Коллоидный журнал, 2023, T. 85, № 5, стр. 583-592

ВВЕДЕНИЕ

Благодаря своим свойствам холестерические жидкокристаллические дисперсии ДНК, получаемые методом psi-конденсации (также ψ; акроним слов “Polymer and Salt Induced” [1]), имеют большой потенциал для решения фундаментальных и практических задач биологии и медицины. С одной стороны, они являются удобными модельными системами, поскольку плотная упаковка молекул ДНК в частицах ХЖКД в определенной степени воспроизводит ее организацию in vivo [2–4]. С другой стороны, psi-ДНК обладает выдающимся по интенсивности сигналом кругового дихроизма (КД), который может как выступать маркером тех или иных физических воздействий [5–8], так и использоваться для обнаружения биологически активных соединений [9]. Более того, различные низкомолекулярные соединения, а также наночастицы (НЧ) металлов можно целенаправленно интегрировать в частицы ХЖКД ДНК [10–14], что позволяет значительно расширить функциональные возможности последних. Впрочем, введение таких агентов может оказывать негативное влияние на упорядоченную организацию молекул ДНК. Так, например, в работах Евдокимова и соавт. [15–17] продемонстрировано и подробно исследовано деструктивное действие на частицы ХЖКД ДНК ультрамалых НЧ золота, полученных восстановлением ионов Au³⁺ хлоридом тетракис(гидроксиметил)фосфония (ТГФХ) – так называемым методом Даффа [18, 19]. Изучению этого явления посвящены и наши недавние работы [20, 21].

Сопоставляя полученные нами результаты с данными Евдокимова и соавт., можно заметить, что несмотря на качественное сходство наблюдаемых эффектов в их количественном выражении наблюдаются расхождения. Так, например, мы регистрировали весьма небольшое различие в величинах деструктивного действия НЧЗ в случае их предварительной инкубации в заданной концентрации с раствором ДНК и при введении в такой же концентрации в готовую ХЖКД [21]. В то же время Евдокимов и соавт. отмечали, что значения концентрации НЧЗ, при которых для этих двух путей их введения в систему наблюдались близкие по величине эффекты, различались более чем на порядок [17]. Мы полагаем, что такие расхождения отчасти могут быть обусловлены состоянием НЧЗ. Действительно, при анализе опубликованных работ видны существенные различия в “возрасте” использованных НЧЗ. Например, в работе Евдокимова и соавт. [16] использовался гидрозоль НЧЗ, хранившийся после синтеза около 2.5 мес, в то время как мы изучали либо свежеприготовленные НЧЗ [21], либо их гидрозоли возрастом более 6 мес [20]. При этом хорошо известно, что свойства НЧ могут заметно изменяться в процессе их “старения” [22–24]. Этот факт отмечали и для ультрамалых НЧЗ, синтезированных по методу Даффа [25, 26]. Поэтому целью настоящей работы являлось исследование влияния возраста таких НЧЗ на их взаимодействие с молекулами ДНК в частицах ее ХЖКД.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для приготовления ХЖКД использовали коммерческие препараты выделенной из молок осетровых или лососевых рыб и деполимеризованной ультразвуком ДНК (Деринат®; (0.25–0.5) × 10⁶ Да; Техномедсервис, Россия) и полиэтиленгликоля (ПЭГ, 4000 Да; Sigma, США). Их растворы готовили на основе водно-солевого буфера, содержащего 10^–2 М NaH₂PO₄ и 0.3 M NaCl (pH ≈ 7.4), а полученные после смешения этих растворов образцы интенсивно перемешивали и выдерживали при комнатной температуре до окончательного формирования оптически активной дисперсии. Содержание ПЭГ в конечной системе было фиксированным и составляло 170 мг/мл (17%), тогда как концентрацию ДНК варьировали от 1.27 × 10^–5 до 2.03 × 10^–4 М (для определения ее концентрации использовали значение коэффициента экстинкции ε₂₆₀ ≈ 6600 М^–1 см^–1). Индикатором образования ХЖКД ДНК являлось появление на спектре КД интенсивной отрицательной полосы (также называемой аномальной [27]) в области длин волн λ = 260–280 нм.

