Кристаллография, 2019, T. 64, № 1, стр. 81-86

УПРАВЛЯЮЩИЕ СИЛЫ В ЭНЗИМАХ II ТИПА

С помощью обобщенных сил и токов в [1–23] описаны структура и функционирование ферментов, влияющих на линейные движения и вращения молекул ДНК. Для всех типов ферментов применимы следующие кинетические уравнения:

где n – директор, компоненты директора n = n_|| + + n_⊥ (n² = 1) приближенно удовлетворяют соотношениям $n_{ \bot }^{2}$ = $n_{x}^{2}$ + $n_{y}^{2}$ ≈ θ², $n_{{||}}^{2}$ ≈ $n_{z}^{2}$ ≈ 1 [24]; u – средняя скорость потребления топлива; g – механическая сила, приложенная к мотору; v – линейная скорость перемещения ДНК; F – линейная сила; N – скорость механического движения ротора; Δ – мера изменения свободной энергии в молекуле аденозинтрифосфата (АТФ). В уравнениях (1) введены также следующие обозначения: γ – вращательная вязкость для цепи ДНК внутри энзима, η – линейная подвижность цепи, ${\nu }{\kern 1pt} {\text{'}}$ – константа хиральности для конструкции белок–ДНК, коэффициенты η, λ и γ положительны, V – объем комплекса энзим–ДНК, k и w – векторные кинетические коэффициенты. Величины F/V и Δ/V отнесены к единице объема. Электрический диполь P_γ (поляризация γ-субъединицы молекулы АТФ) в плоскости биомембраны [24]: где ξ – вектор, задающий направление поляризации γ-субъединицы молекулы АТФ; μ – “пьезомодуль”, θ – малый угол отклонения n_⊥ директора n от нормали z к мембране (n_⊥ ≈ θ).

В первой части работы основное внимание было уделено ферментам рестрикции-модификации типа I и III [24], в которых каталитические реакции происходят главным образом с участием “топливных” молекул ATФ. Многочисленные эксперименты с ферментами II типа [25–30] указывают на большой вклад электростатических взаимодействий между белком энзима и фосфатными группами ДНК. Во всех процессах весьма важна роль ионов Mg²⁺, так как эти ионы, возможно, необходимы для специфического связывания ДНК и существенны для катализа, управляемого электростатическими взаимодействиями. Характеристики этих ферментов отражают следующие особенности: изгиб [28] и, возможно, закрутку (твист) основной цепи ДНК, т.е. ориентационную деформацию хиральной цепи ДНК; каталитические процессы [25–27], индуцирующие конформационные изменения в хиральном комплексе энзим–ДНК; трение между движущимся ферментом и ДНК, остающейся в покое [29, 30].

Эндонуклеазы рестрикции II типа действуют без использования источников энергии типа гидролиза молекул АТФ. После остановки энзима наблюдается явление дробления цепи ДНК. Можно ожидать, что поперечное электрическое поле E_⊥ (перпендикулярное оси цепи ДНК) и полярный вектор р$_{0}$ в энзимах типа II индуцируются, например, благодаря остаткам ароматических и гидрофобных аминокислот, которые имеются в активных местах энзимов и у оснований ДНК, а также благодаря упоминавшемуся присутствию ионов Mg²⁺ и Mn²⁺.

Здесь разница ∆ есть мера изменения свободной энергии комплекса энзим–ДНК в ходе каталитического процесса, управляемого электростатическими взаимодействиями. Этот процесс аналогичен ферментным реакциям, управляемым AТФ в ходе последовательных циклов в субъединицах β ионных насосов F₀F₁-ATФ. Таким образом, можно полагать, что величины ∆ и E_⊥ взаимосвязаны.

Полость энзима, в которой помещается ДНК, подвергается различным конформационным изменениям благодаря каталитическим реакциям, индуцирующим указанные деформации ДНК. Это явление позволяет вектору ξ, модуль которого пропорционален θ, возникать кооперативно, и такие отклонения закручиваются благодаря хиральным свойствам комплекса белок–ДНК. Взаимодействие поляризации электрического диполя P_γ с поперечным полем E_⊥ приводит к движению так называемого кинка [31] вдоль оси z, если нет каких-либо препятствий. Кинк (перегиб) имеет определенную ширину h в пространственном распределении азимутального угла отклонения поляризации μξ – угла поворота φ(z, t) вектора μξ в плоскости xy. Эта закрутка, показанная на рис. 1, описывается уравнением [31]:

