения монодисперсных коллоидов отмечалась в работе Богуша и Жуковски [22]. Детальное исследование влияния скорости добавления прекурсоров было позже проведено также в работе [23]. Одномоментное введение большого количества ТЭОС приводит к значительному превышению критической концентрации по продуктам гидролиза и, как следствие, к мультимодальности распределения частиц по размерам и их коагуляции.

Нa рис. 2а показано электронно-микроскопическое изображение силикатных наночастиц, полученных при добавлении 2.5 мг ПАК в реакционную смесь. Видно, что частицы имеют квазисферическую форму. Гистограмма распределения по диаметрам представлена на вставке рис. 2а. Средний размер частиц составляет 48 нм, а среднеквадратичное отклонение диаметров 2 нм. Здесь и далее в статье электронно-микроскопическое определение среднего размера и стандартного отклонения выполнялось при обсчете 200 наночастиц на изображениях. Следует отметить принципиально важную роль ПАК в формировании относительно монодисперсного коллоида с диаметром частиц менее 70 нм. Например, при соблюдении всех условий синтеза за исключением добавления ПАК, происходит формирование полидисперсного коллоида со средним диаметром частиц 170 нм (см. Приложение рис. 7). Увеличение концентрации ПАК приводит к увеличению центров конденсации и, следовательно, к уменьшению среднего размера силикатных частиц. Например, на рис. 2б показано электронно-микроскопическое изображениe частиц, полученных при добавлении 5 мг ПАК в реакционную смесь. Видно сохранение квазисферической формы кремнезема, уменьшение среднего диаметра до 29 нм. Дальнейшее увеличение количества добавляемой ПАК до 10 мг приводит к формированию малых частиц различных форм со средним размером менее 20 нм. Предположительно эти структуры можно охарактеризовать как комплекс из конденсированного силиката и полиакриловой кислоты. Еще одним важным моментом на пути к получению монодисперсных частиц с диаметром менее 70 нм является низкая скорость поступления ТЭОС в реакционную смесь. Мы заметили, что изменение протокола реакции с четырехчасового введения на одномоментное добавление всего прекурсора приводит к формированию агрегированного коллоида (см. Приложение рис. 8). Наконец, мы обнаружили важность использования ПАК с низким молекулярным весом (1.8 кДа). При использовании ПАК с молекулярными весами 35 и 100 кДа наблюдается помутнение ростового раствора и выпадение осадка еще до начала добавления тетраэтилортосиликата. Очевидно, что при взаимодействии аммиака с полиакриловой кислотой с высокой молекулярной массой образуются полидисперсные микро и наночастицы, которые не могут служить “зародышами” для дальнейшего синтеза монодисперсных силикатных частиц.

Следующим этапом в работе была реализация методики доращивания “зародышевых” частиц до требуемого размера. В качестве первичных “зародышей” мы использовали частицы, показанные на рис. 2а. На рис. 3 показаны типичные электронно-микроскопические изображения силикатных частиц, полученных на 1–9 шагах доращивания. Видно, что все частицы имеют сферическую форму, относительно изодисперсны и не агрегированы. Размер получаемых частиц последовательно растет с каждой стадией доращивания от 50 нм для изначальных частиц до 3 мкм на последнем шаге. Измеренные по данным электронной микроскопии средние диаметры частиц совместно с их стандартными отклонениями (по результатам обсчета не менее 200 частиц) показаны в табл. 1.