Процедура синтеза исходных сферических НЧЗ, средний размер которых непосредственно после получения составлял ≈2.5 нм, а также методы анализа их характеристик детально описаны в наших предыдущих работах [13, 14]. Были приготовлены три гидрозоля НЧЗ, которые после определения их исходных характеристик выдерживали в холодильнике при температуре 4°C в течение 1, 6 и 12 мес (далее они обозначаются как золи I, II и III соответственно). Затем эти золи были повторно охарактеризованы и сразу же использованы в эксперименте. Были рассмотрены два различных способа введения НЧЗ в систему: 1) раствор ДНК в течение 20–30 мин инкубировали с НЧЗ при комнатной температуре, после чего добавляли в систему 34%-ный раствор ПЭГ в пропорции 1 : 1, индуцируя образование ХЖКД, 2) НЧЗ вносили в предварительно приготовленную ХЖКД ДНК дробно (с шагом 20 мкл) с соблюдением тех же условий инкубации, что и в первом способе.

Регистрацию спектров поглощения НЧЗ, а также определение концентрации ДНК проводили с помощью спектрофотометра UV-3101 PC (Shimadzu, Япония) в прямоугольных кварцевых кюветах сечением 1.0 см × 0.4 см. Спектры динамического рассеяния света (ДРС) гидрозолями I–III регистрировали с помощью прибора Zetasizer Nano ZS (Malvern, Великобритания). Спектры КД измеряли, используя дихрограф СКД-2, разработанный и произведенный в лаборатории лазерно-спектрального приборостроения Института спектроскопии РАН [28], и кварцевые кюветы сечением 1.0 см × 1.0 см. Спектры КД представляли в виде зависимости разницы поглощения лево- и правополяризованного света $\Delta A = {{A}_{{\text{L}}}}--{{A}_{{\text{R}}}}$ от длины волны λ. Для измерения кинетики формирования аномального КД-сигнала ХЖКД ДНК растворы ДНК и ПЭГ смешивали вручную непосредственно в кюветном отделении дихрографа (“мертвое время”, затраченное на перемешивание полученной смеси, составляло 3–7 с). Экспериментальные данные обрабатывали с помощью уравнения

Погрешность определения констант скорости k_i не превышала 10%.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе исследованы синтезированные методом восстановления ионов ${\text{AuCl}}_{4}^{ - }$ хлоридом ТГФХ по Даффу гидрозоли ультрамалых сферических НЧЗ разного возраста: 1, 6 и 12 мес (золи I, II и III соответственно). На рис. 1 представлены результаты их анализа методом спектроскопии поглощения в УФ и видимой областях. Известно, что спектр поглощения таких НЧЗ сразу после приготовления обычно представляет собой плавно спадающую в диапазоне от 190 до 1100 нм кривую, а их старение сопровождается появлением широкой полосы с максимумом вблизи 500 нм, свидетельствующей о возникновении у частиц локализованного поверхностного плазмонного резонанса [18, 25]. В полном соответствии с этими данными, в спектре золя I в данной области наблюдается лишь незначительное увеличение поглощения (кривая 1), в то время как для золя II, возраст которого составляет 6 мес, интенсивность этой полосы существенно возрастает (кривая 2), а в случае золя III, хранившегося 12 мес, спектр характеризуется ярко выраженным плазмонным пиком (кривая 3). Такое поведение спектра поглощения свидетельствует о постепенном совершенствовании кристаллической решетки ультрамалых НЧЗ, т.е. об их переходе из квазиметаллического состояния в металлическое [18, 29]. Отметим, что размеры НЧЗ (по данным ДРС – примерно от 2.5 до 3.5 нм в золях разного возраста) позволяют предположить возможность их встраивания между холестерическими слоями ДНК в соответствии с существующей теорией [16], поскольку расстояния между этими слоями, согласно имеющимся представлениям [30], должны составлять от ≈4.9 до ≈3.2 нм.

Рис. 1.

Спектры поглощения использованных гидрозолей золота разного возраста: 1 (1), 6 (2) и 12 мес (3). Концентрация НЧЗ во всех случаях составляла 10.45 × 10^–8 М. Спектры нормированы на величину оптической плотности на длине волны λ = 300 нм.