Движение кинка происходит в бесконечной цепочке полярных векторов μξ с постоянной скоростью При этом линейном движении энзим должен производить отрицательную механическую работу $\text{v}$F_|| = ${{\text{v}}_{z}}$F_z < 0. Из уравнений (1) следует, как показано в [24], что где a – скалярный коэффициент, ${\nu }{\kern 1pt} {\text{'}}$ и ${\nu }{\kern 1pt} {\text{''}}$ – хиральные кинетические коэффициенты. Отрицательная механическая работа производится при этом линейном движении, если Таким образом, энзим-мотор генерирует линейное движение вдоль цепи ДНК, если векторы kΔ и F имеют противоположные направления, а сила F_z достаточно мала. Скорость ${{\text{v}}_{z}}$ = 0, когда, согласно (5), эта сила имеет критическое значение Скорость каталитического процесса, согласно уравнениям (5), приблизительно равна т.е. КПД мотора Ξ равен

Экспериментально наблюдаемая линейная скорость составляет величину ${{\text{v}}_{z}}$ ~ 10⁷ пар оснований в секунду [32]. Так как типичный шаг в геликоиде ДНК порядка 10 пар оснований или 3.5 нм, здесь предполагается, что ширина кинка h того же порядка, т.е. 3.5 нм, то после подстановки значений |μ| ~ 10^–3 Кл м$^{{ - 2}}$ и γ ~ 10^–3 Па с, которые типичны для сегнетоэлектрических жидких кристаллов, а также значений θ ~ 0.1 рад и |E_⊥| ~ 10⁷ В/м, находим, что скорость энзима-мотора с наибольшим КПД (формула (9)) равна

Эта оценка линейной скорости близка к экспериментально наблюдаемой по порядку величины [24].

При согласовании скоростей ${{\Omega }_{z}}$ и ${{\text{v}}_{z}}$, например, при $\Omega \approx 2{\pi }{{h}^{{ - 1}}}{{\text{v}}_{z}}$, как видно из (5), получаем

Из (10), (11) следует, что энергия ∆, активирующая каталитические реакции, конформационные изменения и механические движения комплекса энзим–ДНК, прямо пропорциональна умеренному (по напряженности) поперечному электрическому полю, которое действует в полости комплекса, когда слой воды разделяет белок и ДНК (в отсутствие молекул ATФ). В симметричном энзиме II типа (без препятствий на его концах) возможен отрицательный супервиток (обратный поворот директора) в цепи ДНК позади R-единицы.

Согласно сделанным оценкам критическая сила ${{F}_{{cr}}}\sim - a{\theta }\Delta {/\eta }\sim {{10}^{{ - 4}}}$ пН может быть очень малой. Если энзим встречает некоторое препятствие, создающее силу F, большую, чем ${{F}_{{cr}}}$, то комплекс энзим–ДНК останавливается.

При F = ${{F}_{{cr}}}$ линейная скорость ${{\text{v}}_{z}}$ обращается в нуль, а угловая скорость, согласно (1), оказывается конечной:

Неравенство θ ≠ 0 при ${{\text{v}}_{z}}$ = 0 означает отсутствие равновесия в комплексе. При приближении системы к полному равновесию величины θ → 0, ${{\Omega }_{z}}$ → 0, E → 0 и ∆ → 0. Каталитические реакции, протекающие в ходе этого процесса, являются относительно медленными в энзимах I типа. Таким образом, ${{\Omega }_{z}} \ne 0$ в момент критической остановки, и момент сил [gn] ≠ 0 (отнесенный к единице объема), индуцирующий ориентационную деформацию ДНК, при выполнении равенства (12) не равен нулю при θ ≠ 0: Во время релаксации угла θ приложение момента ${{{\mathbf{M}}}_{{x,y}}}$ создает механические напряжения и деформации в цепи ДНК, которые могут ее разрезать. При F ≥ ${{F}_{{cr}}}$, когда мотор останавливается, система имеет достаточное время для приближения к равновесию, и величины θ → 0, ${{\Omega }_{z}}$ → 0 в этом случае. Затем процесс зарождения и движения кинка стартует снова под действием вновь возникающего поперечного поля E_⊥ до тех пор, пока энзим не встретит специфическое “место связывания” на ДНК [24] для распознавания ее оснований и не возникнет большая тормозящая сила.