Следует отметить, что во всех случаях стандартное отклонение не превышало 5%. На каждом шаге доращивания с первого по шестой размер частиц увеличивается в среднем на 70%, что хорошо согласуется с данными массового баланса. Действительно, отношение добавляемого ТЭОС к гидролизованному при получении зародышей равно 5 к 1. Следовательно, размер частиц должен увеличиваться в корень кубический из 5 раз, то есть около 1.7 раз. Массовый баланс косвенно свидетельствует о том, что не образуется новых зародышей, т.е. площади поверхности затравок достаточно, чтобы в данных конкретных условиях проведения процесса “утилизировать” все формы образующегося кремнезема. Обратная ситуация наблюдается для более поздних шагов доращивания. Мы заметили, что при использовании 6 мл “зародышевых” частиц в реакции наблюдается лишь небольшое увеличение их размеров, а коллоид содержит огромное количество дополнительных силикатных частиц малого размера (см. Приложение рис. 9). Мы предполагаем, что это связано с существенным уменьшением суммарной площади поверхности “зародышевых” частиц на поздних шагах доращивания. Действительно, если измеренная массовая концентрация диоксида кремния во всех коллоидах отличалась не сильно (варьировалась от 8 до 11 мг/мл), то число частиц отличается в 10⁴ раз для первого и шестого шага доращивания согласно формуле (3). Таким образом, даже несмотря на увеличение размера, суммарная площадь поверхности падает в 20 раз. В случае получения целевых силикатных частиц диаметром 1 мкм и более, отмывка от вторичных частиц (размеры которых согласно ПЭМ менее 200 нм) не составляет труда. В нашей работе мы использовали шестикратное осаждение/ресуспендирование, причем ускорение при центрифугировании подбиралось таким образом, чтобы минимизировать осаждение вторичных наночастиц. Дополнительно мы увеличили количество добавляемых на шагах 6–10 доращивания “зародышей” в два раза – с шести до двенадцати миллилитров. Это позволило уменьшить потери ТЭОС на образование побочных частиц, однако уменьшило максимально возможный шаг увеличения размера при каждом этапе доращивания с 70 до 30%. Следует также отметить, что контроль размеров частиц может осуществляться не только числом шагов доращивания, но и количеством добавляемого ТЭОС на каждом этапе. Например, уменьшение количества ТЭОС с 0.75 до 0.3 мл на втором шаге позволяет уменьшить размер получаемых частиц со 176 до 128 нм (см. табл. 1). Аналогично уменьшение количества ТЭОС на пятом шаге до 0.25 и 0.5 мл позволяет получать частицы с размерами 700 и 860 нм.

Обсудим теперь оптические свойства получаемых частиц. На рис. 4 показаны спектры оптической плотности силикатных наночастиц, получаемых на 1–10 шаге доращивания, а также спектр исходных 50 нм “зародышей”. Все кривые на графиках нормированы к концентрации кремнезема 4 мг/мл. Полученные спектры типичны для непоглощающих сферических частиц. В частности, для частиц с размерами менее 2 мкм наблюдаются спадающие кривые без экстремумов, что объясняется более эффективным рассеянием света в коротковолновом спектральном диапазоне. Для более крупных частиц существует максимум рассеяния в видимой области за счет интерференционных эффектов. При выполнении условий однократности рассеяния [28], оптическая плотность коллоида является суммой потери энергии светового пучка на отдельных частицах и может быть представлена в виде:

где $N - $число рассеивающих частиц в единице объема, $R - $ их радиус, $n$ – относительный показатель преломления частиц, $Q(R,n)$ – коэффициент рассеяния. Плавный характер зависимости мутности или оптической плотности на небольшом интервале длин волн позволяет аппроксимировать спектр мутности соотношением Ангстрема [29]:

Показатель степени или волновой экспонент $w$ численно равен тангенсу угла наклона спектра мутности в двойных логарифмических координатах, взятому со знаком минус.

Подстановкой (4) в (5) можно получить зависимость волнового экспонента от радиуса частиц и их показателя преломления. Ранее нами были получены калибровочные зависимости для определения среднего размера монодисперсных силикатных частиц по волновому экспоненту [30].

Другим распространенным методом определения размеров частиц является динамическое рассеяние света [31]. Мы решили сравнить результаты определения размеров частиц тремя методами: ПЭМ, спектротурбидиметрия (СТТ) и динамическое светорассеяние (ДРС). Результаты сравнительных измерений показаны в табл. 2. Видно хорошее согласие данных для методов электронной микроскопии и спектротурбидиметрии, что ожидаемо, учитывая монодисперсность и сферичность коллоидов. Следует также отметить завышение результатов метода ДРС по сравнению с другими методиками, которое часто объясняется наличием приповерхностного слоя, влияющего на гидродинамические свойства частиц.