Как было сказано выше, возможны два принципиально различающихся способа инкорпорирования НЧЗ в частицы ХЖКД ДНК: внесение золя золота в готовую холестерическую дисперсию или предварительная инкубация раствора ДНК с частицами золя с последующей psi-конденсацией молекул нуклеиновой кислоты при добавлении ПЭГ [17, 21]. На рис. 2 на примере НЧЗ возрастом 6 мес (золь II) сопоставлены данные об их деструктивном действии на упорядоченную структуру частиц ХЖКД ДНК при двух этих вариантах введения в систему (концентрация ДНК в обоих случаях составляла 1.35 × 10^–4 М)¹¹. Видно (рис. 2а), что при обработке золем золота готовой дисперсии характерный для холестерической упаковки ДНК аномальный сигнал КД частично сохраняется даже в случае максимальной исследованной концентрации НЧЗ, равной 19.33 × 10^–8 М (хотя его амплитуда и уменьшается при этом более чем в четыре раза). В случае же предварительной инкубации ДНК с НЧЗ наблюдается значительно более сильное падение амплитуды КД-сигнала формируемой затем ХЖКД. Так, уже при концентрации НЧЗ, равной 12.42 × 10^–8 М, его интенсивность составляет только около 5% от исходного значения, а при концентрации НЧЗ 14.25 × 10^–8 М спектр КД очень похож на характерную для изотропного раствора ДНК кривую с разнонаправленными полосами с максимумами вблизи 240 и 270 нм (рис. 2б). Зависимости интенсивности сигнала КД, нормированной на ее исходное значение, от концентрации НЧЗ золя II для обоих вариантов их введения в ХЖКД показаны на рис. 2в. Видно, что ход кривых отклоняется от линейного, который в аналогичных координатах ΔA/ΔA₀–[H₂O] или ΔA/ΔA₀–[(CH₃)₂SO] (ΔA₀ и ΔA – значения амплитуды сигнала КД до и после обработки системы) характерен для случая разрушения холестерической упаковки ДНК за счет уменьшения осмотического давления раствора ПЭГ, стабилизирующего частицы дисперсии, при разбавлении системы водой или диметилсульфоксидом соответственно.

Рис. 2.

КД-спектры ХЖКД ([ДНК] = 1.35 × 10^–4 М), измеренные в присутствии разных количеств НЧЗ возрастом 6 мес (золь II): (а) введение НЧЗ в готовую ХЖКД, (б) предварительная инкубация ДНК с НЧЗ. (в) Зависимости пиковой интенсивности КД-полосы от концентрации НЧЗ при обработке ими готовой ХЖКД (1) и в случае их предварительной инкубации с ДНК (2). Все значения ΔA нормированы на абсолютное значение амплитуды КД-сигнала для соответствующего контрольного образца ХЖКД, не содержащего НЧЗ. Стандартные отклонения, рассчитанные по трем независимым измерениям, не превышают 7%.

На рис. 3 сопоставлены результаты изучения разрушения ХЖКД ДНК под действием НЧЗ всех трех исследуемых золей при двух разных способах их введения в систему. Эти данные представлены в виде зависимостей от концентрации НЧЗ ([НЧЗ]) отношения ΔA₀/ΔA, а также отношения (ΔA₀/ΔA)_до/(ΔA₀/ΔA)_после, где нижние индексы “до” и “после” указывают на введение НЧЗ в систему до и после формирования ХЖКД.

Рис. 3.

Сопоставление зависимостей степени разрушения ХЖКД ДНК ([ДНК] = 1.35 × 10^–4 М) от концентрации НЧ исследуемых золей золота при их введении в готовую дисперсию (а) и в случае предварительной инкубации с ДНК (б). (в) Отношение степеней разрушения холестерической микрофазы ДНК при этих двух способах введения НЧЗ в ХЖКД. Номера кривых соответствуют НЧЗ разного возраста: 1 – золь I, 2 – золь II, 3 – золь III. Стандартные отклонения, рассчитанные по трем независимым измерениям, не превышают 7% (а, б) и 10% (в).