Для дробления ДНК необходима гораздо большая сила по сравнению с ${{F}_{{cr}}}$. Такое большое значение силы может быть локально связано с продольным электрическим полем (вплоть до значений порядка 10⁹ В/м), а соответствующее взаимодействие может существовать между заряженными остатками и основаниями ДНК, которые находятся в окружении с очень низким значением диэлектрической постоянной. Такое окружение возникает, когда молекулы растворителя и ионы выталкиваются с поверхности раздела белок–ДНК во время процесса распознавания, сопровождаемого значительной кооперативной перестройкой поверхности раздела и взаимно индуцируемой подгонкой энзима и ДНК [20]. При ${{F}_{z}} \gg {{F}_{{cr}}}$ момент сил (13) равен

Работа соответствующего момента сил $\theta {{{\mathbf{M}}}_{{x,y}}}$ (13) по повороту цепи на угол φ ~ 1 рад на несколько порядков меньше, чем энергия связи на молекулу порядка 10^–19 Дж. Работа момента сил (14) во время θ-релаксации при значении большой силы F_z ~ 100 пН [22] создает энергетические условия для разрезания ДНК (в энзимах RM II [16, 17]). В этом случае резкое изменение режима движения ДНК происходит благодаря возникновению взаимной химической комплементарности поверхностей белка и ДНК [20]. Когда молекулы воды и ионы удаляются с поверхности раздела белок–ДНК, в молекулярном моторе начинают действовать достаточно большие разрезающие силы, стремящиеся повернуть директор n вокруг поперечных осей x и y, т.е. они препятствуют процессу релаксации и стремятся отклонить директор n от оси z.

Для разрезания ДНК в полости более инертных энзимов I и III типов требуется значительно бóльшая сила F_z (в 10–100 раз больше) по сравнению с таковой в энзиме типа II. Это объясняет, почему эффективное разрезание ДНК энзимами типа I требует такого мощного фактора, как столкновение двух и большего числа комплексов транслокации, связанных с одной и той же молекулой ДНК: как правило, энзимы I типа расщепляют линейную ДНК примерно на половине расстояния между двумя последовательными сайтами-мишенями (иногда на расстоянии в несколько тысяч оснований между ними) [17].

ТРАНСЛОКАЦИЯ ДНК В ХЕЛИКАЗАХ

Белки хеликазы образуют гексамерные кольца с центральными каналами, имеющими определенную полярность, и способны окружать и разматывать дуплекс ДНК. Они имеют сходные черты с известными F₀F₁-ATФ-синтазами [1, 33–39], где энзиматические реакции протекают в субъединицах, подвергающихся циклическим конформационным изменениям. По каналам этих гексамеров может проходить лишь одна нить ДНК, поскольку канал диаметром ∼13 Å заметно меньше диаметра дуплекса ДНК (∼20 Å) [3]. Проталкивание нити ДНК через канал гексамера подобно транслокации ДНК энзимами рестрикции-модификации с помощью движущей силы kΔ, гдe k вычисляется согласно уравнению [24]:

Размерность коэффициента а в феноменологическом выражении ${{\text{v}}_{z}} \approx a{\theta }\Delta $ для эффективно работающего мотора есть [1/(сила⋅время)]. Примем, что эта микроскопическая сила, действующая на нуклеотид, есть f ∼ U/l. Для грубой оценки а можно представить как обратное произведение величины, имеющей размерность силы f, на характерное время протекания соответствующей каталитической реакции $\tau \sim 1{\text{/}}{{u}_{0}}$, где ${{u}_{0}}$ – скорость реакции, т.е. $a\sim {{u}_{0}}{\text{/}}f$, что соответствует вероятностному характеру процессов [24]. Величина ${{u}_{0}}$ соразмерна с экспериментально наблюдаемыми скоростями каталитических реакций u, фигурирующими в кинетических уравнениях [21, 22]. Эксперименты дают значения ${{u}_{0}}\sim u\sim {{10}^{{ - 3}}}{\kern 1pt} - {\kern 1pt} 1$ с^–1, т.е. τ ~ 1–10³ с для разных энзимов, в которых такие реакции идут с разной скоростью. По-видимому, коэффициенты  $f\sim {{10}^{{ - 17}}}{\kern 1pt} - {\kern 1pt} {{10}^{{ - 16}}}$ Н и величины θ и Δ у рассматриваемых ферментов не различаются на несколько порядков, поэтому значение а в основном зависит от τ. Значения а были получены в [21] с помощью экспериментальных данных по измерению скорости транслокации ДНК для разных энзимов, причем для RM I (${{\text{v}}_{z}}$ ∼ 10²–10^–3 нм с^–1 [2]) этот коэффициент в 1000 раз меньше, чем для RM II (${{\text{v}}_{z}}\sim {{10}^{6}}$ нм·с^–1 [20]), поскольку соответственно были меньше скорость реакций u и скорость транслокации ДНК. В хеликазах скорость транслокации (порядка скорости репликации ДНК) составляет величину ∼10² нм с^–1 при $u\sim {{10}^{{ - 3}}}$ с^–1 [40]. Согласно (7) критическая останавливающая сила у этих ферментов ${{F}_{{cr}}}\sim {{10}^{{ - 18}}}$ Н при $\eta \sim {{10}^{{11}}}$ м$^{2}$ Дж^–1 с^–1, $\Delta \sim 10{{k}_{{\text{B}}}}T\sim {{10}^{{ - 19}}}$ Дж и $\theta \sim {{10}^{{ - 1}}}$. У ферментов RM I и RM II сила ${{F}_{{cr}}}\sim {{10}^{{ - 17}}}{\kern 1pt} - {\kern 1pt} {{10}^{{ - 16}}}$ Н по оценке [21].