В последние годы большое внимание уделяется получению и использованию функциональных наночастиц и наноматериалов [32]. С этой точки зрения разработанная многостадийная методика доращивания представляется перспективной в связи с возможностью включать послойно в объем или на поверхность частиц функциональные молекулы и/или наночастицы. Для демонстрации этой возможности мы синтезировали наночастицы с включенными флуоресцентными молекулами. Методика синтеза соответствовала этапу 4 доращивания силикатных частиц, однако в момент доращивания в реакционную смесь добавлялся конъюгированный с аминосиланом краситель (флуоресцин изотиоцианат, ФИТЦ). Следует отметить, что методика позволяет получать частицы с любым красителем, способным реагировать с аминогруппой. Например, аналогичные результаты мы получали с активированными эфирами бордипиррометена.

На рис. 5а показаны электронно-микроскопические изображения синтезированных силикатных частиц с инкорпорированными в поверхностный слой молекулами ФИТЦ. Средний размер полученных частиц равнялся 388 нм. На увеличенном изображении частицы на вставке рис. 5а можно различить поверхностный флуоресцентный слой толщиной около 40 нм. Отметим, что инкорпорация флуоресцентных молекул не влияла на коллоидные свойства, то есть не приводила к повышению степени полидисперсности, агрегации частиц или их способности выступать в качестве зародышей для дальнейшего доращивания. На рис. 5б показаны спектры оптической плотности и флуоресценции полученных композитных частиц. Спектр флуоресценции измерен при возбуждении светом с длиной волны 488 нм. Экстинкция композитных частиц представляет собой суперпозицию спектра экстинкции силикатного коллоида и молекулярного красителя. Это позволяет провести оценку количества молекул красителя в одной частице. Определенная по взвешиванию сухого остатка массовая концентрация кремнезема в коллоиде составляет 4 мг/мл. Учитывая плотность кремнезема 1.7 г/см³ и диаметр частиц 400 нм, числовая концентрация частиц равна 7.4 × 10¹⁰ шт/мл. Определенная по спектрофотометрической калибровке [33] концентрация ФИТЦ равна 0.27 мкг/мл. Учитывая молярную массу ФИТЦ, равную 389 г/моль, числовая концентрация молекул красителя равна 4.16 × 10¹⁴ шт./мл. Таким образом, на одну частицу приходится около 5600 молекул красителя. Если предположить равномерное распределение молекул красителя в 40-нанометровой оболочке, то среднее межмолекулярное расстояние будет равно около 14 нм. При таких расстояниях эффект концентрационного тушения флуоресценции маловероятен. Это подтверждается наблюдаемым спектром флуоресценции наночастиц (рис. 5б), который точно соответствует спектру молекулярного красителя, как по положению, так и по интенсивности. Следует также отметить, что яркость единичной метки (частицы с инкорпорированными молекулами красителя) достаточна для визуализации единичных частиц. В качестве примера на рис. 10 в Приложении показано конфокальное флуоресцентное микроскопическое изображение клетки HeLa, инкубированной с флуоресцентными наночастицами. Существенным препятствием на пути использования органических красителей в методике флуоресцентной микроскопии является фотообесцвечивание. В настоящее время считается, что основной механизм фотообесцвечивания заключается в фотохимической реакции с синглетным кислородом [34]. С этой точки зрения включение флуоресцентных красителей в кремнеземную матрицу должно повышать их фотостабильность. Для проверки этого предположения мы провели измерение интенсивности флуоресценции от 1 мМ раствора ФИТЦ и кремнеземных частиц с инкорпорированным красителем при постоянном облучении в течение 300 с. Облучение проводили с использованием флуоресцентного микроскопа Leica DMI 3000-B с использованием 40× объектива и синего светофильтра (средняя длина волны 480 нм). Через каждые 15 с проводилось фотографирование флуоресценции с постоянной экспозицией и диафрагмой. Далее средняя интенсивность пикселей на изображении оцифровывалась с помощью программы ImageJ и нормировалась на максимальную интенсивность в начальный момент времени. На рис. 5в в верхнем ряду показаны серии изображений флуоресценции ФИТЦ и кремнеземных наночастиц (и их агрегатов), полученные в течение 75 с облучения. Очевидно практически полное фотообесцвечивание красителя в растворенном состоянии, в то время как при включении ФИТЦ в кремнеземную матрицу интенсивность флуоресценции сокращается не более чем на 15% за 75 с облучения. На рис. 5в также представлена динамика фотообесцвечивания при облучении в течение 300 с. Треугольниками показаны данные для раствора ФИТЦ, кружками для наночастиц и их агрегатов. Определенная как тангенс угла наклона кривой в нулевой точке, скорость фотообесцвечивания сокращалась в пять раз при включении красителя в кремнеземную матрицу.