Обратим внимание на вид кривых на рис. 3а, демонстрирующем уменьшение интенсивности аномального КД-сигнала относительно ее исходного значения при обработке НЧЗ готовой ХЖКД ДНК. Для НЧЗ золей II и III результаты близки: различия между кривыми 2 и 3 составляют менее 10%. Ход обеих зависимостей почти линеен, что хорошо согласуется с результатами нашей недавней работы, где были исследованы НЧЗ схожего возраста [20]. Довольно хорошо согласуются и соответствующие численные значения степени разрушения упорядоченной упаковки ДНК. В случае золя I начальный участок зависимости ΔA₀/ΔA от [НЧЗ] тоже близок к линейному, однако, начиная с концентрации НЧЗ, равной примерно 10.45 × 10^–8 М, рост значений ΔA₀/ΔA становится более интенсивным (см. кривую 1 на рис. 3а). Такой ход этой зависимости аналогичен наблюдавшемуся нами при изучении взаимодействия с ХЖКД ДНК свежесинтезированных ультрамалых НЧЗ [21].

Отметим, что в исследованном диапазоне концентраций НЧЗ при данном способе их введения в ХЖКД ДНК значения степени ее разрушения частицами золя I отличаются от соответствующих значений для частиц золей II и III не более чем на 25%.

В случае предварительной инкубации ДНК с НЧЗ золей II и III результаты также оказались близки между собой. Различия в значениях ΔA₀/ΔA составляют не более 20% (сравните кривые 2 и 3 на рис. 3б), однако обе зависимости имеют выраженный экспоненциальный характер. При этом значения степени разрушения ХЖКД ДНК для максимальной исследованной концентрации этих НЧЗ более чем на порядок превосходят величины, полученные при обработке готовой дисперсии (кривые 2 и 3 на рис. 3в). В то же время изменения в степени разрушения ХЖКД после предварительного контакта ДНК с НЧЗ “свежего” золя I по сравнению с регистрируемыми после обработки ими готовой ХЖКД весьма незначительны (различия не превышают 15%, кривая 1 на рис. 3в). Как и в нашей недавней работе [21], в этом случае зависимость ΔA₀/ΔA от [НЧЗ] имеет более продолжительный линейный участок (вплоть до [НЧЗ] = 16.00 × 10^–8 М, см. кривую 1 на рис. 3б), чем при обработке готовой ХЖКД ДНК.

Таким образом, предварительная инкубация ДНК с ультрамалыми НЧЗ достаточно большого возраста способствует более сильной последующей деструкции структуры частиц ее ХЖКД (точнее, сильнее препятствует образованию соответствующей холестерической дисперсии). Кроме того, полученные результаты позволяют предположить, что свойства ультрамалых НЧЗ, полученных по методу Даффа, весьма существенно трансформируются в первые 6 мес после синтеза (по крайней мере, в части их взаимодействия с ДНК). При этом помимо уже отмеченной металлизации НЧЗ, обусловленной совершенствованием их кристаллической структуры, может, очевидно, изменяться и химия их поверхности. Более подробный анализ этих изменений, которые должны сказываться на взаимодействии НЧЗ с ДНК, явится целью наших дальнейших исследований. А пока можно сделать следующие предварительные выводы. Во-первых, поскольку НЧЗ всех трех использованных золей по данным ДРС весьма близки по размеру, они должны обладать примерно одинаковой способностью проникать в микрочастицы заранее сформированной ХЖКД ДНК и возмущать/разрушать их упорядоченную структуру. Это в целом и демонстрирует рис. 3а. Во-вторых, судя по рис. 3б, химия поверхности НЧЗ возрастом 1 мес. еще заметно отличается от таковой у НЧЗ большего возраста, причем таким образом, что эти НЧЗ взаимодействуют с молекулами ДНК существенно слабее, чем НЧЗ возрастом 6 и 12 мес, и, в отличие от них, значительно меньше влияют на образование частиц ХЖКД. В то же время поверхностные свойства НЧЗ золей II и III, по-видимому, уже достаточно близки, что и обуславливает практически одинаковое их воздействие на формирование ХЖКД ДНК.