Закручивание одной нити ДНК в гексамерной хеликазе обусловлено специфической винтовой лестницей, которую образуют в канале хеликазы так называемые петли (рис. 2), имеющиеся у каждой из шести субъединиц гексамера, обладающего осью симметрии ${{C}_{6}}$. Кристалл хеликазы E1 содержит два гексамера из шести субъединиц каждый (рис. 2a) [3]. Эти петли содержат аминокислотные остатки (например, лизин в хеликазе бактериофага Т7 [3]), связывающие нуклеотиды ДНК с внутренней поверхностью канала. Нуклеотиды контактируют с субъединицами гексамера, и нить ДНК вынуждена образовать аналогичную спираль – правосторонний геликоид в вирусном инициаторе – белке Е1 (рис. 2б). Когда цепь ДНК изгибается и смещается, ее нуклеотиды сближаются с внутренней поверхностью гексамера и получают энергию порядка энергии связывания в области петель, т.е. несколько ккал на моль или около 10^–20 Дж. Рисунок 2 сделан на основе данных [3, 40]. Таким образом, механизм закрутки одной нити ДНК в хеликазах напоминает кручение ДНК в энзимах типа I RM [41, 42]¹¹.

Хеликазы сходны с F₀F₁-ATP-синтазами, так как у тех и других существуют три характерных сайта, которые отличаются разной степенью вовлеченности молекул АТФ в координацию и гидролиз [3, 40]. В таких сайтах наблюдаются три конформации: слабо занятая (типа аденозиндифосфата – AДФ-типа), плотно занятая (АТФ-типа) и пустая. Сайты с молекулами АТФ, АДФ и без таковых содержат указанные формы петель ДНК-связывания. Они имеют кристаллографическую ось второго порядка [40]. У разных гексамеров может быть разное количество таких состояний, например у комплекса Е1–ДНК в первом гексамере конформации АТФ-типа имеются на трех поверхностях раздела, а во втором – только на двух. Такие петли у субъединиц АТФ-типа находятся на вершине гексамера, петли у субъединиц AДФ-типа занимают промежуточные позиции по высоте гексамера, петли у пустых субъединиц занимают дно гексамера [40].

В гексамере у Е1–ДНК, по модели [40], петли ДНК-связывания каждой субъединицы коллективно формируют спиральную лестницу. Каждая петля ДНК-связывания перемещается вместе с единственным нуклеотидом вниз от вершины благодаря гидролизу молекул АТФ и высвобождению молекул AДФ, причем гидролиз осуществляется ближе к вершине гексамера, а высвобождение AДФ – ближе к его дну. Нуклеотиды ДНК, осуществляющие линейную транслокацию в этом гексамере, присоединяются к данной субъединице по одному и совершают движение по винтовой лестнице, состоящей из петель ДНК-связывания (рис. 2). Вблизи дна такая петля освобождает присоединенный фосфат, и его движение по каналу гексамера заканчивается. При циклическом движении каждая субъединица гидролизует одну АТФ-молекулу, освобождает одну AДФ-молекулу и перемещает по каналу один нуклеотид. Таким образом, полный цикл включает в себя транслокацию шести нуклеотидов, обусловленную гидролизом шести молекул АТФ и высвобождением шести молекул AДФ.