Другим примером эффективной встройки функциональных объектов внутрь силикатной матрицы служит получение наночастиц с инкорпорированными ГКР-метками. ГКР-метки состоят из металлических наночастиц с адсорбированными молекулами с высоким сечением комбинационного рассеяния. В нашей работе мы использовали 13 нм золотые наночастицы с адсорбированными молекулами нитробензентиола. Данные ГКР-метки были адсорбированы на силикатные частицы перед 4 шагом доращивания.

На рис. 6 представлены ПЭМ фотографии 300 нм силикатных сфер, используемых в качестве ядер (панель (а)), тех же сфер, после адсорбции ГКР-меток (панель (б)) и после доращивания дополнительной силикатной оболочки (панель (в)). Частицы сохраняют монодисперсность и коллоидную стабильность на всех этапах получения композитного образца. В результате ГКР-метки инкорпорированы внутрь силикатной частицы, а толщина вторичной силикатной оболочки составляет около 100 нм. Следует отметить, что из-за большой толщины оболочки золотые частицы внутри кремнезема не видны на обычном ПЭМ изображении. Однако, при использовании режима рассеянных электронов и фильтра по энергии рассеяния, соответствующего кремнию, ГКР-метки могут быть легко визуализированы (см. вставку на панели (в)). На рис. 6г показаны спектры ГКР полученного коллоида композитных частиц. В соответствии с нашими предыдущими измерениями [35], в спектрах ГКР для всех образцов преобладают пики нитробензола: π (CC) при 723 cм^–1, π (CH) при 854 см^–1, ν (CS) при 1081 см^–1, δ (CH) при 1110 см^–1, ν (NO₂) при 1343 см^–1 и ν (CC) при 1569 см^–1 с наиболее интенсивным пиком на 1343 см^–1, связанным с вибрацией нитрогруппы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе был использован метод последовательного доращивания силикатных частиц, получаемых гидролитической конденсацией тетраэтилортосиликата в спирто-водной среде с использованием щелочного катализатора, для получения частиц большого диаметра (до 3 мкм). Ключевым моментом является создание условий направленной гидролитической конденсации тетраэтилортосиликата на поверхности “зародышей” за счет варьирования концентрации частиц, уменьшения скорости добавления прекурсора и очистки от вторичных зародышей путем центрифугирования/ресуспендирования образца. Данная методика позволяет получать частицы с размером в диапазоне от 50 нм до 3 мкм. Размер получаемых частиц контролируется числом шагов доращивания и количеством добавляемого тетраэтилортосиликата. Полученные образцы были охарактеризованы методами просвечивающей электронной микроскопии, спектротурбидиметрии и динамического светорассеяния.

Синтез монодисперсных силикатных частиц в широком диапазоне размеров является не единственным преимуществом многостадийной методики доращивания. Показано, что разработанный подход позволяет получать функциональные наночастицы за счет включения в состав флуоресцентных молекул и ГКР-меток без изменения коллоидной стабильности и монодисперсности образца. Мы полагаем, что полученные наночастицы могут найти применения в различных областях, включая фотонику и биомедицину.