Еще одним фактором, который, по нашему мнению, может обуславливать различия в величине деструктивного действия НЧЗ на ХЖКД ДНК при двух разных способах их инкорпорирования в эту систему, является концентрация самой нуклеиновой кислоты. Известно, что размер агрегатов ДНК, формируемых методом psi-конденсации, зависит от ее молекулярной массы и концентрации в широких диапазонах значений этих параметров [31]. В свою очередь, как показывает теоретический анализ [32], с увеличением размера частиц ХЖКД интенсивность КД-сигнала должна возрастать практически линейно, если их структура (в частности, шаг холестерической спирали) не изменяется. На рис. 4а представлены КД-спектры образцов ХЖКД, приготовленных при варьировании концентрации ДНК от 1.69 × 10^–5 до 1.52 × 10^–4 М. Видно, что увеличение содержания нуклеиновой кислоты в системе приводит к возрастанию амплитуды аномальной полосы КД (этот рост сопровождается батохромным смещением полосы: при наименьшей исследованной концентрации ДНК ее максимум наблюдается на длине волны λ ≈ 262 нм, а при наибольшей – на λ ≈ 269 нм). Представленные в наглядной графической форме на рис. 4б эти спектральные данные свидетельствуют, в частности, о том, что амплитуда аномальной полосы КД является именно линейной функцией содержания ДНК в системе. Поэтому с учетом сказанного выше можно полагать, что в исследованном концентрационном диапазоне, действительно, изменяется количество нуклеиновой кислоты в составе микрочастиц ХЖКД за счет изменения их размера (и, возможно, числа, см. ниже), но не структура самих микрочастиц.

Рис. 4.

(а) КД-спектры образцов ХЖКД с различным содержанием ДНК: 1 – 1.69 × 10^–5, 2 – 3.38 × 10^–5, 3 – 5.06 × 10^–5, 4 – 6.75 × 10^–5, 5 – 8.44 × 10^–5, 6 – 1.01 × 10^–4, 7 – 1.18 × 10^–4, 8 – 1.35 × 10^–4, 9 – 1.52 × 10^–4 М. (б) Зависимости амплитуды сигнала КД (1) и положения его пика (2) от концентрации ДНК. Стандартные отклонения при определении амплитуды сигнала, рассчитанные по трем независимым измерениям, не превышают 5%. (в) Зарегистрированные на длине волны λ = 270 нм кинетические кривые формирования аномальной полосы КД при разной концентрации ДНК: 1 – 1.27 × 10^–5, 2 – 2.53 × 10^–5, 3 – 5.06 × 10^–5, 4 – 1.01 × 10^–4, 5 – 1.52 × 10^–4, 6 – 2.03 × 10^–4 М.

От концентрации ДНК зависит и кинетика формирования ее ХЖКД. На рис. 4в приведены зависимости амплитуды аномального сигнала КД от времени, записанные на длине волны λ = 270 нм сразу после смешения растворов нуклеиновой кислоты различной концентрации и раствора ПЭГ. Кривые 1–4 хорошо описываются в рамках двухэкспоненциальной модели, в то время как кривые 5 и 6 имеют трехэкспоненциальный характер. Соответствующие значения рассчитанных по формуле (1) констант скорости k₁, k₂ и k₃ суммированы в табл. 1. Отметим, что величина k₁ изменяется по мере увеличения концентрации ДНК по экспоненциальному закону, а k₂ – по линейному. Исходя из полученных данных, а также из существующих представлений о процессе формирования ХЖКД ДНК [33, 34], мы полагаем, что с помощью спектроскопии КД удается наблюдать две его стадии: активный рост частиц за счет присоединения молекул ДНК к зародышу (с константой скорости k₁) и упорядочение/перестройку холестерических слоев в сформированных частицах (с константой k₂) [34]. Третья стадия, имеющая место только при весьма высоких концентрациях ДНК, представляет собой, по-видимому, агрегацию частиц дисперсии и может приводить к упомянутому выше одновременному изменению числа и размера микрочастиц нуклеиновой кислоты.

На рис. 5 в качестве примера сопоставлены зависимости нормированной интенсивности сигнала КД для ХЖКД с различным содержанием ДНК от концентрации НЧЗ (использовался золь II возрастом 6 мес), полученные при двух различных способах их введения в систему. Видно, что при обработке НЧЗ готовой жидкокристаллической дисперсии степень разрушения холестерической организации ее частиц практически не зависит от концентрации ДНК: кривые 1–4 на рис. 5а совпадают в пределах 15%. В то же время в случае предварительной инкубации раствора ДНК с НЧЗ их деструктивное действие на формируемую затем ХЖКД заметно ослабевает с ростом концентрации нуклеиновой кислоты в том же диапазоне (рис. 5б), хотя в целом, как следует из сопоставления рис. 5а и 5б, подавление НЧЗ аномального КД-сигнала ХЖКД гораздо эффективнее именно при их предварительном контакте с ДНК.