Некоторые основания ДНК обладают дипольными моментами порядка 10 Д. Это содействует изгибам и скручиванию оснований, особенно при контакте с донорами или акцепторами электрических зарядов, располагающимися выше или ниже плоскости оснований [43]. Вообще, квадруполь-квадрупольные или ван-дер-ваальсовы силы могут вносить существенный вклад в рассматриваемые процессы благодаря заметным величинам квадрупольных моментов ДНК и оболочек энзимов [24]. Заметим, что это имеет место в случае жидких кристаллов, молекулы которых имеют размеры, сравнимые с размерами фрагментов нуклеотидов.

Для предотвращения захвата ДНК петлей энзима необходимы микроскопические силы f, действующие на нуклеотид, которые больше, чем величина U/l ~ æ/l ∼ 10^–11 Н (cp. с [24], U – полная энергия Ван-дер-Ваальса, æ ∼ 10^–20 Дж – энергия межмолекулярного взаимодействия), где размер нуклеотида l ∼ 1 нм. Во время элементарного акта движения ДНК между субъединицами гексамера и поворота нуклеотида от одной петли к другой возникает момент сил порядка М ∼ fl ∼ 10^–20 Н·м, а работа этой силы есть A ∼ fl ∼ 10^–20 Дж. Такие микроскопические акты совершаются импульсами за время более короткое, чем время, необходимое для конформационных изменений сайтов, где происходят сдвиги нуклеотидов и молекул ATФ и AДФ [42].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Приведенные оценки являются качественными. Для согласованной работы рассмотренных моторов необходим тонкий баланс многих параметров энзима. Отметим, что механизмы транслокации ДНК энзимами RM I и хеликазами одинаковы. Они имеют сравнимые характеристики: ДНК в полостях этих энзимов обладают высокой вязкостью, низкой подвижностью и малыми хиральными кинетическими коэффициентами по сравнению с энзимами типа II RM. Проведены вычисления для движения комплекса энзим II типа–ДНК вдоль цепи ДНК в рамках двух механистических моделей: модели хирального кинка, двигающегося под действием поперечного электрического поля, и модельной системы кинетических уравнений. Энергия, вырабатываемая в ходе каталитических реакций, используется энзимами для совершения изгибания и закрутки цепей ДНК, углового и линейного движения энзимов RM II по цепи ДНК. Направления движения комплекса белок RM II–ДНК случайны, и это явление напоминает линейную диффузию. Когда молекулы воды и ионы выталкиваются с поверхности раздела белок–ДНК, в моторе появляются достаточно большие продольные силы, стремящиеся повернуть деформированный участок цепи ДНК вокруг ее поперечной оси, что приводит к ее разрезанию.

Сходство поведения энзимов RM I и хеликаз имеет, по-видимому, простой физический смысл: относительно массивные фрагменты ДНК (нуклеотиды) занимают энергетически выгодные позиции по отношению к aминокислотным остаткам и другим структурным элементам энзимов после гидролиза ATФ. Благодаря упомянутым взаимодействиям, активированным энзиматическими реакциями, эти фрагменты смещаются и переориентируются вдоль оси спиральной лестницы, образованной петлями энзимов. Все эти события связаны и происходят без дробления ДНК.

Рассмотрение макроскопических моделей этих моторов весьма полезно, хотя их микроскопическая природа очевидна, поскольку такие модели позволяют отразить некоторые основные черты подобных “машин”.

Очевидно, движения в полостях энзимов являются стохастическими. Конформационные изменения характерных сайтов являются своего рода триггерами для быстрых прерывистых движений и вращений нуклеотидов ДНК, обусловленных полярными силами.

Авторы выражают благодарность В. Хаазе и E. Демихову за совместную плодотворную работу, интересные дискуссии и полезную информацию по данной теме.

Работа поддержана Министерством науки и высшего образования в рамках Государственного задания ФНИЦ “Кристаллография и фотоника” РАН в части “теоретическое моделирование структуры и свойств ферментов в биологических материалах”, Министерством Науки и Высшего образования в рамках Государственного задания № 0139-2015-0022 (№ гос. задания АААА-А16-116030110081-2) в части “теория обобщенных сил и токов в движущейся ДНК – (E.С. Пикина).