Рис. 5.

Зависимости интенсивности сигнала КД от концентрации НЧЗ золя II при обработке ими готовых ХЖКД (а) и при их предварительном контакте с растворами ДНК (б). Концентрация нуклеиновой кислоты в обоих случаях составляла: 1 – 3.38 × 10^–5, 2 – 6.75 × 10^–5, 3 – 1.01 × 10^–4, 4 – 1.35 × 10^–4 М. Все значения ΔA нормированы на абсолютные значения амплитуды КД-сигнала для соответствующих исходных ХЖКД, не содержащих НЧЗ. Стандартные отклонения, рассчитанные по трем независимым измерениям, не превышают 7%.

Согласно существующим представлениям, нарушение внутренней упаковки частиц ХЖКД ДНК, наблюдающееся при введении НЧЗ в готовую дисперсную систему, состоит в раздвижении и изменении угла закрутки холестерических слоев, формируемых молекулами ДНК [35]. В работе [36] для обозначения этого механизма был предложен термин “нематизация”. В случае же предварительной инкубации НЧЗ с ДНК происходит исключение отдельных молекул или их групп из процесса формирования ХЖКД при последующем добавлении ПЭГ. В работе [37] этот механизм был описан как предотвращение взаимного “узнавания” молекул ДНК. Очевидно, что в последнем случае увеличение соотношения [НЧЗ] : [ДНК] должно сопровождаться усилением деструктивного эффекта, как наглядно демонстрирует рис. 5б. Вместе с тем, инвариантность степени разрушения упорядоченной структуры частиц дисперсии относительно соотношения [НЧЗ] : [ДНК] при обработке готовой системы, показанная на рис. 5а, является весьма нетривиальной. Отметим здесь, что вкупе с непосредственным воздействием НЧЗ на упаковку ДНК в частицах ее ХЖКД при введении в эту систему золя золота также имеет место разбавление, а, следовательно, и уменьшение осмотического давления раствора ПЭГ. Вместе с тем известно, что при помощи НЧЗ можно стабилизировать структуру жидкокристаллических систем на основе ДНК [38]. В частности, эффект стабилизации внутренней организации в присутствии НЧЗ был ранее обнаружен и в случае разбавления ХЖКД ДНК [39]. Таким образом, действие НЧЗ на упорядоченную упаковку молекул ДНК в частицах ее ХЖКД представляется весьма многофакторным, и понимание многих его аспектов требует дальнейших исследований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе исследовано влияние времени предварительной выдержки (от 1 до 12 мес) ультрамалых НЧЗ, синтезированных по методу Даффа, на структурные аспекты их взаимодействия с частицами ХЖКД ДНК. Полученные результаты весьма убедительно свидетельствует о том, что “возраст” таких НЧЗ является существенным фактором, определяющим степень разрушения упорядоченной упаковки молекул ДНК в частицах ее ХЖКД. На основании полученных данных можно сделать следующие выводы.

1. При обработке готовой дисперсной системы различия в степени разрушения для НЧЗ разного “возраста” выражены довольно слабо. При этом для “выдержанных” НЧЗ эффект усиления степени разрушения ХЖКД в случае их предварительной инкубации с ДНК реализуется значительно сильнее. Вместе с тем, существенных различий в величине деструктивного эффекта для НЧЗ, выдержанных в течение 6 и 12 мес, в условиях проведенного эксперимента обнаружено не было.

2. Степень разрушения холестерической упаковки ДНК при обработке НЧЗ готовой дисперсной системы не зависит от концентрации нуклеиновой кислоты, в то время как в случае предварительной инкубации ДНК с НЧЗ эффект, напротив, сильно зависит от ее содержания в системе.

3. В части взаимодействия с ДНК свойства ультрамалых НЧЗ, полученных по методу Даффа, весьма существенно трансформируются в первые 6 мес после синтеза. Это может быть обусловлено как металлизацией НЧЗ вследствие совершенствования их кристаллической структуры, так и изменением химии их поверхности.